双酶切实验

目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。

回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。

注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。

2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。

铺板前后注意用吹风机吹干。

3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。

双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。

双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。

双酶切实验原理
双酶切实验是一种用于确定DNA序列的特定区域的酶切位点
的实验方法。

它基于两个限制性内切酶共同作用于DNA分子，产生不同的酶切位点的原理。

在双酶切实验中，首先选择两个具有不同的限制性内切酶，这两个酶分别具有不同的酶切位点序列。

然后，将待检测的
DNA样品与这两个限制性内切酶一起反应，使其在特定的条
件下与DNA发生切割。

由于每个限制性内切酶在特定的酶切位点周围识别并切割DNA，因此在双酶切实验中，如果DNA序列中同时存在这两
个酶切位点，那么DNA分子将在两个酶切位点处被切割成三
个部分。

如果DNA序列中只存在其中一个酶切位点，DNA分子将在该位点处被切割成两个部分。

如果DNA序列中不存在
这两个酶切位点，DNA分子将不被切割。

实验结束后，通过电泳将不同长度的DNA片段分离出来，并
通过染色或荧光等方法可视化这些DNA片段。

通过观察
DNA片段的迁移距离和相对大小，可以确定DNA序列的特定区域是否存在以上述的两个酶切位点。

从而对DNA序列进行
分析和确认。

值得注意的是，双酶切实验的成功与否取决于待检测的DNA
序列中是否存在与所选择的限制性内切酶的酶切位点匹配的序列。

如果DNA序列中不存在所选酶切位点，DNA将不会被切割，从而无法进行相关分析和确认。

因此，在进行双酶切实验
之前，需要进行相关的DNA序列分析和预测，以确定所选酶切位点是否适用于目标DNA序列的研究。

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。

现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。

选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。

NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。

NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。

能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。

由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。

分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。

在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。

这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。

由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。

通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

酶切技术 - 限制性内切酶PCR产物的NcoI限制性内切酶酶切鉴定限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。

2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。

3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。

二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。

2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。

3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。

4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。

一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。

5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。

6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。

三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。

合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。

2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。

3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。

同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。

4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。

同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。

5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。

四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。

双酶切的原理及应用1. 前言在分子生物学和基因工程领域，DNA分子的切割是一项重要的实验操作。

传统的DNA切割方法主要采用单酶切割，即使用一种特定的限制性内切酶来切割DNA分子。

然而，有时候使用单一酶切割不够灵活或效果不好。

为了解决这个问题，科学家们提出了双酶切的方法，即同时使用两种酶来切割DNA分子。

在本文中，我们将介绍双酶切的原理及其应用。

2. 双酶切的原理双酶切的原理基于两种不同的DNA限制性内切酶对DNA分子上的特定序列进行切割。

这两种限制性内切酶在DNA分子上分别识别并切割两个不同的序列。

在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。

3. 双酶切的应用双酶切在分子生物学和基因工程领域有着广泛的应用。

以下是一些双酶切的常见应用：3.1 DNA片段克隆双酶切可以用于DNA片段的克隆。

在这种应用中，将目标DNA分子与两种限制性内切酶一起消化，并将两种酶的切割产物与载体DNA连接，形成重组DNA分子。

通过将重组DNA转化到宿主细胞中，可以将目标DNA片段克隆到宿主细胞中进行后续的研究。

3.2 DNA测序双酶切也可以用于DNA测序。

在传统的测序方法中，需要将目标DNA序列分割成多个小片段。

使用两种不同的限制性内切酶，可以将目标DNA序列切割成多个重叠的片段，并在测序过程中获得更加准确的序列信息。

3.3 基因组编辑双酶切在基因组编辑中也有重要的应用。

例如，CRISPR-Cas9技术就是一种常用的基因组编辑工具，它使用CRISPR与Cas9酶组合来识别和切割目标DNA序列。

通过将Cas9与另一种限制性内切酶组合使用，可以实现更精确的基因组编辑。

3.4 DNA分析双酶切也可用于DNA分析中。

比如，在基因检测中，采用双酶切可以对目标DNA中的特定基因序列进行切割，通过分析切割产物可以确定目标基因是否存在。

4. 双酶切的优势相较于单酶切，双酶切具有以下优势：•更灵活：使用两种不同的限制性内切酶，可以选择更多的切割位点，使实验更灵活多样化。

双酶切实验原理双酶切实验是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA序列。

它基于限制性内切酶的特异性切割DNA的原理，结合凝胶电泳技术，可以对DNA进行特异性切割和分离，从而获得所需的DNA片段。

本文将介绍双酶切实验的原理及其操作步骤。

1.双酶切实验原理。

双酶切实验的原理基于限制性内切酶对DNA的特异性切割。

限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割的酶，它们能够将DNA分子切割成具有特定序列的片段。

在双酶切实验中，通常会使用两种不同的限制性内切酶，它们分别识别DNA的不同序列，并在这些序列上进行切割。

通过这种双酶切割的方式，可以获得具有特定序列的DNA片段。

2.双酶切实验操作步骤。

双酶切实验的操作步骤主要包括DNA提取、酶切反应、凝胶电泳和DNA可视化等步骤。

首先，需要从样品中提取DNA。

提取的DNA可以是来自细菌、动植物或其他生物体的基因组DNA，也可以是从质粒或病毒中提取的DNA。

提取的DNA需要经过纯化和定量后，才能进行后续的操作。

接下来，将提取的DNA与两种限制性内切酶和相应的缓冲液混合，进行酶切反应。

酶切反应的条件需要根据所使用的酶的特性来确定，包括反应温度、反应时间和反应缓冲液的配制等。

酶切反应完成后，需要对反应产物进行电泳分离。

在凝胶电泳中，将酶切反应产物加载到琼脂糖凝胶上，通电进行分离。

由于DNA分子在电场中具有不同的迁移速度，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。

分离完成后，可以通过染色或荧光标记等方法对DNA进行可视化。

3.双酶切实验的应用。

双酶切实验在分子生物学研究中有着广泛的应用。

它可以用于分析DNA序列的特异性，鉴定基因型、进行基因工程、构建基因库等。

通过双酶切实验，可以获得特定序列的DNA片段，为后续的克隆、测序和分析提供了重要的基础。

总的来说，双酶切实验是一种重要的分子生物学技术，它基于限制性内切酶的特异性切割原理，能够对DNA进行特异性切割和分离。

重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。

通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。

重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。

酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。

2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。

通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。

3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。

酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。

通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。

这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。

PVX204双酶切的实验方案
质粒PVX204的大小约为12Kb ，双酶切之后，两个片段的大小分别为约11Kb 、700bp 。

琼脂糖凝胶电泳时，胶的浓度为1.2%，必须为新配置的胶。

因为700bp 的片段较小，在电泳时，每隔15min 拍张照片，拍好的照片保存在电脑：E 盘—孔令保—PVX204。

保存的图片名称为：年—月—日—胶跑的时间，例如:2011-03-29-15min ,依次类推。

酶切体系：
酶切时，按照上面的3个酶切体系，每个酶切体系切1管，共切3管。

PVX204质粒的溶解：取一个提取的质粒的EP 管，向其中加入10μl 的灭菌水，盖上EP 管盖,过10min 后，用枪将其混匀；用枪将溶解的10μl 吸取出来加入到另一个冻干保存的PVX204EP 管中，盖上EP 管盖,过
10min 后，用枪将其混匀；用来做酶切反应。

一共要用溶解6管冻干保存的PVX204，将6管溶解成30μl ，共3个EP 管。