细胞永生化实验

研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。

有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。

然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。

通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。

研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究肿瘤发生机制的重要模型。

另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。

研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：1病毒基因转染很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。

这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。

EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。

EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。

目前，EB 病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。

SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。

应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。

永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【摘要】The lentivirus system carrying hTERT gene was inserted to sheep lung fibroblasts (SLT) in order to establish an immortal cell line. Firstly, the recombinant lentiviral expression vector (pLOV-puro-hTERT) carrying hTERT gene was transfected into 293T cells. Subsequently, the primary SLT cells were infected with the rescued lentiviruses. The positive SLT cells expressing hTERT were selected with puromycin and examined with RT-PCR and Western blot. The results showed that hTERT gene was stably expressed in SLT cells, indicated that an immortalized SLT cell line had been established.%为了利用携带人源端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达系统将原代绵羊肺成纤维细胞进行永生化.本研究利用PCR技术从pBabe-neo-hTERT中扩增hTERT基因,并利用infusion技术构建重组慢病毒表达载体pLOV-puro-hTERT.将重组慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,拯救出慢病毒颗粒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中hTERT基因的转录和表达水平.筛选获得的阳性克隆,命名为SLT细胞系.SLT 细胞系连续传代后RT-PCR及Western blot 检测均显示hTERT稳定表达.本研究表明,我们成功构建了永生化绵羊肺成纤维细胞系.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】绵羊肺成纤维细胞;人端粒酶逆转录酶;永生化【作者】刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241【正文语种】中文【中图分类】S852.659.3传代细胞系是开展动物病毒应用和基础研究的重要平台，然而有许多动物病毒缺乏能支持其稳定增殖的本源宿主细胞系，例如小反刍兽疫病毒和兔瘟病毒，严重阻碍了这些病毒的分子生物学研究和疫苗研制工作。

利用EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞获得永生化细胞株保存人类全基因组摘要：人类外周血B 淋巴细胞可以被Ebv 在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的LCL 。

保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化。

环孢霉素A 法是建立珍贵样本的LCL 的首选方法。

采血12到36小时分离转化B 淋巴细胞，转化液中添加cysA 、pha ，控制转化时细胞数量在106/ml 数量级有助于提高建株率。

37℃5%二氧化碳恒温培养，及时添加新鲜的RPMI 1648培养液以及全程无菌操作防止细菌真菌污染至关重要。

慢冻迅速升温是冻存、复苏的关键。

原代和继代之间G 条带分析、核型对比、对常见变异位点应用PCR 进行质控有助于发现LCL 的细胞变异。

关键词：EBV 转化 B 淋巴细胞 LCL人类外周血B 淋巴细胞可以被EB 病毒（Epstin-Barr Virus,EBV ）在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的人类淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell lines,LCL ）。

该细胞株保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化]2,1[。

因此，利用EBV 建立具有人类全基因组的永生化细胞株，成为保全全世界各民族特有种群基因及研究人类缺陷基因疾病乃至人类长寿基因探讨的首选方法。

近十年来，我国使用这种方法建成了十多个少数民族]6543[、、、以及基因缺陷疾病]131********[、、、、、、、免疫抗体技术]1514[、甚至长寿人群家系]16[的LCL ，其应范围也已经突破医学延伸至体育领域]17[。

事实证明，建立能永久保存的细胞系是打破传统研究中研究的接力式进行与样本的暂时性存在矛盾的关键所在]16[。

1 EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞建立LCL 的机制及病毒来源EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞的机制尚未完全明晰，可能与p53抑癌基因依赖的正常细胞调控机制被抑制以及端粒酶活性增强有关]18[。

竭诚为您提供优质文档/双击可除细胞凋亡实验报告篇一：实验14细胞凋亡的诱导和检测实验14细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。

细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。

细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。

凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。

凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。

凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。

细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DnA被降解，断裂为50～300kb长的DnA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DnALadder)。

细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。

1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。

细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

表凋亡的检测方法（引自DL斯佩克特等，20XX）形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DApI时常用的一种与DnA结合的荧光染料。

借助于DApI染色，可以观察细胞核的形态变化。

（2）giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。

慢病毒载体介导SV40LT致人脐静脉内皮细胞永生化梁淑丽;聂勇战;吴开春;薛增福;吕艳香;刘洋;梁树辉;殷继鹏;窦维佳;赵晓迪;赵宏喜【摘要】为成功分离与鉴定人原代脐静脉内皮细胞,用猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系.将含SV40LT cDNA片段的慢病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养.通过形态、细胞免疫组织化学、RT-PCR及管状成形试验进行原代及转染后细胞形态学和功能学鉴定及检测SV40大T抗原表达.结果SV40LT转染后的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形或短梭状,呈单层铺路石状镶嵌排列.特异性表达Ⅷ因子、KDR、SV40LT表达,并具有营状成型能力.说明成功分离与鉴定永生化的脐静脉内皮细胞系,为后续血管靶向治疗奠定了基础.%To immortalize human umbilical vein endothelial cells( HUVECs) by ectopic expression of Simian Virus 40 Large T ( SV40LT) antigen without malignant transformation. Lentivirus that contained SV40LT cDNA were transfected into the primary HUVECs. Light microscope and scanning electron microscope were used to observe the morphology and growth of the cells . The expression of factor Ⅷ . KDR and SV40LT were detected by immunofluorescence and RT-PCR. Tube formation assay was perfected to verify the functions of the primary HUVECs and the transfected cells. It is resulted that the immortalized cells were homogenous and displayed a characteristic ovoid nucleus. Immunofluorescence staining and RT-PCR showed the immortalized cells specifically expressed Ⅷ factor.KDR andSV40 LT. The transfected cells also keep the ability of tube formation. It is conclused that is identified and immortalized human umbilical vein endothelial cells by SV40 large T for future study.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2011(011)011【总页数】5页(P2423-2427)【关键词】内皮;血管;永生化;细胞;SV40LT【作者】梁淑丽;聂勇战;吴开春;薛增福;吕艳香;刘洋;梁树辉;殷继鹏;窦维佳;赵晓迪;赵宏喜【作者单位】第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;西安市第五医院,西安,710082;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学唐都医院妇产科,西安,710038【正文语种】中文【中图分类】R732.2肿瘤的血管靶向治疗一直是肿瘤研究领域的热点,其体外模型多采用原代脐静脉内皮细胞。

细胞永生化的化学诱导方法及应用研究进展Chemical induction of cellular immortalization is a fascinating topic in the field of biology and medicine. It involves manipulating cellular processes and pathways to achieve the indefinite replication and survival of cells. This approach has important implications for regenerative medicine, cancer research, and aging-related studies.One commonly used method to induce cellular immortalization is through the activation of telomerase, an enzyme that maintains the length of telomeres, the protective caps at the ends of chromosomes. Telomeres shorten with each cell division, eventually leading to cellular senescence and death. By artificially activating telomerase, cells can bypass this natural limit and continue dividing indefinitely.Another approach is the manipulation of key signaling pathways involved in cell cycle regulation and apoptosis. By inhibiting the pathways that promote cell death or activating those that promote cell division, researchers can prolong the lifespan of cells and prevent their natural decline.Chemical inducers, such as small molecules or drugs, are often used to modulate these cellular processes. These inducers target specific molecules or pathways, either directly or indirectly, to achieve the desired effect. For example, certain compounds can activate telomerase or inhibit proteins involved in cell death signaling.However, it is important to note that cellular immortalization is a double-edged sword. While it has potential benefits in regenerative medicine and disease research, it can also lead to uncontrolled cell growth and the development of cancer. Therefore, strict regulation and careful monitoring are necessary when using chemical induction methods for cellular immortalization.中文回答:化学诱导法细胞永生化是生物学和医学领域中一个引人入胜的课题。

２０１２年９月内蒙古大学学报（自然科学版）Ｓｅｐｔ．２０１２第４３卷第５期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４３Ｎｏ．５ 文章编号：１０００－１６３８（２０１２）０５－０５０２－０７ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系＊庞永胜１，２，何　维１，２，王　浩１，２，崔莲仙１，２（１．中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５；２．北京协和医学院基础学院免疫学系，北京１００００５）摘要：利用电击将外源基因ｈＴＥＲＴ与ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒共转染人"#Ｔ细胞，建立可诱导的永生化人"#Ｔ细胞系．分离人ＰＢＭＣ，体外刺激增殖后经磁珠分选纯化，然后对其进行外源ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒的共同电转染，并加入强力霉素诱导目的基因表达．电转染程序Ｔ－２３和Ｔ－２０的效率分别为３７．５％±０．９８６０％和３０．５％±０．５５９０％．经鉴定，外源ｈＴＥＲＴ基因能够整合人"#Ｔ细胞基因组中并在诱导后表达．程序Ｔ－２３的转染效率更高，强力霉素的有效诱导浓度是６００ｎｇ／ｍＬ，志愿者本人的血清更利于电转后细胞的存活．关键词：ｈＴＥＲＴ基因；人"#Ｔ细胞；永生化；电转染中图分类号：Ｒ３９２－３３ 文献标志码：Ａ 正常细胞的增殖能力是有限的，经过一定时间的增殖后，最终进入一种生长抑制状态〔１〕．已经有实验证明通过转染人端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ｈＴＥＲＴ）基因进入某些细胞系可以使这些细胞系生命周期延长或者永生化〔２－４〕，并且已经证实这些永生化细胞的核型并没有发生变化〔２〕．甚至使用ｈＴＥＲＴ永生化的细胞进行临床治疗已经证明可行〔５〕．对悬浮细胞使用病毒感染等永生化方法较难成功，而电转染方法虽然存在着电击后细胞死亡较多等缺点，但是其适用范围广，转染效率高的优点使之可以应用于难转染的悬浮细胞〔６－７〕．"#Ｔ细胞作为重要的淋巴细胞，目前仍没有永生化的细胞系，实验中使用的"#Ｔ细胞均由健康志愿者或者活体动物获得，这不仅消耗了较大的人力和物力，而且由于不同个体的"#Ｔ细胞存在个体间差异，往往导致使用不同个体的"#Ｔ细胞所得到的实验结果差异很大．为了更好地研究和应用"#Ｔ细胞，制备永生化的"#Ｔ细胞就显得很有必要．但是考虑到电转染进去的基因很可能会改变"#Ｔ细胞原本的生物学性状，如果能够在需要的时候阻止该基因的表达则可以使之恢复其原本的生物学性状．本研究以人"#Ｔ细胞作为研究对象，试图通过电转染外源性ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒进入人外周血"#Ｔ细胞，进而通过强力霉素的加入与否来控制ｈＴＥＲＴ基因表达来获得可调控的永生化人"#Ｔ细胞系．１　实验１．１　质粒、菌株与细胞质粒ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ、ｐＲｅｖＴＲＥ载体和ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ载体均购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５$细胞由本实验室保存；人外周静脉血细胞从健康志愿者获得．＊收稿日期：２０１１－１２－０８；修回日期：２０１２－０３－２６基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０４００３９１）作者简介：庞永胜（１９８２－），男，河南省漯河市人，２００８级硕士研究生．Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒａ．ｒａｎｇｅ＠１６３．ｃｏｍ．通信作者：何　维（１９５５－），男，黑龙江人，教授，博士，博士生导师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｗｅｉ＠ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ．１．２　电转染相关设备及试剂德国Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ　ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒⅠ电转染仪器属于中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室．电转染试剂盒Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ购自Ｌｏｎｚａ公司．１．３　酶、其他试剂与材料ＨｉｎｄⅢ、ＣｌａⅠ等限制性内切酶购自ＮＥＢ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ基因组提取试剂盒和ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００、ＤＬ１００００及ＤＬ１５０００均购自ＴａＫａ－Ｒａ公司；ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体以及ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体均购自ＢＤ公司；注射用重组人白介素２购自北京瑞得合通药业有限公司；"#Ｔ细胞分选试剂盒购自Ｍｉｌｔｅｎｙ公司；ＲＰＭＩ－１６４０培养基是Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；新生胎牛血清是Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品；枸橼酸钠（ＡＣＤ）抗凝血液保存液购自北京红十字血液中心；人淋巴细胞分离液是中国医学科学院生物工程医学研究所产品；强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃ－ｌｉｎｅ）购自罗氏公司；ｍＲＮＡ提取试剂盒购自Ｑｉａｇｅｎ公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自威格拉斯生物公司；其他试剂均为国产分析纯．实验中所用引物如表１所示．表１　ＰＣＲ所用引物Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＰＣＲ引物名称引物序列引物长度ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１　５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴ－３’２２ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｒ－１　５’－ＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＡ－３’３０ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｆ－２　５’－ＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡ－３’２３ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｒ－２　５’－ＴＣＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴ－３’３７ｂｐ１．４　方法１．４．１　构建载体ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ首先对载体ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ利用ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切后胶回收ｈＴＥＲＴ基因，同时对空载体ｐＲｅｖＴＲＥ进行ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接并转化到Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α感受态细胞，挑选阳性克隆进行双酶切鉴定并测序．１．４．２　Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞ＰＢＭＣ从健康志愿者抽取新鲜外周静脉血６０ｍＬ，利用枸橼酸钠（ＡＣＤ）血液保存液抗凝后用６０ｍＬＨＡＮＫｓ缓冲液１∶１稀释；先将１５ｍＬ淋巴细胞分离液加到５０ｍＬ离心管中，随后用滴管贴壁缓慢将稀释血液按照稀释血液：淋巴细胞分离液＝２∶１的比例加入３０ｍＬ稀释血液，勿打乱液层界面；１９５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１５ｍｉｎ；离心后用吸管小心吸取白膜层到新的离心管；加入３０ｍＬ灭菌ＰＢＳ，混匀后进行细胞计数，然后１６００ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；弃上清，再加入１５ｍＬ　ＰＢＳ，混匀后１３５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；小心完全吸弃上清，留下的ＰＢＭＣ用于接下来磁珠分选"#Ｔ细胞．１．４．３　人"#Ｔ细胞的扩增用无血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基将上一步的人ＰＢＭＣ细胞重悬后移入到已包被ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体的２４孔板中，然后加入等量含２０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基和重组人白介素－２，在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养１周后用于分选及电转染．１．４．４　磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞按照Ｍｉｌｔｅｎｙ公司的人"#Ｔ细胞磁珠分选操作步骤获得人"#Ｔ细胞，细胞经ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体染色后进行流式分析．将分选后的人"#Ｔ细胞在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养２４ｈ．１．４．５　电转染人"#Ｔ细胞及电转染条件的优化１．４．５．１　电转染人"#Ｔ细胞根据Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?Ｋｉｔ的操作说明进行电转染：将电转染溶液和补充溶液按４．５∶１的比例混合，４℃存放，作为电转染混合溶液，每个反应用该混合液３０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系１００μＬ．在１２孔板中加入含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基２ｍＬ／孔，放入３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内预温至少３０ｍｉｎ．取４×１０６个"#Ｔ细胞用于１个电转染反应；将２．５μｇ去内毒素高浓度（＞１μｇ／μＬ）的质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ和２．５μｇ调控载体ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ分别加到预冷的１００μＬ电转染混合溶液中，同时设立阳性对照组ｐｍａｘＧＦＰ质粒和阴性对照组ｐＲｅｖＴＲＥ载体；具体分组见表２．表２　电转染实验分组Ｔａｂｌｅ　２　Ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ程序阳性对照阴性对照实验组１、２和３Ｔ２３ｐｍａｘＧＦＰ　ｐＲｅｖＴＲＥ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎＴ２０ｐｍａｘＧＦＰ　ｐＲｅｖＴＲＥ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎ 在１５ｍｉｎ内将上述电转染样品分别使用电转染程序Ｔ－２３和Ｔ－２０（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?ⅠＤｅｖｉｃｅ）进行电转染，电转染后迅速缓慢加入５００μＬ于３７℃孵箱内预热的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，小心将电转杯内的细胞轻柔地转移到含有１．５ｍＬ预热ＲＰＭＩ－１６４０培养基的１２孔板中（总体积为２ｍＬ）并且避免反复吹打细胞．然后将１２孔板置于３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内孵育．培养４．５ｈ时在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ表达情况并用流式细胞仪检测电转染效率；培养２４ｈ后加入强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃ－ｌｉｎｅ）来诱导ｈＴＥＲＴ基因表达；继续培养４８ｈ后进行鉴定．１．４．５．２　电转染条件的优化选择使用流式细胞仪检测ＧＦＰ的表达情况，来比较Ｔ－２３和Ｔ－２０这两种不同电转染程序的转染效率；在电击后对细胞进行培养时，比较分别使用１０％ＦＢＳ与１０％志愿者本人血清所带来的不同培养效果．１．４．６　强力霉素诱导ｈＴＥＲＴ表达及诱导条件的优化１．４．６．１　提取人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定ｈＴＥＲＴ基因按照ＴａＫａＲａ公司的细胞基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒的步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的基因组ＤＮＡ，利用引物ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－１（表１）进行ＰＣＲ，来鉴定ｈＴＥＲＴ基因是否整合到基因组ＤＮＡ中．１．４．６．２　提取人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定ｈＴＥＲＴ基因的表达按照Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＮｅａｓｙ?Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ的ＲＮｅａｓｙ?Ｍｉｎｉ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１０）中的操作步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的ＲＮＡ；经ＲＴ－ＰＣＲ证实ｈＴＥＲＴ基因表达．ＰＣＲ所用引物为ｈＴＥＲＴ－Ｆ－２和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－２（表１）．另外使用一对引物的原因在于：ｈＴＥＲＴ基因ＧＣ含量高，基因片段长，又要进行较为复杂的操作，所以针对该基因的３’端设计了这样一对引物．１．４．６．３　强力霉素诱导表达浓度的优化在电转染２４ｈ后，分别加入以下不同浓度的强力霉素：０，１００ｎｇ／ｍＬ，２００ｎｇ／ｍＬ，４００ｎｇ／ｍＬ，６００ｎｇ／ｍＬ，８００ｎｇ／ｍＬ，１０００ｎｇ／ｍＬ，继续培养４８ｈ后进行鉴定，根据鉴定结果来判断诱导人"#Ｔ细胞表达ｈＴＥＲＴ的最适合强力霉素浓度，从而优化诱导表达条件．Ｍ：ＤＬ１００００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１，２和３：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒经ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切鉴定图１　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒的鉴定Ｆｉｇ．１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴｖｅｃｔｏｒ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ４０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年２　结果与讨论２．１　重组质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ的鉴定双酶切结果表明（图１），目的基因ｈＴＥＲＴ已克隆至ｐＲｅｖＴＲＥ载体中，基因插入方向正确，测序结果亦证实目的基因序列３３９９ｂｐ，大小准确无误．２．２　流式细胞术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞的效果经过７天的刺激扩增，人"#Ｔ细胞的比例提高到５２．３％；经过磁珠阳性分选纯化获得了纯度为８５％的人"#Ｔ细胞（图２）．Ａ：分选前人"#Ｔ细胞所占比例；Ｂ：分选后人"#Ｔ细胞所占比例图２　流式技术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞Ｆｉｇ．２　Ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｓｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ２．３　利用荧光显微镜和流式细胞仪分析人"#Ｔ细胞的电转染效率电转染的人"#Ｔ细胞使用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基在３７℃，５％ＣＯ２孵箱内培养４．５ｈ后，在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ的表达情况（图３）．Ａ．ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｍａｇｅ；Ｂ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｍａｇｅ图３　电转染后培养４．５ｈ时人"#Ｔ细胞阳性对照组中ＧＦＰ的表达情况Ｆｉｇ．３　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　４．５ｈａｆｔｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ培养４．５ｈ后收取人"#Ｔ细胞，用ＰＥ标记的抗"#ＴＣＲ抗体进行流式染色，用流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率（图４）．２．４　电转染人"#Ｔ细胞程序的优化统计学分析结果表明，在其他电转染条件相同的情况下，人"#Ｔ细胞使用电转染程序Ｔ－２３时的电转染效率为３７．５％±０．９８６０％，使用电转染程序Ｔ－２０时的电转染效率为３０．５％±０．５５９０％，两种电转染程序的转染效率存在统计学显著性差异．２．５　电转染后对人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达情况进行鉴定在人"#Ｔ细胞电转染ｈＴＥＲＴ基因４８ｈ后，也即经强力霉素诱导表２４ｈ后，分别提取基因组５０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系ＤＮＡ进行ＰＣＲ和提取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ．如图５所示，经琼脂糖凝胶电泳发现条带分子量大小与预期相同．该鉴定结果表明，在电转染并诱导后的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ中能够检测到ｈＴＥＲＴ基因及其转录产物的存在．１．ＰＥ－ａｎｔｉ－"#ＴＣＲ抗体；２．程序Ｔ－２３的ＧＦＰ表达水平；３．程序Ｔ－２０的ＧＦＰ表达水平图４　流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率Ｆｉｇ．４　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｆｆｉｃｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．鉴定人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因．Ｍ１：ＤＬ１００００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１，２：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；３：未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；４：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照．Ｂ．鉴定人"#Ｔ细胞ＲＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因转录产物．Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１：未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ；２：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照；３－９：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ．图５　鉴定人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达产物Ｆｉｇ．５　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈＴＥＲＴａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ２．６　讨论原代细胞难以长期培养一直都是原代细胞研究的一个瓶颈．长期以来，研究者一直试图对原代细胞进行永生化．目前对原代细胞进行永生化的方法主要有：１．肿瘤标本直接培养建系法．采用原代肿瘤细胞体外培养建立永生化的细胞系；２．生物学方法．如通过病毒感染使原代正常细胞永生化．Ｂ淋巴细胞通过被ＥＢＶ病毒感染就可以实现永生化；３．物理学方法．将外源永生化相关基因直接导入原代正常细胞使之永生．电转染即是一种通过电击造成细胞膜形成空隙而使外源基因进入细胞的方法．因为该方法有着转染效率高、适用范围广的特点，所以本实验小组对于转染难度较大的人"#Ｔ细胞采用电转染方法使之永生化．本研究使用目前文献报道较多的ＬＯＮＺＡ公司的电转染仪器进行电转染，将可以抑制端粒缩短的人端粒酶逆转录酶亚单位基因ｈＴＥＲＴ和Ｔｅｔ－ｏｎ诱导表达系统共同导入人"#Ｔ细胞，经强力霉素６０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年诱导后，ｈＴＥＲＴ基因能够表达．本实验目前只在ＤＮＡ和ＲＮＡ两个水平上进行了初步鉴定，并且对电转染后细胞的生长状态只作了初步观察，正常未经转染的人"#Ｔ细胞，经ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ的抗体体外刺激后，能够在体外连续培养至２８天，以后便迅速凋亡，无细胞克隆团存在．在本实验中，经电转染的人"#Ｔ细胞在体外可以连续培养至第５６天，并且在大量凋亡细胞附近有明显的细胞克隆团存在，说明这些细胞的生长状态可能发生了一定的变化．本实验对蛋白水平转录产物的鉴定还未完成，对转染后细胞的核型及生长曲线等生理指标尚未进行鉴定，并且在去除强力霉素的诱导后该基因是否停止表达还有待进一步鉴定．通过使用文献报道的两个不同的电转染程序、设置不同的强力霉素诱导浓度、选择电转染后细胞培养所用血清类型及浓度大小，本实验小组认为对人"#Ｔ细胞进行电转染的优化条件是：优先使用Ｔ－２３电转染程序，利用浓度为６００ｎｇ／ｍＬ的强力霉素诱导表达和使用１０％的志愿者本人的血清进行培养．在电转染刚刚结束时使用志愿者本人的血清来培养细胞，更利于经受电击创伤的细胞存活下来，细胞的死亡率更低，生长状态更好．这与文献中报道的相似〔８〕．本研究中使用的Ｔｅｔ－ｏｎ诱导表达系统为以后人"#Ｔ细胞的临床应用打下了基础；此外，本研究为原代淋巴细胞的电转染研究提供了一定借鉴．３　结论用电转染方法可以将外源ｈＴＥＲＴ基因转染入人"#Ｔ细胞，电转染程序Ｔ－２３比Ｔ－２０的转染效率更高；经鉴定，转入的基因能够整合到人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中，并且在６００ｎｇ／ｍＬ强力霉素的诱导下可以有效表达．在培养电转染后的人"#Ｔ细胞时，使用１０％志愿者本人的血清比使用１０％胎牛血清更有利于电击后细胞的存活．本实验为以后使用电转染方法建立人"#Ｔ细胞永生化细胞系奠定了基础．参考文献：［１］　Ｈａｙｆｌｉｃｋ　Ｌ，Ｈａｙｆｌｉｃｋ　Ｐ　Ｓ，Ｍｏｏｒｈｅａｄ．Ｔｈｅ　ｓｅｒｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ，１９６１，２５（３）：５８５－６２１．［２］　Ｂｏｄｎａｒ　Ａ　Ｇ，Ｏｕｅｌｅｔｔｅ　Ｍ，Ｆｒｏｌｋｉｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ　ｂｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｉｎｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９（５３４９）：３４９－３５２．［３］　Ｋｉｔａｇａｗａ　Ｍａｓａｅ，Ｏｇａｗａ　Ｉｋｕｋｏ，Ｓｈｉｍａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ　ａｄｅｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓｂｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈＴＥＲＴ　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７，３１（２）：３３９－３４４．［４］　刘学强，杨辉，何家全，等．ｈＴＥＲＴ基因转染人神经干细胞向永生化细胞转变实验研究［Ｊ］．中华神经外科疾病研究杂志，２００６，５（１）：１３－１５．［５］　Ｈｕａｎｇ　Ｑｉｎ，Ｃｈｅｎ　Ｍｅｉｚｈｅｎ，Ｌｉａｎｇ　Ｓｉｔａｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ－ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ－ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ　Ａｇｅｉｎｇ　Ｄｅｖ，２００７，１２８（１）：２５－３０．［６］　Ｃｈｕ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈａｙａｋａｗａ　Ｈｉｒｏｓｈｉ，Ｂｅｒｇ　Ｐａｕｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５（３）：１３１１－２６．［７］　王伟佳，张秀明，王前，等．急性早幼粒白血病ＨＬ６０细胞电转染条件的优化［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１０，３０（４）：７７－８２．［８］　Ｓｃｈｎｏｏｒ　Ｍ，Ｂｕｅｒｓ　Ｉ，Ｓｉｅｔｍａｎｎ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＨＰ－１ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＩＭ，２００９，３４４（２）：１０９－１１５．（责任编委　李光鹏）７０５第５期庞永胜等　ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　Ｈｕｍａｎ"#Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈｈＴＥＲＴＧｅｎｅｓ　ｂｙ　ＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＰＡＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＨＥ　Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｈａｏ，ＣＵＩ　Ｌｉａｎ－ｘｉａｎ（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍ　ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｐＴｅｔ－ｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ　ＰＢＭＣ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｄｏ－ｎｏｒｓ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｏｒ　７ｄａｙｓ，ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ．Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｕｒｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｅｌｅｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｐＴｅｔ－ｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ　ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ．Ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　３７．５％±０．９８６０％（ｐｒｏｇｒａｍ　Ｔ－２３）ａｎｄ　３０．５％±０．５５９０％（ｐｒｏｇｒａｍ　Ｔ－２０）ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＧＦＰｗｈｅｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　４．５ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ　ａｎｄＲＴ－ＰＣＲ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ，ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｏｆｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｔ－２３ｗａｓ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｃｈｏｉｃｅ　ｔｏ　ｇｅｔ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｆｆｉ－ｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｇｒａｍ　Ｔ－２０．Ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　６００ｎｇ／ｍＬ．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｏｎｏｒ’ｓｓｅｒｕｍ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｍａｙ　ｈｅｌｐ　ｔｈｅｍ　ｔｏ　ｓｕｒｖｉｖｅ　ａｆｔｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅ　ｄａｔａ　ｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔ　ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｃａｎ　ｂｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈＴＥＲＴｇｅｎｅ；ｈｕｍａｎ"#Ｔ　ｃｅｌｌ；ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ８０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年。

8 Experimental research | 试验研究0 引言在我国养殖业和野生动物保护范围中，水禽占有重要的一席之地，通常运用传代细胞系研究病毒感染并制作抗体或疫苗。

在水禽方面，相关论文较为稀少，在养殖鹅的疾病中，特别是星状病毒所引起的禽类痛风[1]上还没有较为成熟的研究。

大部分病毒都会有其特定的亲和的组织部位，每种病原对不同生物的组织亲和性也不同，禽类中目前研究较为完善的鸡细胞系与鹅类疾病的研究并不适配，同时由于没有SPF 鹅胚导致分离病毒时总会被母源抗体影响难以进一步分离病毒，是研发疫苗的一道难关。

利用SV40-LT 质粒转导细胞，SV40病毒即为猿猴空泡病毒40，源于恒河猿猴的肾脏细胞，人们发现sv40病毒是一种小DNA 肿瘤病毒，根据相关文献介绍，SV40病毒可转化细胞的功能，即进入到细胞中可使细胞转化并使增殖能力加强，部分细胞获得无限增殖[2]。

相关研究表明，SV40病毒的细胞转化特性主要与早期蛋白T 抗原有关，SV40-LT 抗原通过与肿瘤抑制基因的产物相结合使其失活来介导细胞的永生化[3]，因此SV40LT 抗原被广泛用于肿瘤发病机制的研究和转基因动物模型的建立，且由于其具有较强的细胞转化功能，常被用来建立永生化细胞系[4-5]。

研究将SV40-LT 抗原基因转导进入基金项目：利用SV40-LT 载体构建水禽肾或胚胎成纤维细胞系，项目编号：202010225017作者简介：李清欣（1997-），女，山东菏泽人，在读硕士研究生，研究方向：野生动物传染病。

通信作者：张彦龙（1968-），男，吉林长春人，副教授，博士，研究方向：野生动物传染病。

利用SV40-LT载体构建鹅肾细胞系李清欣，颜安，苏明欣，况思溶，张彦龙（东北林业大学，哈尔滨 150040）摘要：近年我国的水禽养殖业迅速发展，但对于鸭鹅等水禽的疾病防控主要专注于禽流感、新城疫等疾病。

自2017年起于我国养鹅场突然爆发的雏鹅痛风至死亡等的疾病，由于缺乏适宜的实验室宿主系统，对病毒的分离鉴定及后续疫苗的开发产生深远影响。

永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立与鉴定永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立与鉴定第一章：引言近年来，研究人员对于细胞系的建立和鉴定日益重视。

其中，动物细胞系的建立对于动物发育、疾病研究以及药物筛选具有重要意义。

本文的研究目的是建立和鉴定一种永生化的绵羊子宫内膜上皮细胞系，为未来相关领域的研究提供有效的实验模型。

第二章：材料与方法2.1 绵羊子宫内膜采集选取健康成年绵羊，通过外科手术方法采集子宫内膜组织。

2.2 细胞培养基配制配制含有必需营养物质（如氨基酸、维生素）、血清和抗生素的培养基。

2.3 细胞培养条件将取得的绵羊子宫内膜组织在无菌条件下切割成小块，通过消化酶（如胰蛋白酶）处理，获得单个细胞。

将细胞转移到培养基中，定期更换培养基，保持适宜的培养条件（37℃，5% CO2）等。

2.4 细胞增殖检测采用细胞计数、增殖曲线和克隆形成实验等方法监测细胞的增殖情况。

2.5 细胞生长状态观察通过显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞外形、细胞表面特征等。

2.6 细胞种类鉴定通过荧光染料特异性染色、免疫细胞化学染色等方法检测细胞的类型，包括上皮细胞标志物等。

2.7 永生化细胞系的建立通过引入适当的操纵基因，如转染TERT基因等，使细胞系具备永生化的特征。

2.8 发育功能鉴定通过细胞培养体外诱导绵羊永生化细胞系向多功能干细胞方向发展，观察其分化潜能。

第三章：结果与讨论3.1 绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立经过一段时间的细胞培养，绵羊子宫内膜上皮细胞系成功建立。

3.2 细胞生长状态和增殖特性绵羊子宫内膜上皮细胞系在培养基中呈现出良好的生长状态和增殖特性。

3.3 细胞类型鉴定通过荧光染料标记和免疫细胞化学染色等技术，我们鉴定出绵羊子宫内膜上皮细胞系的特异性。

3.4 永生化细胞系的建立通过转染TERT基因，绵羊子宫内膜上皮细胞系成功实现了永生化。

3.5 发育功能鉴定绵羊子宫内膜上皮细胞系在体外诱导实验中，展示了多功能干细胞的潜能。

细胞永生化处理方法引言细胞永生化处理方法是指通过一系列的技术手段，使细胞能够长时间保持活力和增殖能力，从而实现细胞的永生化。

这项技术在生物医学研究、药物开发和组织工程等领域具有重要的应用价值。

本文将介绍几种常见的细胞永生化处理方法，并分析它们的优缺点。

方法一：基因修饰基因修饰是一种常见的细胞永生化处理方法。

通过改变特定基因的表达或功能，可以延长细胞的寿命和增加其增殖能力。

常用的基因修饰方法包括下调抑制性基因、上调促进性基因以及改变染色体结构等。

下调抑制性基因是一种常见的策略。

例如，通过RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统靶向沉默p53等抑制性基因，可以减少细胞凋亡和老化现象，延长细胞寿命。

上调促进性基因也是一种有效的方法。

例如，通过转染特定基因或使用激活子等技术，可以增加细胞的增殖能力和代谢活性，从而延长细胞寿命。

改变染色体结构是另一种常见的基因修饰方法。

例如，通过转座子或合成染色体等技术，可以改变细胞染色体的结构和组成，提高其稳定性和抗衰老能力。

然而，基因修饰方法存在一些局限性。

首先，基因修饰可能引发不可预测的副作用或导致细胞功能异常。

其次，基因修饰需要精确的操作和复杂的技术支持，对于一些非专业人员来说较为困难。

方法二：药物干预药物干预是另一种常用的细胞永生化处理方法。

通过使用特定药物或化合物，可以调节细胞的代谢、增殖和凋亡等过程，从而延长细胞寿命。

一种常用的药物干预方法是使用抗衰老剂。

目前已经发现了多种具有抗衰老效果的化合物，如雷帕霉素、二甲双胍等。

这些化合物可以通过激活特定信号通路或改变细胞内环境来延长细胞的寿命。

另一种常见的药物干预方法是使用激素。

例如，雌激素在一些细胞中具有促进增殖和减少凋亡的作用，可以延长细胞寿命。

然而，激素使用需要注意剂量和时间的控制，以避免不良反应和副作用。

虽然药物干预方法相对简单易行，但也存在一些问题。

首先，不同细胞对药物的敏感性存在差异，需要进行个体化处理。