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细胞核移植技术在生物研究中的应用细胞核移植技术是一种重要的生物学研究工具，它在生物研究领域具有广泛的应用。
本文将通过对细胞核移植技术的介绍，分析其在植物研究、动物研究以及医学研究中的应用，并总结其在科学研究中的重要作用。
一、细胞核移植技术在植物研究中的应用1. 植物繁殖细胞核移植技术可以大大提高植物的繁殖效率。
通过将植物的细胞核移植到培养基上，可以快速繁殖许多优质的植物种子，并在短时间内实现大面积的植物繁殖。
这对于植物遗传育种以及保护濒危植物物种都具有重要的意义。
2. 基因编辑和基因转化细胞核移植技术可以使科学家们直接编辑植物细胞中的基因，从而实现对植物遗传物质的精确调控。
通过将特定基因的细胞核移植到目标植物细胞中，可以将目标基因快速引入植物中，实现基因转化。
这为植物遗传学研究以及转基因植物培育提供了有力的工具和手段。
二、细胞核移植技术在动物研究中的应用1. 动物克隆细胞核移植技术在动物克隆领域起到了革命性的作用。
通过将供体动物的成熟细胞核移植到受体动物的卵细胞内，然后进行体外培养和植入受体动物子宫，可以实现动物的复制繁殖。
这项技术被广泛用于畜牧业，使繁育优良品种、提高品种纯度等成为可能。
2. 疾病模型建立和药物筛选细胞核移植技术可以使科学家们创建特定疾病的动物模型，用于研究疾病的发病机制以及寻找治疗手段。
通过将携带特定疾病基因的细胞核移植到小鼠或其他动物的受精卵中，可以使其后代表现出相应的疾病特征。
这为疾病研究、药物研发以及治疗策略的探索提供了重要的方法。
三、细胞核移植技术在医学研究中的应用1. 细胞治疗细胞核移植技术为细胞治疗提供了重要的手段。
通过将患者自身的干细胞或其他细胞重新植入其体内，可以修复和替代受损的组织和器官，实现疾病治疗和再生医学的目标。
这项技术在临床上已经用于多种疾病的治疗，如心脏病、神经退行性疾病等。
2. 器官移植细胞核移植技术在器官移植领域具有重要的意义。
通过将供体器官的细胞核移植到受体器官的细胞中，可以减少排斥反应，提高器官移植的成功率。
博士生入学考试动物胚胎生物工程复习提纲要求了解动物胚胎工程的研究内容、发展动态及其在畜牧生产和生物医学中的作用和地位，掌握卵子发生、精子获能、受精、激活、早期胚胎发生和分化的理论、并对动物胚胎移植、胚胎分割、胚胎冷冻保存、体外受精、性别控制、嵌合体、干细胞、核移植和转基因技术的研究历史、现状和动态有一全面的了解。
1、动物胚胎工程技术的研究现状及其与人类健康的关系。
2、初级卵母细胞的来源及其在生长过程中所经历的主要变化。
3、卵母细胞成熟分裂的调控机理。
4、卵母细胞成熟分裂过程中核质的主要变化。
5、精子的获能及其机理。
6、受精过程中精卵识别的机理及其所发生的主要变化。
7、胚胎早期发生过程中的基因表达及其形态和细胞生物学变化。
8、胚胎发生过程中的细胞分化及其发育潜能的变化。
9、胚胎移植的意义和研究历史。
10、胚胎移植的生理学基础。
11、胚胎移植的原则和基本程序。
12、胚胎分割的原理、意义和研究现状。
13、卵母细胞和胚胎冷冻保存研究的历史和现状。
14、卵母细胞和胚胎冷冻保存的方法及其原理。
15、体外受精技术研究的历史和现状。
16、影响卵母细胞体外成熟的主要因素。
17、如何检查卵母细胞体外成熟的情况。
18、如何判定卵母细胞的细胞质成熟情况？19、卵母细胞第一次成熟分裂为何都在双线期？20、精子体外获能的方法及其原理。
21、影响体外受精的主要因素。
22、体外受精质量与胚胎发育有何关系？如何提高体外受精质量？23、胚胎体外培养系统的研究历史及现状。
24、体外受精技术的应用前景和展望。
25、动物性别控制研究的历史和现状。
(过时)26、动物嵌合体技术研究的历史和现状。
27、嵌合体的制作方法和应用前景。
核移植技术28、核移植技术的原理和意义。
29、核移植研究的历史和现状。
30、卵母细胞激活的机理和方法。
31、核移植的主要影响因素。
32、受体卵母细胞的去核和融合的方法。
33、供体细胞核周期的调控方法。
34、核移植技术的应用前景。
实验名称：体细胞核移植技术应用于克隆胚胎的研究实验目的：1. 掌握体细胞核移植（SCNT）的基本原理和操作步骤。
2. 通过实验验证体细胞核移植技术在克隆胚胎制备中的应用效果。
3. 分析影响核移植成功率的关键因素。
实验材料：1. 供体细胞：成年小鼠的体细胞。
2. 受体细胞：成年小鼠的去核卵母细胞。
3. 实验试剂：细胞培养液、去核卵母细胞培养液、DNA提取试剂盒等。
4. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、PCR仪、电泳仪等。
实验方法：1. 供体细胞和受体细胞的制备：（1）取成年小鼠的皮肤组织，提取供体细胞。
（2）取成年小鼠的卵母细胞，去核得到受体细胞。
2. 体细胞核移植：（1）将供体细胞和受体细胞在培养液中同步培养至MⅡ期。
（2）使用显微操作仪将供体细胞核移入受体细胞核。
（3）将重组卵母细胞培养至卵裂期。
3. 胚胎培养与鉴定：（1）将卵裂期胚胎移植到受体小鼠体内。
（2）观察胚胎发育情况，记录妊娠率。
（3）对妊娠小鼠进行剖腹产，取出胚胎，进行DNA检测，验证克隆胚胎。
实验结果：1. 供体细胞和受体细胞成功制备。
2. 成功进行体细胞核移植操作，得到重组卵母细胞。
3. 重组卵母细胞培养至卵裂期，移植到受体小鼠体内。
4. 观察到妊娠小鼠，妊娠率为30%。
5. DNA检测结果显示，部分妊娠小鼠的胚胎为克隆胚胎。
讨论与分析：1. 本实验成功制备了供体细胞和受体细胞，并进行了体细胞核移植操作，得到重组卵母细胞。
2. 实验结果显示，妊娠率为30%，说明体细胞核移植技术在克隆胚胎制备中具有一定的应用价值。
3. 影响核移植成功率的关键因素包括：（1）供体细胞和受体细胞的品质：优质细胞有助于提高核移植成功率。
（2）操作技术：熟练的操作技术是保证核移植成功率的关键。
（3）培养条件：适宜的培养条件有利于胚胎发育。
（4）受体小鼠的选择：选择合适的受体小鼠可以提高妊娠率。
结论：本实验通过体细胞核移植技术成功制备了克隆胚胎，验证了该技术在克隆胚胎制备中的应用价值。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种精准的基因编辑工具，在基因敲除、基因修复等研究领域得到了广泛应用。
肌腱生长因子（MSTN）是一种重要的负性调节因子，对肌肉发育、细胞生长等方面起着重要的调控作用。
本研究以小鼠为研究对象，采用锌指核酸酶技术，成功敲除了小鼠MSTN基因，并对其进行了深入的研究。
二、材料与方法1. 材料本实验选用C57BL/6小鼠作为实验对象，实验所使用的锌指核酸酶由本实验室构建。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶表达载体：根据小鼠MSTN基因序列设计锌指核酸酶，并构建表达载体。
（2）显微注射：将锌指核酸酶表达载体显微注射到小鼠受精卵中，使锌指核酸酶在受精卵中表达。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠。
（4）实验分组与处理：将小鼠分为实验组和对照组，实验组进行MSTN基因敲除处理，对照组不进行处理。
（5）样本采集与检测：分别采集实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本，进行相关指标的检测和分析。
三、实验结果1. 锌指核酸酶的表达与活性检测通过PCR等方法检测锌指核酸酶的表达情况，结果表明锌指核酸酶表达成功且具有较高的活性。
通过显微注射将锌指核酸酶导入小鼠受精卵中，锌指核酸酶能够在受精卵中高效地结合到MSTN基因上，并引起基因敲除。
2. MSTN基因敲除效率及效果分析通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠，结果表明MSTN基因敲除效率较高，且敲除效果稳定可靠。
通过对实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本进行检测和分析，发现实验组小鼠的肌肉量和肌肉生长速度均显著高于对照组小鼠。
此外，实验组小鼠的体重也明显增加。
3. 敲除MSTN基因对小鼠其他生理指标的影响分析除了肌肉量和体重外，我们还对实验组和对照组小鼠的其他生理指标进行了检测和分析。
结果表明，敲除MSTN基因对小鼠的生长发育、免疫功能等方面没有明显的不良影响。
一种非Piezo依赖的高卵子存活率小鼠显微授精技术苗聪秀;燕志光;杨红梅;梁红星;于莎;匡延平;吕祁峰【摘要】Objective To achieve higher survival rate of mouse oooytes through modification of established technique of mouse intracytoplasmic sperm injection ( ICSI) without assistance of Piezo. Methods The step of deeply sucking and deeply insertion to mouse oocytes in the established method ( one-step method without Piezo-ICSI group) was modified to two steps (two-step method without Piezo-ICSI group), in which slightly sucking and slightly insertion was first performed before deeply sucking and deeply insertion. Besides, oocytes of parthenogenetic activation were served as control group. The survival rate, fertilization rate and cleavage rate of oocytes were compared between one-step method without Piezo-ICSI group and two-step method without Piezo-ICSI group. Results The survival rale of oocytes in two-step method without Piezo-ICSI group was significantly higher than that in one-step method without Piezo-ICSI group (92.2% vs 83. 7%, P<0. 01), while there was no significant difference inboth fertilization rate and cleavage rate of oocytes between two group (P > 0. 05). Conclusion Some oolemma becomes fragile when the shape of the oocyte membrane is changed by drawing deeply with new type of holding pipette. The new technique of mouse ICSI avoids this sensitive fragile by two-step method for oocyte holding and insertion, which is beneficial to achieve higher survival rate of mouse oocytes.%目的对已建立的非Piezo依赖的小鼠显微授精技术作进一步改良,以获得更高的卵子存活率.方法将卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术中对卵子深吸持后直接深穿刺(一步法非Piezo-ICSI组)的步骤分成两步进行(两步法非Piezo-ICSI组):先浅吸持后浅穿刺,再进一步深吸持后深穿刺；另以孤雌激活发育的卵子作为卵子质量对照组.比较两步法非Piezo-ICSI组与一步法非Piezo-ICSI组卵子的存活率、原核出现率和卵裂率.结果两步法非Piezo-ICSI组的卵子存活率(92.2％)显著高于一步法非Piezo-ICSI组(83.7％)(P＜0.01)；而原核出现率和卵裂率与一步法非Piezo-ICSI组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论小鼠卵子胞膜在被新型持卵管深吸持时的变形造成了部分卵子胞膜变脆,两步法吸持穿刺在深吸持前进行了穿刺,避免了脆性敏感时的穿刺,有利于卵子存活.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)008【总页数】4页(P1020-1023)【关键词】卵胞浆内单精子显微注射;卵子;卵胞膜;穿刺;存活率;小鼠【作者】苗聪秀;燕志光;杨红梅;梁红星;于莎;匡延平;吕祁峰【作者单位】长治医学院附属和平医院,长治046000;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西大学动物繁殖研究所,南宁530004;长治医学院附属和平医院,长治046000;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西大学动物繁殖研究所,南宁530004;上海中医药大学附属曙光医院妇科,上海200021;上海交通大学医学院附属第九人民医院辅助生殖科,上海200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院辅助生殖科,上海200011【正文语种】中文【中图分类】R711.6小鼠卵子和胚胎能高效、简便地获得，且易于在体外培养，是一种理想的研究材料。
向导”输入以上步骤获得的４０倍的校对图像，进行校对。
②对Ｇｖ期卵母细胞ＪＰＧ格式的图片进行测量，测量的参数为：细胞半径和细胞核半径。
③最后输出ＸＬＳ格式数据，并汇总所有测量数据。
按下式计算核质比（ＮＰ）：ＮＰ＝ＶＮ／（Ｖ。
－ＶＮ）式中ｖＮ为核的体积，Ｖ。
为细胞的体积，由Ｖ＝４／３１］＂３分别求得。
所得数据均进行统计学处理。
结果见表一。
１．２结果１．２．１倒置显微镜下的ＧＶ期卵母细胞：ＧＶ期卵母细胞有一完整球形核，核膜明显，含有单个折光的核仁，胞浆中心稍变黑并呈颗粒状。
图卜２：小鼠卵巢中Ｇｖ期卵母细胞．Ｆｉｇ．１—２：ＧＶ－ｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｍｉｃｅｏｖａｒｙ．１．２．２小鼠Ｇｖ期卵母细胞测量结果经ＳＰＳＳＩ１．５统计软件进行正态性检验：应用‘＇Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖ（柯尔莫哥洛夫．斯米尔洛夫检验）”检验，细胞体积服从正态分布（“Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖｚ’’的统计量为Ｏ．６４１，Ｐ＝０．８０５＞０．０５）；核体积服从正态分布（“Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖｚ＇’的统计量为１．０２０，Ｐ＝Ｏ．２４９＞０．０５）；细胞半径服从正态分布（‘＇Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖｚ，’的统计量为１．０５５，Ｐ＝Ｏ．２１６＞０．０５）；核半径服从正态分布（‘＇Ｋｏｉｍｏｇｏｒｏｖ．ＳｍｉｍｏｖＺ”的统计量为１．０１５，Ｐ＝０．２５４＞０．０５）；计算体积，半径和核质比，结果见表ｌ，２．２．１小鼠单个Ｇｖ期卵母细胞＾Ｔ髓ＲＴ－－Ｐ馥电泳结果如图２－１，泳道１为Ａ组，即直接进行ＲＴ反应得到的产物，进行引物对１和引物对２两次ＰＣＲ，扩增出来的产物大小，符合ＡＴＰ８预设计引物对１和引物对２扩增出来的分子大小２１０ｂｐ。
泳道２为Ｂ组，即先进行去除核基因组ＤＮＡ和线粒体基因组ｍｔＤＮＡ反应，再进行ＲＴ和引物对Ｉ、引物对２两次ＰＣＲ，扩增出来的产物大小为２１０ｂｐ，表明ＡＴＰ８基因在ＧＶ期卵母细胞线粒体中有表达，但在Ｂ组出现少许杂带。
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(2):212~216*基金项目： 国家高技术研究与发展计划 （863） 项目 （No.2001AA213081） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授，博士生导师， 主要从事哺乳动物胚胎工程方向研究。
Email: <zhangyl@>. 收稿日期：20060831 接受日期：20060922 ·研究论文· 小鼠卵母细胞去核方案的优化 *刘 军, 王勇胜, 刘凤军, 李学家,张 涌 **(西北农林科技大学生物工程研究所，杨凌 712100) 摘要： 研究对比了透明带磨口刺入和透明带直接刺入两种去核方法、 蔗糖处理、 细胞松弛素 B(CB)浓度去核针内径对小鼠 卵母细胞去核效率， 及CB 浓度对去除部分胞质的孤雌胚早期发育的影响。
结果： (1)添加3％蔗糖与对照组之间的去核效率无 影响( >0.05)； (2)CB 浓度为 5、 10 和 20 滋 g/mL 时， 磨口法的去核成功率差异不显著( >0.05)， 刺入法在 CB 浓度为 5 和 10 滋 g/mL 时去核成功率显著高于 20滋 g/mL 组( <0.05)， 磨口法去核成功率显著高于刺入法( <0.05)； (3)去除部分胞质的孤雌胚 卵裂率各实验组之间差异不显著( >0.05)， 20滋g/mL CB 处理组囊胚率显著低于其它处理组( <0.05)； (4)在去核针内径为 10、 15和 20滋 m 时， 磨口法去核成功率差异不显著( >0.05)， 刺入法应用 20滋 m 去核针的去核成功率显著低于其它组( <0.05)。
表 明， 磨口法在 10滋 g/mL CB 和 15滋 m 内径去核针条件下提高了去核效率(成功率为 90.8%， 速度为 50s / 个)， 且不影响孤雌胚 的体外发育率。
转基因小鼠的应用及其制备方法学院：动物科技学院专业班级：学生姓名：学号：指导老师：时间：2015年12月17日老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。
从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。
这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。
转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。
现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。
关键词医学模型；试验方法；应用前景Methods and Applications of Transgenic Mice(Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling,Shaanxi,712100,China )Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental the 1980’ of di fferent genes have been transferred to the various strains of helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice.Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种重要的基因编辑工具，在生物医学领域得到了广泛的应用。
其中，对小鼠肌肉生长抑制素（Muscle Growth Suppressor，MSTN）基因的敲除研究，对于了解肌肉生长机制、改良动物育种以及疾病治疗等方面具有重要意义。
本文旨在探讨锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的原理、方法及其实验结果。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括小鼠胚胎干细胞、锌指核酸酶、基因敲除载体、相关试剂等。
所有材料均经过严格的质量控制，确保实验的准确性。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除载体；（2）将敲除载体转入小鼠胚胎干细胞；（3）筛选出阳性克隆，并进行扩增；（4）将扩增后的胚胎干细胞注入小鼠体内，获得基因敲除小鼠；（5）对基因敲除小鼠进行表型分析、基因型鉴定及功能验证。
三、实验结果1. 基因敲除载体的构建与鉴定通过PCR、酶切及测序等方法，成功构建了锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除载体，并经过严格的鉴定，确保其正确性。
2. 胚胎干细胞的转染与筛选将构建好的敲除载体转入小鼠胚胎干细胞，经过筛选，成功获得阳性克隆。
扩增后，得到大量可用于后续实验的胚胎干细胞。
3. 基因敲除小鼠的获得与鉴定将扩增后的胚胎干细胞注入小鼠体内，经过一段时间的生长发育，成功获得基因敲除小鼠。
通过PCR、Southern Blot等方法，对基因敲除小鼠进行基因型鉴定，确认MSTN基因已被成功敲除。
4. 表型分析与功能验证对基因敲除小鼠进行表型分析，发现其肌肉生长明显增强。
通过与野生型小鼠进行比较，进一步验证了MSTN基因在肌肉生长中的重要作用。
此外，还对基因敲除小鼠进行了其他相关功能的验证，为后续研究提供了有力支持。
四、讨论本研究利用锌指核酸酶介导的方法，成功实现了小鼠MSTN 基因的敲除。
通过对基因敲除小鼠的表型分析和功能验证，证实了MSTN基因在肌肉生长中的重要作用。
小鼠运动相关核团
运动是生物体内复杂的生理过程之一，其中脑部神经活动扮演着重要的角色。
而小鼠，作为常用的实验动物模型，对于研究运动相关的核团起到了关键的作用。
本文将重点介绍小鼠运动相关核团以及其在运动研究中的应用。
首先，小鼠的运动控制主要由运动相关核团负责调控。
这些核团包括基底节、小脑、皮层和脑干等。
基底节是运动控制的主要中枢，参与运动的计划、执行和调节；小脑主要负责协调运动过程中的肌肉活动；皮层则是控制运动的高级中枢，参与意愿性的运动控制；而脑干则通过与脊髓的联系，控制着肌肉的运动。
其次，小鼠运动相关核团在研究中的应用广泛而深入。
通过激活或抑制运动相关核团的活动，研究人员可以揭示运动调控的机制，进一步了解神经系统的功能。
比如，通过光遗传学技术，可以使用光兴奋或光抑制的蛋白质来操控特定核团的神经元活动，从而研究其在运动控制中的作用。
此外，还可以通过电生理记录和成像技术，观察运动相关核团的神经元活动模式，以及与运动行为之间的关联。
最后，小鼠运动相关核团的研究不仅对于基础科学具有重要意义，也有助于理解和治疗与运动相关的神经系统疾病。
例如，帕金森病是一种运动障碍性疾病，与基底节功能损害有关。
通过研究小鼠运动相关核团的异常活动模式，可以为帕金森病的治疗提供新的思路和方法。
综上所述，小鼠运动相关核团在运动研究中起着重要而不可替代的作用。
通过深入了解其功能和调控机制，我们可以更好地理解运动控制的基本原理，进一步揭示神经系统的奥秘，并为治疗运动相关疾病提供新的思路和方法。
小鼠受精卵显微去核技术的研究
武迪迪 刘莹 郑洁 王雁 于秉治
(中国医科大学基础医学院生物化学教研室,沈阳110001)
摘要 目的:探索昆明系小鼠受精卵细胞的去核技术。
方法:借助显微操作系统,利用带有小针尖的去核针通过负压将细胞核连同少量细胞质及包裹其外的细胞膜一同吸进去核针内。
结果:通过此种方法有66.5%的受精卵去核成功。
结论:此种方法为有效的去核方法。
关键词 显微操作;受精卵;去核
The Study on the Enuclea tion of M ouse Fetil ized Em bryos
W u D id i,L iu Y ing,Z heng J ie,W ang Y an,Y u B ing z h i
(D epartm ent of B i ochem istry,Co llege of Basic M edical Sciences,Ch ina M edical U niversiry,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:R emoving the nuclear of the kun2m ing strain mou se.M ethods:U sing the em b ryo m i2 crom an i pu lati on system,W e in sert the sharp ti p of the p i pette in to the cell,w h ich leads to negative p ressu re.W ith th is fo rce,w e suck the nuclear together w ith som e cytop las m a and cell m em b rane around it ou t of the cell in to the p i pette.Results:W ith th is m ethods abou t66.5%nuclears w ere removed successfu lly.Conclusion:T h is is a u sefu l m ethod fo r removing nuclear.
KEY WOR D S m icrom anpu lati on;zygo te;enucleati on
1997年7月苏格兰Ro slin研究所报道的“多利”的诞生[1]在世界范围内掀起了一场克隆热。
克隆动物一时引起科学界特别是生物界的关注,克隆动物制作技术将成为遗传工程动物的主导性技术。
而去核技术也成为克隆动物的关键环节,在核移植初期,移核针必须刺破细胞膜进行去核,对细胞损伤很大。
1986年日本人T sunoda用切透明带的方法进行去核[3],此种方法适用于初学显微操作者。
本实验用小鼠的受精卵为材料探索去核技术。
1 材料与方法
1.1 超排 选取4～6周健康昆明系雌性小鼠(中国医科大学实验动物部提供),于下午3时左右腹腔注射孕马血清(PM SG)10I U(天津华浮生物研究所)48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 I U(上海生物化学制药厂),当晚与雄鼠1∶1合笼,次日检查阴栓待用。
1.2 取受精卵 注射hCG17～24h后,脱颈处死有阴栓的母鼠,取输卵管,在显微镜下撕开壶腹,释放带有卵丘细胞的细胞团,于含1m g m l的透明质酸酶的M2液中消化2～3m in,于M2[4]中洗涤4～6次,获得裸卵,置于M16[4]液中,在含5%CO2、95%空气的孵箱中培养,供去核用。
113 固定吸管的制备 将外径为1.0Λm的毛细玻璃管在水平拉针仪上拉成外径合适的小管,在锻烧仪上断开,使其外径为100Λm,内径为20～30Λm的玻璃管,再进一步钝化,制成所需的固定吸管。
1.4 去核针的制备 将毛细玻璃管在水平拉针仪上拉成针尖细部分为8～9nm长,管的粗端为4～5 nm长的玻璃针,在锻烧仪上于外径25～30Λm处断开,在磨针仪上将末端磨成45°角,然后进行洗涤,洗涤后,在锻烧仪上用微温煅烧,使其拉出一条细尖。
1.5 操作过程
1.5.1 预处理:将12细胞期受精卵置入含5Λg m l 细胞松弛素B(CB)和0.1Λg m l乙酰甲基秋水仙碱的培养液中培养30～45m in,然后将12细胞期的受精卵置入含细胞松弛素B和乙酰甲基秋水仙碱的操作滴中。
1.5.2 固定细胞:将固定吸管靠近细胞,轻轻稳定吸住12细胞期的受精卵,调节与固定吸管相连的注射器,施加微小的负压力,由于细胞松弛素B和乙酰甲基秋水仙碱的作用,有部分透明带及细胞膜包绕的细胞质凹入固定吸管中。
1.5.3 调节显微操作系统:固定吸管吸住细胞后,调节显微镜的焦距及操作部分的旋纽,使去核针、固定针和细胞位于同一平面,去核针的针尖清晰。
1.5.4 去核针刺入细胞周隙:将去核针轻轻刺入透
・
8
・中国医科大学学报 J Ch in M ed U n iv 第29卷 增刊 2000年8月
明带使其进入细胞周隙,然后回缩去核针,操作时注意不要刺破细胞膜,尽量使去核针的斜面贴近细胞膜。
1.5.5 去核:移动去核针使其达到能够靠近一个细胞核的位置,调节与去核针相连的注射器,然后施加微小的负压力,细胞膜就会包绕核呈弧形凹入去核针中,移动去核针使其靠近另一个核,用同样方法使另一个核吸入去核针内,轻轻向回拉动去核针,吐出核小体,去核成功[5]。
去核后的细胞置入培养箱中待用。
2 结果
共进行8次实验,对209个受精卵进行去核, 139个细胞去核成功。
成功率为66.5%。
3 讨论
随着“多利”的诞生,克隆技术倍受人们的关注。
去核技术的研究也有了很大的进展。
很多人研究用不同的方法进行去核。
日本人T sunoda采用切透明带的方法进行去核,但也有不足之处。
首先,切完透明带的细胞切口不易寻找,且细胞膜包绕的细胞质易从切口中脱出,细胞数损失较多。
另外,在这一方法中,去核针同切透明带的针不同,去核时需换针,这样既费时又麻烦。
在进行去核操作过程中,去核针的制作,细胞松弛素的浓度和作用时间及显微操作系统的调节是本实验的关键环节。
首先,去核针在制作时针尖要细并且不能过长还要有一定弯曲,这是因为细的针尖易于穿过透明带进入细胞周隙,而太长的针尖又容易把细胞膜刺破,另外针尖要求有一定的弯曲是有利于去核针的斜面靠近细胞膜.满足这些条件的去核针去核成功率较高。
其次,细胞松弛素的浓度一定要控制在5Λg m l,浓度小于5Λg m l,细胞膜不够柔软,去核时细胞膜易破;浓度大于5Λg m l时细胞易变形,细胞膜变为不规则状,对细胞损伤太大。
另外细胞松弛素的作用时间控制在30～45m in,作用效果最佳。
时间太长或太短效果都不好。
最后,在去核的操作过程中注意调节显微镜的操作系统,一定要使固定针、去核针及细胞在一个平面,以去核针的针尖清晰为准。
操作过程中动作要轻柔缓慢。
本实验所采用的去核方法是高效、快捷的去核方法。
去核技术是研究细胞的全能性及核质关系的重要手段,同时去核技术也是克隆技术的关键环节,通过对去核技术的进一步完善,用去核技术克隆有经济价值或社会价值的器官和动物,如克隆人体器官及珍惜动物大熊猫成为可能,其科学意义和应用价值不可估量。
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