细胞永生化

研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。

有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。

然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。

通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。

研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究肿瘤发生机制的重要模型。

另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。

研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：1病毒基因转染很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。

这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。

EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。

EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。

目前，EB 病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。

SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。

应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。

永生化细胞名词解释
永生化细胞是指具有无限增殖能力的细胞，能够维持其生命周期的延长而不进入老化或凋亡状态。

这种细胞通常具有以下特征：
1. 无限增殖能力，永生化细胞能够不断地分裂和繁殖，而不受传统细胞分裂次数的限制。

它们能够持续地产生后代细胞，并保持其活力和功能。

2. 抗老化特性，相比普通细胞，永生化细胞具有更强的抵抗老化的能力。

它们能够维持较长的细胞寿命，不易受到环境因素和时间的影响而发生功能衰退。

3. 自我修复机制，永生化细胞通常具有较强的自我修复能力，能够修复受损的DNA或细胞结构，从而保持其正常功能和稳定性。

4. 细胞周期调控，永生化细胞能够调控细胞周期的进程，使细胞能够持续地进行有序的分裂和增殖，而不会过早地进入停滞或凋亡状态。

永生化细胞在生物学研究和医学领域具有重要意义。

研究人员
利用永生化细胞的特性，可以更好地理解细胞增殖、老化和疾病发
生的机制。

此外，永生化细胞还被应用于组织工程、干细胞研究、
药物筛选和基因治疗等领域，为人类健康和医学进步提供了新的可
能性。

需要注意的是，永生化细胞并非在自然界中普遍存在，而是通
过人工手段或基因突变等方式获得的。

此外，永生化细胞的研究和
应用也存在一些伦理和安全的考虑，需要在科学和伦理框架下进行。

细胞永生化:体外培养细胞经过自发的或受外界因素的影响而从增殖危机中逃逸，细胞获得持续生长增殖能力的特性.永生化的细胞具有无限增殖生长性，可长期传代，并多伴有核型改变。

原代细胞永生化后即获得无限增殖的能力，但它们没有恶性转化的表型特征，即不能在软琼脂上形成克隆(锚着独立性生长)，也不能在裸鼠皮下成瘤。

如果细胞在永生化的基础上发生更多的分子突变事件如癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等，这些突变在细胞中不断累积，达到一定的负荷时，细胞就可能发生恶性转化，因此细胞永生化实际上可以看作是细胞转化前的一个特殊阶段。

目前普遍认为细胞永生化是细胞恶性转化的必经阶段，因为所有的肿瘤细胞都具备无限分裂的特性。

也就是说永生化细胞有可能是肿瘤细胞的前奏，它和肿瘤细胞都是无限增殖的，但是永生化细胞无成瘤性，肿瘤细胞有成瘤性质，它们在癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等方面分子方面应该有很多不同
永生化细胞和肿瘤细胞：虽然二者均可无限增殖，永生化细胞没有肿瘤具有的浸润性和转移性。

大学细胞生物学考试练习题及答案81.[单选题]用胸腺嘧啶脱氧核苷酸（TdR）处理增殖中的细胞可使其阻滞在哪个时期？（ ）A)G1期B)S期C)G2期D)M期答案:B解析:高浓度的胸腺嘧啶能阻断DNA合成所需的核苷酸的合成，在细胞分裂周期中， 将细胞阻断在G1/S期交界处，正在合成DNA的细胞将停滞在S期。

2.[单选题]卵磷脂又叫做( )A)磷脂酰胆碱B)磷脂酰乙醇胺C)磷脂酰丝氨酸D)鞘磷脂答案:A解析:3.[单选题]具有破坏微管结构的特异性药物是( )A)秋水仙素B)细胞松弛素C)鬼笔环肽D)紫杉酚答案:A解析:4.[单选题]在核糖体中执行催化功能的生物大分子是（ ）。

[南开大学2011研]A)蛋白质B)DNAC)RNAD)糖类答案:C解析:核糖体是核糖体RNA（rRNA）和核糖体蛋白（r蛋白）复合物，其关键的部分是rRNA，它是蛋白质合成的催化机器，具有肽酰转移酶的活性；而核糖体蛋白更多地是作为一种骨架帮助rRNA维持正确的构象，以及在蛋白质合成中起微调作用。

5.[单选题]N-连接的糖基化中，糖链连接在( )上。

A)天冬酰胺D)羟脯氨酸E. 精氨酸答案:A解析:6.[单选题]有关受体的激动剂和阻断剂，说法不对的是 （ ）A)激动剂和阻断剂都可以与受体结合B)激动剂与受体亲和力大，而阻断剂与受体的亲和力小C)激动剂与受体的亲和力大，并且内在活性大D)阻断剂与受体的亲和力大，并且缺乏内在活性答案:B解析:7.[单选题]核糖体上肽酰基位点的作用是（ ）A)接受并结合新掺入的氨酰基-tRNAB)结合延伸中的肽酰基-tRNAC)在肽链延伸过程中催化氨基酸残基之间形成肽键D)供给催化肽酰基-tRNA转位时所需的能量答案:B解析:8.[单选题]将血清从处于S期的原代细胞的培养液中去除后，细胞将停在（ ）A)SB)G2C)MD)G0答案:D解析:9.[单选题]中心粒的复制发生在（ ）。

A)G1期B)S期C)G2期D)M期答案:A解析:10.[单选题]微粉干涉显微镜是将（ ）转变成明暗差A)景深差B)焦距差C)相位差解析:11.[单选题]亲和层析是依靠填充物的（ ）将蛋白质选择性的分离A)孔径B)电荷C)配体D)分子量答案:C解析:12.[单选题]内共生假说认为叶绿体的祖先为一种（ ）。

细胞永生化处理方法引言细胞永生化处理方法是指通过一系列的技术手段，使细胞能够长时间保持活力和增殖能力，从而实现细胞的永生化。

这项技术在生物医学研究、药物开发和组织工程等领域具有重要的应用价值。

本文将介绍几种常见的细胞永生化处理方法，并分析它们的优缺点。

方法一：基因修饰基因修饰是一种常见的细胞永生化处理方法。

通过改变特定基因的表达或功能，可以延长细胞的寿命和增加其增殖能力。

常用的基因修饰方法包括下调抑制性基因、上调促进性基因以及改变染色体结构等。

下调抑制性基因是一种常见的策略。

例如，通过RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统靶向沉默p53等抑制性基因，可以减少细胞凋亡和老化现象，延长细胞寿命。

上调促进性基因也是一种有效的方法。

例如，通过转染特定基因或使用激活子等技术，可以增加细胞的增殖能力和代谢活性，从而延长细胞寿命。

改变染色体结构是另一种常见的基因修饰方法。

例如，通过转座子或合成染色体等技术，可以改变细胞染色体的结构和组成，提高其稳定性和抗衰老能力。

然而，基因修饰方法存在一些局限性。

首先，基因修饰可能引发不可预测的副作用或导致细胞功能异常。

其次，基因修饰需要精确的操作和复杂的技术支持，对于一些非专业人员来说较为困难。

方法二：药物干预药物干预是另一种常用的细胞永生化处理方法。

通过使用特定药物或化合物，可以调节细胞的代谢、增殖和凋亡等过程，从而延长细胞寿命。

一种常用的药物干预方法是使用抗衰老剂。

目前已经发现了多种具有抗衰老效果的化合物，如雷帕霉素、二甲双胍等。

这些化合物可以通过激活特定信号通路或改变细胞内环境来延长细胞的寿命。

另一种常见的药物干预方法是使用激素。

例如，雌激素在一些细胞中具有促进增殖和减少凋亡的作用，可以延长细胞寿命。

然而，激素使用需要注意剂量和时间的控制，以避免不良反应和副作用。

虽然药物干预方法相对简单易行，但也存在一些问题。

首先，不同细胞对药物的敏感性存在差异，需要进行个体化处理。

细胞永生化处理方法细胞永生化处理方法，就是通过一系列手段让细胞在无限期间内不受自然死亡的限制而实现细胞“永生”的过程。

此技术的发展与生命科学领域研究的进步密切相关，对于人类医疗、生命科学等领域都有着重要的意义。

目前，细胞永生化的处理方法主要有以下几种。

第一种，各种DNA损伤修复系统的促进。

当细胞受到外界环境、化学物质、射线等因素影响时，其内部的DNA会出现不同程度的损伤。

而损伤的DNA长期叠加，并不能通过机体自身修复的方式，致使细胞失去自我修复能力，从而导致细胞死亡。

目前的细胞永生化处理方法就是通过促进各种DNA修复系统的运作，极大地提高了细胞修复损伤的速度和效率。

第二种，线粒体增值。

线粒体是细胞内的一个重要器官，其主要功能是提供细胞所需的能量。

而线粒体的功效则取决于其内部的氧化磷酸化过程，当这个过程出现问题时，线粒体的能量供给也会跟着减弱。

因此，通过增加细胞内线粒体的数量，可以从根本上改善细胞代谢的状况，进而实现细胞永生化的效果。

第三种，活性氧的消除。

在细胞永生化过程中，活性氧的生成是一个不可避免的过程。

随着时间的推移，这些活性氧会逐渐积累，最终导致细胞的死亡。

因此，消除细胞内的活性氧，可以有效防止其积累，从而保证细胞的生存。

第四种，细胞表面的改变。

在自然界中，很多细胞都需要经历繁殖、生长、发育等过程，而这些过程对于细胞表面的改变至关重要。

因此，通过维持细胞表面的稳定状态，可以提高细胞的自我修复能力，实现细胞永生化的效果。

在当前的生命科学领域中，细胞永生化处理方法已经开始得到广泛的应用。

通过这些技术的不断推进，我们相信，未来的这个领域会带来更多的创新和发展，为人类健康和生命科学的发展做出更大的贡献。

人永生化胰腺星形细胞系的构建及其功能的验证韩世纪1，2，练国达1，2，陈少杰1，2，黄开红1，2*，李佳佳1，3*［摘要］目的构建人永生化胰腺星形细胞（PSCs）系并探讨其生物学功能。

方法采用outgrowth方法提取人原代胰腺星形细胞（hPSCs），慢病毒感染方法导入SV40LT基因和hTERT基因，嘌呤霉素筛选稳定高表达两个基因的细胞（im PSCs），qRT⁃PCR和Western bolt方法检测表达水平；CCK8法、核型分析、免疫荧光、体内成瘤实验检测im PSCs生长曲线，染色体数目，胶原基质蛋白表达和有无恶性表型转化；共培养方法、CCK8法、细胞划痕、迁移侵袭方法检测imPSCs促瘤作用。

结果hPSCs呈多角形和梭形，慢病毒感染的im PSCs，显微镜下有亮绿色荧光；im PSCs细胞高表达SV40LT基因和hTERT基因；im PSCs生长曲线呈典型的“S”型，染色体数目增多，体内不能成瘤，表达α⁃SMA、Collagen I、Fibronectin，具有PSCs的生物学功能和特点；其与胰腺癌细胞共培养后，明显促进肿瘤生长，与人原代PSCs功能相当。

结论采用慢病毒转染SV40LT基因和hTERT基因可成功构建人胰腺星形细胞永生化细胞系，为胰腺星形细胞本身及胰腺癌微环境相关研究提供实验材料和模型。

［关键词］胰腺癌；胰腺星形细胞；永生化细胞系doi：10.3969/j.issn.1009⁃976X.2021.01.007中图分类号：R735.9文献标识码：AConstruction and functional verification of immortalized human pancreatic stellate cellsHAN Shi⁃ji1，2，LIAN Guo⁃da1，2，CHEN Shao⁃jie1，2，HUANG Kai⁃hong1，2*，LI Jia⁃jia1，3*1.Key Laboratory of Epidemiology and Gene Regulation of Malignant Tumors，Sun Yat⁃sen MemorialHospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；2.Department of Digestive System Depart⁃ment，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；3.Depart⁃ment of Nephropathy Department，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，ChinaCorresponding author：HUANG Kai⁃hong，*****************；LI Jia⁃jia，****************［Abstract］Objective To construct the human pancreatic stellate cell line immortalization anddiscuss their biological function.Methods We extracted human primary pancreatic stellate cells（hPSCs）by outgrowth and then infected the cells with SV40LT and hTERT genes using lentivirus infection.Thecells（named imPSCs）with stable and high expression of SV40LT and hTERT genes were screened with puromycin.The next，qRT⁃PCR and Western Bolt methods were used to detect the expression levelsof the two K8method，karyotype analysis and immunofluorescence method were conducted respectively to detect the growth curve，chromosome number，protein expression ofα⁃SMA，collagen Iand fibronectin of the imPSCs.We also performed tumor formation assay in vivo to detect whether theimPSCs had malignant phenotypic transformation.The tumorigenesis of imPSCs was detected by transwellcell co⁃culture，CCK8methods，wound healing assay，migration and invasion methods.Results Humanprimary PSCs were polygonal and spindle shaped，and bright green fluorescence was observed under the microscope after successfully infected lentivirus.In imPSCs，SV40LT and hTERT genes were stably andhighly expressed in mRNA and protein levels.The imPSCs had typed“S”growth curve and increased基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（82003175）；广东省医学科学技术研究基金项目（A2019447）作者单位：1.中山大学孙逸仙纪念医院，广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，广州510120；2.中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广州510120；3.中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广州，510120*通讯作者：黄开红，Email：*****************；李佳佳，Email：****************胰腺癌恶性程度高，肿瘤间质纤维化是其重要病理特征，纤维化程度与不良预后相关［1］。

永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【摘要】The lentivirus system carrying hTERT gene was inserted to sheep lung fibroblasts (SLT) in order to establish an immortal cell line. Firstly, the recombinant lentiviral expression vector (pLOV-puro-hTERT) carrying hTERT gene was transfected into 293T cells. Subsequently, the primary SLT cells were infected with the rescued lentiviruses. The positive SLT cells expressing hTERT were selected with puromycin and examined with RT-PCR and Western blot. The results showed that hTERT gene was stably expressed in SLT cells, indicated that an immortalized SLT cell line had been established.%为了利用携带人源端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达系统将原代绵羊肺成纤维细胞进行永生化.本研究利用PCR技术从pBabe-neo-hTERT中扩增hTERT基因,并利用infusion技术构建重组慢病毒表达载体pLOV-puro-hTERT.将重组慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,拯救出慢病毒颗粒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中hTERT基因的转录和表达水平.筛选获得的阳性克隆,命名为SLT细胞系.SLT 细胞系连续传代后RT-PCR及Western blot 检测均显示hTERT稳定表达.本研究表明,我们成功构建了永生化绵羊肺成纤维细胞系.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】绵羊肺成纤维细胞;人端粒酶逆转录酶;永生化【作者】刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241【正文语种】中文【中图分类】S852.659.3传代细胞系是开展动物病毒应用和基础研究的重要平台，然而有许多动物病毒缺乏能支持其稳定增殖的本源宿主细胞系，例如小反刍兽疫病毒和兔瘟病毒，严重阻碍了这些病毒的分子生物学研究和疫苗研制工作。