Sivelestat sodium salt_白细胞弹性蛋白酶抑制剂_150374-95-1_Apexbio

蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明（此文中所说的与咱的不同之处在于：原矾酸钠使用之前需要活化，另外多加了一种β-磷酸甘油的磷酸酶抑制剂）本文详细总结了常用的：蛋白酶抑制剂：PMSF、 Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2磷酸酶抑制剂：NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycerophosphate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。

一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。

溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。

在水溶液中不稳定。

在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。

分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。

4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。

分子量：C20H38N6O4×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4× H2O:493.6 使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。

Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。

不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。

pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。

避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。

人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。

炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。

目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠（sivelestat sodium hydrate），从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。

1 BM的生理、病理作用及结构特征HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，IRE），属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。

白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。

生理条件下，HNE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。

而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。

据报道，HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。

HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由 218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9 kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。

西维来司他钠用法，至少记住这8点临床用药评价3 条内容· 1443人看过西维来司他钠（Sivelestat sodium）可以抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）活性，是治疗伴全身炎症反应综合征（SIRS）的急性肺损伤（ALI）或者急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的有效药物。

2020年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）流行期间在我国快速上市。

药理作用机制（1）中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种溶酶体蛋白酶，是中性粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶。

在内毒素、补体C5a、抗原抗体复合物等因素刺激时，中性粒细胞释放NE。

当NE活性被过度激活时，肺血管通透性增加，气管收缩、分泌炎症因子，进而诱发ARDS。

（2）西维来司他钠是NE高度专一的特异性抑制剂，通过抑制NE 活性发挥作用。

药代动力学西维来司他钠主要通过肝脏代谢，其代谢与细胞色素P-450代谢酶无关。

西维来司他钠主要被羧酸酯酶水解，之后与葡萄糖醛酸及硫酸结合后经肾脏排泄，其血清蛋白结合率为99.6%，静脉滴注西维来司他钠半衰期为6-7 h。

适应证西维来司他钠用于改善SIRS的ALI/ARDS。

适用于满足下列（1）和（2）诊断标准的患者：（1）SIRS符合以下项目中两项以上：①体温>38℃或<36℃；②心率>90次/分；③呼吸频率>20次/分或二氧化碳分压（PaCO2)）<32mmHg；④白细胞数>12×109/L或<4×109/L或杆状核细胞（未成熟白细胞）>10%。

（2）ALI/ARDS符合以下全部项目：①机械通气时PaO2/FiO2≤300mmHg；②胸部X线检查两肺均有浸润阴影；③能测定肺动脉楔入压时，肺动脉楔入压≤18mmHg；不能测定肺动脉楔入压时，未见左房压上升的临床表现。

另外注意：①建议在发病后24-72h内开始使用。

②不建议用于伴有4个及4个以上器官损伤的多器官损伤、烧伤、外伤的ALI/ARDS。

文章编号: 1000-1336(2011)02-0238-06白细胞弹性蛋白酶抑制剂胡显腾　宋 歌　孔令超　刘小宇第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海 200433摘要：人白细胞弹性蛋白酶广泛参与体内的组织损伤反应，与炎症反应、自身免疫、肿瘤形成和转移等有密切关系。

目前人白细胞弹性蛋白酶抑制剂已成为新药开发的热点，具有很高的应用价值，其中西维来司钠已经成功进入市场。

本文对近几年发现的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的结构及其作用进行综述。

关键词：人白细胞弹性蛋白酶；抑制剂；西维来司钠中图分类号：Q71；Q74收稿日期：2010-07-12第二军医大学大学生创新能力培养计划基金项目(MS2009029)资助作者简介：胡显腾(1987-)，男，本科生，E-mail: thefalling snow@ ；宋歌(1988-)，男，本科生，E-mail ：sganthem @ ；孔令超(1988-)，男，本科生，E-mail ：790215986@ ；刘小宇(1971-)，女，硕士，副教授，通讯作者，E-mail ：liuxiaoyu8888@人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase, HLE)，是多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMNL)因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶[1]，其功能酶包含218个氨基酸残基，构成两个β-桶状(β-barrel)结构域，由4个二硫键维持稳定[2]，定位于多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中，可以水解纤连蛋白、胶原、软骨等组织连接成分[3]。

细胞因子、内毒素、血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)和甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine, fMLP)可激活HLE 的释放[4]，同时，HLE 的作用也受某些内源性抑制因子，如α1蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白和HLE 抑制因子的调控[5]。

蛋白酶抑制剂成分蛋白酶抑制剂是一种可以抑制蛋白酶活性的化合物。

蛋白酶是一种酶类，它在细胞内起着非常重要的作用，可以分解蛋白质分子，使其成为更小的分子。

但是，在某些情况下，过多的蛋白酶活性会导致细胞内的蛋白质被分解得过快，从而对细胞造成伤害。

因此，蛋白酶抑制剂成分可以在一定程度上保护细胞免受蛋白酶的伤害。

目前，已经发现了很多种蛋白酶抑制剂成分，其中一些已经被广泛应用于医学和生物学领域。

以下是一些常见的蛋白酶抑制剂成分：1. 蛋白酶抑制剂-1（Protease Inhibitor-1）蛋白酶抑制剂-1是一种天然存在于人体中的蛋白质，它可以抑制多种蛋白酶的活性。

研究表明，蛋白酶抑制剂-1可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、肿瘤、炎症等。

2. 甲基硫代咪唑（Methylthioadenosine）甲基硫代咪唑是一种天然存在于人体中的化合物，它可以抑制多种蛋白酶的活性。

研究表明，甲基硫代咪唑可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、炎症等。

3. 金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂（Staphylococcus aureus Protease Inhibitor）金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂是一种可以抑制金黄色葡萄球菌产生的多种蛋白酶的化合物。

这种化合物可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染等疾病。

4. 蛋白酶抑制剂A（Protease Inhibitor A）蛋白酶抑制剂A是一种可以抑制多种蛋白酶活性的化合物。

研究表明，蛋白酶抑制剂A可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、心血管疾病等。

5. 磷酸二酯酶抑制剂（Phosphodiesterase Inhibitor）磷酸二酯酶抑制剂是一种可以抑制多种磷酸二酯酶活性的化合物。

研究表明，磷酸二酯酶抑制剂可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、哮喘等。

总之，蛋白酶抑制剂成分具有广泛的应用前景，在医学和生物学领域都有着重要的作用。

未来，随着科学技术的不断发展，相信会有更多的蛋白酶抑制剂成分被发现，并用于治疗更多的疾病。

新型冠状病毒（COVID-19）于2019年被首次报道并传播迅速，被WHO 定义为大流行疾病。

虽然COVID-19感染是一种多系统疾病，但肺部是其感染和损伤的主要器官。

COVID-19可导致病毒性肺炎甚至是急性呼吸窘迫综合征（ARDS ）［1］。

据报道，2020年COVID-19住院患者的ARDS 发病率为15.6%~31%，这表明肺部的损伤率高于其他器官［2-5］。

但是，对ARDS 有效的治疗药物仍然极为有限［6］。

ARDS 的主要病理生理特征包括持续炎症，肺泡内Sivelestat sodium for treatment of patients with COVID-19-associated acute respiratory distress syndrome in intensive care unit:a single-center retrospective cohort studyLUO Min 1,2,HU Hongbin 3,SUN Ye 2,ZHAO Xin 3,ZENG Zhenhua 3,LIU Yilin 2,WU Gang 11Department of Emergency,3Department of Critical Care Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2Department of Critical Care Medicine,Yuebei People's Hospital,Shaoguan 512000,China摘要：目的探讨西维来司他钠治疗对COVID-19相关急性呼吸窘迫综合征（ARDS ）重症患者的生存率、氧合指数和感染血清标志物的影响。

方法回顾性纳入南方医科大学南方医院重症医学科中诊断为COVID-19相关ARDS 患者，从医疗系统收集其入ICU 24h 内以及出院当天的数据，并收集入ICU 后第1、3、7天的CRP 、PCT 、IL-6和氧合指数值。

论著-基础研究西维来司钠对创伤失血性休克复苏后大鼠的保护作用及可能机制！王艳1宗媛1牛丹1董道然1王会东2(1陕西省人民医院重症医学科,西安市710068，电子邮箱annie1999@;2陕西省西安市第一医院麻醉科,西安市710002)【摘要】目的观察西维来司钠对创伤失血性休克(THS)复苏后大鼠的保护作用及其可能的机制。

方法将30只大鼠随机分为假手术组(sham组)、THS组、西维来司钠处理组(S组)，各10只。

Sham组只行5cm切口造成软组织创伤，不行放血和复苏；THS组和S组均完成腹部创伤、放血及液体复苏等处理，并在复苏前分别腹腔注射生理盐水、西维来司钠。

复苏后即刻监测并记录各组大鼠血流动力学指标，复苏后24h监测左心室压力最大上升速率(+dp/dm r)和左心室压力最大下降速率(-dp/dm r)，检测动脉血气分析指标、肝肾功能指标、炎症因子[肿瘤坏死因子)(TNF-P)、白细胞介素6(IL-6"、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)],计算肺系数与肺湿/干重比，并在光学显微镜下观察心、肺、肝、肾细胞病理形态学改变#结果与sham组比较, THS组及S组心率、平均动脉压、+dp/dm r及-dp/dm r均下降，pH、PaO2、HCO3-均降低，而PaCO2、乳酸、W/D、肺系数、肝肾功能指标、TNF-、IL-6、HMGB1均升高(均P<0.05)，心、肺、肝、肾细胞均存在不同程度水肿。

与THS组比较，S组+dp/dt nr及-dp/dm r、pH、PaO2、HCO3「均升高，而PaCO2、乳酸、W/D、肺系数、肝肾功能指标、TNF-p、IL-6、HMGB1水平均下降(均P<0.05)，心、肺、肝、肾细胞水肿程度减轻。

结论西维来司钠能够改善THS复苏后大鼠心、肺、肝、肾功能，具有保护作用，这可能与其特异性抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性、减少损伤后炎性因子过度释放有关#【关键词】创伤失血性休克;复苏；西维来司钠；中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂；炎性反应;脏器功能；大鼠【中图分类号】R641；R977【文献标识码】A【文章编号】0253-4304(2020)03-0305-05 DOI：10.11675/j.issn.0253-4304.2020.03.16Protective effect of sivelestat sodium on traumatic hemorrdagic shocC ratsafted reshscitation and its potential mecCanismWANG Lan，ZONG Yuan1，NIU Dan1，DONG Dao-ran'，WANG Hid-doog?(1Intensive Care Unit，Shaanxi Provincial People's Hospital，Xi'an710068，China；2Department oUAnesthesiology，Xi'an NO.1Hospital，XCan710002，China)(Abstract)Objective To observe the protective effect of sivelestat sodium on traumatic hemorrhagic shock (THS)rats after r esuscitation rd its potential mechanism.Methods Thiby rats wee randomly divided into sham-opecion gcup(sham gcup)，THS gcup and sivelestat sodium treatment gcup(S Gcup)，with10rats in each gcup.Soft tissues injuc developed by a5cm incision was conducted in the sham gcup without bleeding and resuscitation；the THS group and the S gcup both received treatment of developing abdominal trauma，blood-letting therapy and Uuid resuscitation，and wee intrape/toneaUy administered normal saline and sivelestat sodium，respectively，p/ot to resuscitation.The hemodynamic indexes of all rats wee monbored and recorded at the right moment after resuscitation，the maximum of positive first decvative of left vent/cular pressure(+dp/dhr)rd the maximum negative first derivative of left ventricular pressure(Pp/dhr)were monitored after24hours of resuscitation，the a/e/a-blood gas analysis indexes，liver and renal function indexes，inUammatoc factors(tumor ▲基金项目：陕西省自然科学基础研究计划(2017JM8171)作者简介:王艳(1981〜)，女，硕士，主治医师，研究方向:危重症患者的器官保护％通信作者:王会东(1980-)，男，硕士，主治医师,研究方向：围术期患者的器官保护，电子邮箱：w007h007@%necrosis fHcWrw[TNF-p]%interleukin6* IB-6]and high mobility gmup protein B1*HMGB1])were measured%the lung penetration index and ratio of wet weight to dg weight(W/D)were calculated,and the9111000010100X11 changes of heal%lung,liver and kidneg cells were obsemed under optical microscope.Restlts In compawson with the sham gmup,the THS gmup and the S group had lower heal rate,mean aWewal pressure,=dp/dW y,一dp/dW y, pH,Pef)2and HCO3-,as wel l as higher PHO2,lactate,W/D,lung penetration index,liver and renal function indexes,TNF-p,IL-6and HMGB1(dlP<0.05),and also exhibited edema of hexW,lung,liver and kidney colls in vaWous degrees.As compared with the THS gmup,the S gmup obtained increased=dp/dW y,一dp/dW y,pH, PHO ad HCO3-,as wel l as declined PHO2,lactate,W/D,lung penetration index,liver and renal function indexes,TNF-p,IL-6and HMGB1levels!d l P<0.05),and processed dleviated edema of hexW,lung,liver and kidneg cells.Conclusion Sivelestat sodium can improve hexW,lung,liver and kidneg function of THS rats after ee<u<ci ia iion,eeeeiapeoieciieee t eci,which maybeeeaaied ioii<peciticinhibiiion e t ecion neuieophiaeaa<ia<e aciieiiyand deceea<ingoeee-eeaea<eotintaammaioeytacioe<atieeineuey.(Key wods]Traumatic hemofhagic shock,Resuscitation,Sivelestat sodium,Neutrophil elastase inhibitor, Lntaammaioeye4spons4,Oegan tunciion,Rai创伤失血性休克（traumatic hemofhagic shock, THS）是临床上常见的具有髙死亡率的疾病,仍是重症医学领域急需攻克的难题之一。

人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。

炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。

目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠（sivelestat sodium hydrate），从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。

1 BM的生理、病理作用及结构特征HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，IRE），属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。

白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。

生理条件下，HNE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。

而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。

据报道，HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。

HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由 218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9 kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。

产品名: DMP 777修订日期: 6/30/2016产品说明书化学性质产品名:DMP 777Cas No.:157341-41-8 分子量:564.69 分子式:C31H40N4O6 别名: L-694458; DMP-777; DMP777化学名:(2S)-N-[(1R)-1-(1,3-benzodioxol-5-yl)butyl]-3,3-diethyl-2-[4-(4-methy lpiperazine-1-carbonyl)phenoxy]-4-oxoazetidine-1-carboxamide SMILES:CCCC(C1=CC2=C(C=C1)OCO2)NC(=O)N3C(C(C3=O)(CC)CC)OC4=CC=C (C=C4)C(=O)N5CCN(CC5)C 溶解性:Soluble in DMSO 储存条件:Store at -20°C 一般建议: For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°Cand shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can bestored below -20°C for several months.运输条件:Evaluation sample solution : ship with blue iceAll other available size: ship with RT , or blue ice upon request生物活性靶点 :Metabolism 信号通路:HLE 产品描述:DMP 777(L-694458) is a potent, selective, and orally active human leukocyte elastase (HLE) inhibitor.参考文献:特别声明产品仅用于研究，不针对患者销售，望谅解。

注射用西维来司他钠Sivelestat Sodium 英文名：Sivelestat Sodium for Injection汉语拼音：Zhu She Yong Xi Wei lai Si T a Na【成份】本品活性成份为：西维来司他钠，化学名称：[[2-[[[4-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]苯基]磺酰基]氨基]苯甲酰基]氨基]乙酸钠四水合物，分子式：C20H21N2NaO7S.4(H2O)，分子量：528.51，辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、氢氧化钠。

【性状】本品为白色疏松块状物或粉末。

【适应症】用于改善全身性炎症反应综合征的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征。

使用注意：1、本品适用于满足下列( 1) 和( 2) 诊断标准的患者。

( 1) 全身性炎症反应综合征，符合以下项目中2项以上：①体温> 38℃或< 36℃；②心率> 90次/分；③呼吸频率> 20次/分或二氧化碳分压(PaCO2) < 32 mmHg；④白细胞数> 12×109/L或< 4×109/L或杆状核细胞(未成熟白细胞) > 10%。

( 2) 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征，符合以下全部项目：①机械通气时PaO2/FiO2 ≤300 mmHg；②胸部X线检查两肺均有浸润阴影；③能测定肺动脉楔入压时，肺动脉楔入压≤18mmHg；不能测定肺动脉楔入压时，未见左房压上升的临床表现。

2、不建议用于伴有4个及4个以上器官损伤的多器官损伤、烧伤、外伤的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征。

3、在合并重度慢性呼吸系统疾病患者中的有效性及安全性尚未明确。

【规格】0.1g（以C20H21N2NaO7S·4H2O计）【用法用量】采用生理盐水250ml-500ml进行配伍，现配现用。

将1日剂量(4.8mg/kg)用250-500ml生理盐水稀释，24小时持续静脉给药(相当于0.2mg/kg/h)，最长持续给药14天。

弹性蛋白酶抑制剂筛选方法的建立及天然产物对其抑制活性观察陈立平;尹相利;方玉春;郝立杰;赵烽【摘要】发现弹性蛋白酶抑制剂是治疗肺气肿等疾病药物的重要研发方向之一.本研究用弹性蛋白酶建立微量、高效的体外抑制剂筛选模型,利用西维来司钠作为阳性对照,验证了筛选模型的稳定性和灵敏度,并筛选了33种中药单体对弹性蛋白酶的抑制活性,其中部分化合物表现一定的抑制活性.【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》【年(卷),期】2011(024)003【总页数】5页(P209-213)【关键词】弹性蛋白酶;筛选方法;活性筛选【作者】陈立平;尹相利;方玉春;郝立杰;赵烽【作者单位】烟台大学药学院,山东烟台264005;烟台大学药学院,山东烟台264005;海洋药物教育部(中国海洋大学)重点实验室,山东青岛266003;烟台赛尔斯生物技术有限公司,山东烟台264006;烟台大学药学院,山东烟台264005【正文语种】中文【中图分类】R96人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)是一种存在于体内的破坏性酶，它能水解某些结缔组织成分如弹性硬蛋白、蛋白多糖和某些类型的胶原质[1].该酶由于炎症刺激从白细胞中释放，它的过多表达和过高活性参与多种疾病的病理过程[1－4].因此，弹性蛋白酶抑制剂具有潜在的应用价值.另外，由于弹性蛋白酶破坏胶原纤维及组织基底膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以，弹性蛋白酶还是研发抗癌药物的新靶点[5－6].开发弹性蛋白酶抑制剂作为治疗炎症相关疾病药物和抗癌药物已成为目前药物研发的一个新热点，目前国外一些著名制药公司已竞相开展了针对上述疾病治疗药物的研发.例如，日本Fujisawa公司分别从Streptomyces resistomycificus和Flexibacter sp.代谢产物中分离得到人白细胞弹性蛋白酶抑制剂 FR901277[7]和FR901451[8]，前者可阻止由HLE诱导的小鼠足部水肿，后者可防止由HLE诱导的仓鼠肺出血.日本OnoSokki公司2002年4月获得了弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠的生产许可，该药物是全球首个治疗伴有全身性炎症反应综合征的急性肺损伤药物[9－10].能选择性地抑制中性粒细胞释放弹性蛋白酶.张灿等[11]设计并合成了4类13个西维来司钠类似物，但是活性测试结果表明13个样品对弹性蛋白酶的抑制活性均不及西维来司钠.本实验的目的在于构建微量、高效的体外弹性蛋白酶抑制剂筛选模型，进一步从植物提取物、微生物代谢产物库以及化合物库中筛选新的HLE抑制剂，发现活性药物前体[12－13].1 材料与方法1.1 材料1.1.1 中药单体大黄素、木犀草素、橙皮苷、芹菜素、丹皮酚、莽草酸、柚皮苷、白藜芦醇、金丝桃苷、原花青素、黄芩素、穿心莲内酯、细辛醚、川穹嗪、熊果苷、芦丁、葛根素、二氢青蒿素、苦参碱、厚朴酚、齐墩果酸、青蒿素、黄芪甲苷、蛇床子素、氧化苦参碱、阿魏酸、大黄素甲醚、吴茱萸碱、和厚朴酚、甘草酸、汉防己甲素、松萝酸、熊果酸，由烟台赛尔斯生物技术有限公司提供.1.1.2 试剂及仪器西维来司钠(Sivelestat sodium salt hydrate，S7198)、底物(N-methoxysuccinylala-ala-pro-val-p-nitroanilide，M4765)购自Sigma公司，弹性蛋白酶(30 U/mg)为常州千红生化制药股份有限公司产品，对硝基苯胺购自烟台赛尔斯生物技术有限公司.3111型单道可调移液器(德国Eppendorf公司)，XW－80A型旋涡混合器(上海精科实业公司)，5810R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)，全自动酶标仪(美国Biotek集团).1.2 方法1.2.1 体外筛选模型的建立(1)溶液配制.底物用DMSO溶解，配制成10 mmol/L溶液，－80℃保存备用.使用前用10%DMSO(DMSO∶PBS=1∶9)稀释至100 μmol/L.弹性蛋白酶用PBS溶解，配制成10 U/mL溶液，－80℃保存备用，使用前用PBS稀释.西维来司钠用水溶解，－80℃保存备用，使用前用水稀释.(2)标准曲线的测定.弹性蛋白酶可以特异性地水解底物，采用分光光度法测定被分解出的对硝基苯胺(pNA)在405 nm处的吸光度值，计算酶活力以及抑制率.根据以上测定原理，首先精确称取对硝基苯胺(pNA)10.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加1 mL DMSO溶解，用PBS稀释定容至10 mL，作为原液保存备用.取20 μL原液用10%DMSO(DMSO∶PBS=1∶9)稀释至 1 mL，分别取 200、150、100、50、30、20、10、5、1 μL 置于 96孔酶标板中，加10%DMSO至200 μL，对应的浓度分别为:147.7、110.8、73.9、36.9、22.2、19.7、7.39、3.69、0.74μmol/L 以 PBS 为空白对照，设两组平行，在405 nm下测定吸光值，以浓度和吸光值绘制标准曲线.(3)酶浓度筛选.所有反应均在96孔酶标板中完成.每孔分别加入不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 U/mL)的酶液90 μL，DMSO 10 μL，37 ℃保温5min后，加入100 μmol/L 的底物溶液100 μL，反应总体积为200 μL，空白对照孔加入200 μL 10%D MSO，设平行2组，37℃保温反应不同时间点时，测定405 nm吸光值，求平均值.(4)阳性对照药物西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制活性测定.以西维来司钠作为阳性对照药物验证筛选模型的灵敏度和稳定性.每孔加入2.5 U/mL的酶液90 μL，不同浓度(反应终浓度分别为 1000、500、250、125、62.5、31.25 μmol/L)的西维来司钠溶液10 μL，37℃保温5 min后，加入100 μmol/L的底物溶液100 μL，反应总体积为200 μL，同时设100%酶活性对照孔，即用10 μL PB S代替西维来司钠溶液，空白对照孔用等体积10%DMSO代替.37℃保温反应60 min后，测定405 nm吸光值.1.2.2 天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性测定精确称取各天然产物，用DMSO溶解配制成20 mmol/L溶液备用.取已经配好的酶液135 μL、15 μL样品加入1.5 mL离心管中，37℃反应5 min后加入150 μL底物，同时设100%酶活性对照组、空白底物组(即用等体积10%DMSO代替底物)、空白对照组.设置两个平行孔，37℃保温反应60 min后，离心(10000 r/min，5 min)，从每管取上清200 μL于96孔酶标板中，在405 nm波长处读取每孔吸光值.反应总体积为300 μL，药物在反应体系中的终浓度为1 mmol/L.按照以下公式计算药物对弹性蛋白酶的抑制率.抑制率(%)=100×[1－(A药物－A空白底物)/A100%酶孔].2 结果与分析2.1 标准曲线的建立以405 nm吸光值对pNA浓度进行线性回归，得工作曲线方程:Y=0.0028X+0.0472(R2=0.9982，n=9).在 0.74 ～147.7 μmol/L 浓度范围内线性良好(图1)，说明在此范围内pNA的浓度与吸光值成线性.2.2 酶反应曲线特点从不同酶浓度下的酶反应曲线(图2)可知，酶浓度为10 U/mL时，15 min左右即可将底物完全水解，生成对硝基苯胺的吸光值达到最大.酶浓度为0.625和0.3125 U/mL时，酶的活力较弱，120 min仍然不能够将底物完全水解.酶浓度为2.5U/mL时，酶活性中心与底物基团的结合速度与生成物的生成速度一致，60 min 可将底物全部水解，此时间段及相应酶浓度值适宜于模型效应评价及活性筛选.故将酶的用量确定为2.5 U/mL，反应时间确定为60 min.图1 pNA标准曲线Fig.1 Standard curve of pNA图2 酶反应的速度曲线Fig.2 Velocity curve of enzyme reaction2.3 西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制活性西维来司钠对弹性蛋白酶表现出显著的抑制活性，并呈现良好的剂量依赖关系(图3)，西维来司钠的半数抑制浓度(IC50)为43.3 μmol/L.重复3次试验得到的作用曲线基本一致，表明此活性筛选模型具有良好的重现性.图3 西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制曲线Fig.3 Inhibition curve of Sivelestat sodium2.4 部分天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性利用上述的反应条件，筛选了33种常见中药单体成分对弹性蛋白酶的抑制活性，结果见表1.所选取单体化合物包括黄酮、蒽醌、生物碱、萜类等天然产物化学中最主要的结构类型.表1 各中药单体对弹性蛋白酶的抑制活性结果Tab.1 Inhibitory effect of natural compounds on the activity of elastase如表1所示，阳性对照药物西维来司钠在1 mmol/L浓度下可完全抑制弹性蛋白酶的活性.芦丁、熊果酸、金丝桃苷、汉防己甲素对弹性蛋白酶表现出不同程度的抑制活性.这4种活性化合物的分子结构式见图3.3 讨论及结论图4 4种活性化合物的分子结构式Fig.4 Molecudar structure of 4 active chemicals人白细胞弹性蛋白酶是多形核白细胞因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶.作为一种蛋白水解酶，弹性蛋白酶是已知的最有破坏性的酶，它以分解不溶性弹性蛋白为特征，具有广泛的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种光谱的肽链内切酶.弹性蛋白是肺、血管壁和其它器官的重要组成部分，因此弹性蛋白酶被认为参与肺气肿、囊性纤维化、慢性支气管、急性呼吸窘迫综合症、肾小球肾炎、肝炎和类风湿性关节炎等慢性炎症疾病的发病过程.本研究在成功地建立了针对治疗上述疾病的筛选药物方法的基础上，筛选了33种天然产物对弹性蛋白酶的抑制活性，所选天然产物包括了黄酮、蒽醌、生物碱、萜类等天然产物化学中最主要的结构类型，以初步探讨哪些类型的天然化合物对弹性蛋白酶具有较好的抑制活性，结果表明芦丁、金丝桃苷、汉防己甲素对弹性蛋白酶具有较好的抑制活性，其中芦丁为黄酮类化合物、金丝桃苷为黄酮苷化合物，二者均具有黄酮母核，提示天然黄酮类化合物可能有潜力成为弹性蛋白酶抑制剂.这些结果为进一步从植物提取物、微生物代谢产物库以及化合物库中筛选新的弹性蛋白酶抑制剂，发现活性药物前体提供了一定的参考依据.参考文献:[1]Tremblay G M，Janelle M F，Bourbonnais Y，et al.Anti-inflammatory activity of neutrophil elastase inhibitors[J].Curr Opin Invest Drugs，2003，4(5):556－565.[2]Betsuyaku T，Nishimura M，Takeyabu K，et al.Decline in FEV1 in community-based older volunteers with higherlevels of neutrophil elastase in bronchoalveolar lavage fluid[J].Respiration，2000，67(3):261－267.[3]Doring G.The role of neutrophil elastase in chronic inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med，1994，150(6 Pt 2):114－117.[4]Steinmeyer G J，Kalbhen D A.The inhibitory effects of an-tirheumatic drugs on the activity of human leukocyte elastase and cathepsinG[J].Inflamm Res，1996，45(7):324－329.[5]Sun Z，Yang P.Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression[J].Lancet Oncol，2004，5(3):182－190.[6]Dona M，Dell'Aica I，Pezzato E，et al.Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis [J].Cancer Res，2004，64(17):6225－6232.[7]Keiko F，Yasuhiko S，Hiroshi H，et al.FR901277，a novel inhibitor of human leukocyte elastase from Streptomyces resistomy cifious[J].J Antibiot，1993，46(6):908－912.[8]Takashi F，Hiroshi H，Kenichi H，et al.FR901451，a novel inhibitor of human leukocyte elastase from Flexibacter sp.I.Producing organism，fementation，isolation，physicochemical and bidogical properties [J].J Aantibiot，1994，47(12):1359－1362.[9]杜冠华，吴松，冯文化.西维来司钠治疗急性肺损伤研究现状[J].中国药学杂志，2004，39(5):321－324.[10]徐凌，蔡柏蔷，单渊东，等.弹性蛋白酶抑制剂对严重急性呼吸综合征急性肺损伤有效性和安全性随机开放、平行对照、多中心临床研究[J].中华内科杂志，2005，44(2):147－148.[11]张灿，郭炼伟，高向东，等.西维来司钠类似物的合成及其对弹性蛋白酶的抑制活性[J].中国药物化学杂志，2006，16(3):129－130.[12]郑智慧，任晓，司书毅，等.白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA－2554A的研究[J].中国抗生素杂志，2007，32(5):273－274 [13]魏亚闪，张华，路新华，等.微生物来源的人白细胞弹性蛋白酶[J].河北师范大学学报:自然科学版，2007，31(5):659－660.。

西维来司他钠在大鼠急性脊髓损伤中的保护作用霍佳;苏斌虓;王世全;王凯;董海龙【期刊名称】《中华神经外科疾病研究杂志》【年(卷),期】2014(13)6【摘要】目的探讨脊髓损伤后早期使用西维来司他钠(Sivelestat sodium)抑制细胞凋亡,对大鼠脊髓损伤的保护作用及机制.方法将60只SD大鼠随机分成5组,每组12只,Allen's脊髓损伤模型后,立即腹腔注射Sivelestat sodium 1.6mg/kg,4.8 mg/kg,10 mg/kg,50 mg/kg,并连续7d(1次/d),对照组给等量生理盐水,并采用脊髓运动功能评分(BBB scale)对大鼠进行双下肢神经功能评分.原位末端标记法(TUNEL)观察脊髓损伤后脊髓神经细胞凋亡情况.酶联免疫吸附法(ELASA)检测炎症因子.免疫印迹法检测甘油醛-3-磷酸脱氢_E3泛素连接酶-1(GAPDH-Siah1)细胞凋亡序列.结果以BBB标准评价大鼠的双下肢运动功能,治疗组的下肢活动功能明显好于对照组.4.8 mg/kg和10 mg/kg剂量组双下肢神经功能学评分与对照组比较具有明显差异(P ＜0.01);50 mg/kg剂量组未见明显保护作用,因此未加入统计结果.TUNEL染色显示,sivelestat sodium明显减少了脊髓损伤后神经细胞凋亡,抑制脊髓损伤后炎症因子表达.sivelestat sodium显著抑制GAPDH-Siah1凋亡序列的表达.结论 sivelestat sodium通过抑制GAPDH-Siah1凋亡序列,减少脊髓损伤后脊髓神经细胞的凋亡,从而改善脊髓损伤大鼠后肢运动神经功能.【总页数】4页(P515-518)【作者】霍佳;苏斌虓;王世全;王凯;董海龙【作者单位】第四军医大学西京医院麻醉科,陕西西安710032;第四军医大学西京医院麻醉科,陕西西安710032;第四军医大学西京医院麻醉科,陕西西安710032;第四军医大学西京医院麻醉科,陕西西安710032;第四军医大学西京医院麻醉科,陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R651.2【相关文献】1.西维来司钠对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 [J], 胡月;董志;晏飞2.西维来司钠对高原颅脑损伤大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶的影响及神经损伤的保护作用 [J], 马铁军;周其全3.西维来司钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制 [J], 丁丽君;董志;乐乐乐;秦黄英4.西维来司钠对大鼠重症急性胰腺炎后急性肝损伤的保护作用 [J], 赵宝川;脱红芳;彭彦辉;耿晓峰5.西维来司钠对创伤失血性休克复苏后大鼠的保护作用及可能机制 [J], 王艳; 宗媛; 牛丹; 董道然; 王会东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。