酶切

酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。

DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。

当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。

如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。

若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。

若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。

酶切验证（Enzyme Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于确定DNA片段的长度、验证DNA克隆以及判断基因的存在与否。

该技术利用酶切酶（restriction enzyme）的特异性作用，将DNA分子切割成特定大小的片段，并通过其长度的分离和测定来验证特定的DNA序列。

酶切验证的基本原理是通过酶切酶的作用将DNA分子切割成特定的片段，然后将这些片段进行电泳分离和测定。

DNA双链由核苷酸组成，而酶切酶则能够识别并切割具有特定核酸序列的DNA链。

不同的酶切酶具有不同的核酸识别和切割特异性，因此可以生成不同大小的DNA片段。

酶切验证的步骤主要包括：酶切反应、电泳分离、染色可视化和测定片段长度四个步骤。

1.酶切反应：首先需要将要测试的DNA待测片段与适当的酶切酶一起在适当的缓冲液中反应。

酶切酶根据其切割特异性，在特定的核酸序列附近切割DNA 链。

具体而言，酶切酶识别并切割具有合适酶切位点的DNA序列，将双链DNA切割成两个特定的片段。

这样，一个长DNA片段可以被切割成多个短片段。

2.电泳分离：酶切反应完成后，需要将切割得到的DNA片段进行电泳分离。

电泳是一种基于DNA片段大小和电荷的分离技术。

在电泳过程中，DNA片段按照大小被推进电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶（或者其他介质）的孔隙中。

由于琼脂糖凝胶的孔径大小和浓度不同，较短的DNA片段能够快速穿过凝胶，而较长的DNA片段则较慢。

3.染色可视化：完成电泳后，需要对DNA片段进行染色。

最常用的染色方法是亚甲基蓝染色，在电泳上渗透亚甲基蓝染色溶液。

亚甲基蓝能够与DNA分子相互作用，使DNA带上颜色。

通过染色，我们可以清晰地看到DNA分子在凝胶上的迁移情况。

4.测定片段长度：最后一步是测定DNA片段的长度。

我们使用已知长度的DNA分子作为标准，通过与标准品的片段长度的比较确定待测片段的长度。

标准品的片段长度是已知的，因此可以用来确定待测片段长度。

酶切验证的主要优势在于其简单、快速和可靠。

sumo酶切条件
SUMO酶切条件可能会因酶的来源、底物和实验条件而有所不同，一般需要考虑以下几个因素：
1.酶与底物的比例：通常为1:100，即1μg酶对应
100μg底物。

2.酶切体系：通常包括融合蛋白1000μg、10x SUMO
Protease Buffer20μL、SUMO蛋白酶2μL和ddH2O （蒸馏水）定容至1000μL。

3.酶切条件：推荐在4℃下酶切过夜，用户可以根据
自己研究的目的蛋白进行摸索。

也可在25℃下酶切1h，SUMO标签的切割效率大于95%。

酶切是一项专业性较强的实验操作，需要根据实际情况进行调整和优化。

在进行酶切实验之前，建议仔细阅读酶的说明书和操作指南，严格按照实验步骤进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。

通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA.如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间(不超过16小时）也可完全反应.二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。

识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物.假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256)个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次.内切酶的产物可以是粘端的(3’或5’突出端)，也可以是平端的片段。

粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接,而所有的平端产物都可以互相连接.相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上.酶应当是最后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

酶的用量视在底物上的切割频率而定。

例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

参见目录第244和264之"切割质粒DNA”和"包埋法切割DNA”。

四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。

DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性.使用时的缓冲液浓度应为1X。

有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性.在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。

酶切原理及步骤一、酶切原理1.酶切反应酶切反应是指使用酶作为催化剂，对底物进行切割或降解的反应。

在酶切反应中，酶的活性中心与底物特异性结合，通过催化作用将底物分解成小分子片段。

2.酶切位点酶切位点是指酶与底物特异性结合的部位。

不同的酶具有不同的酶切位点，通常由特定的氨基酸序列组成。

3.酶切动力学酶切动力学描述了酶切反应的速度和底物浓度之间的关系。

在一定条件下，当底物浓度高于某一阈值时，反应速度将达到最大值。

二、酶切步骤1.酶液准备在进行酶切实验前，需要准备适量的酶液。

根据实验需求选择合适的酶种类和浓度。

通常，酶液需要在冰箱中冷藏保存。

2.样品准备将待测样品进行预处理，以便与酶液混合后进行反应。

样品处理方法因实验而异，常见的处理方法包括细胞破碎、蛋白质提取等。

3.酶切反应设置将准备好的酶液和样品混合，加入适量的缓冲液（如pH 7.4的Tris-HCl缓冲液），设置反应温度和时间。

4.酶切反应温度和时间设置根据所选酶的活性要求和实验条件，设置适宜的反应温度和时间。

通常，适宜的反应温度为37℃，反应时间因底物种类和浓度而异。

5.反应终止和产物检测在反应结束后，需要终止反应并检测产物。

常用的终止方法包括加入酚/氯仿抽提、加热或加入抑蛋白剂。

产物检测方法因实验而异，常见的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。

三、酶切实验设计1.酶种选择2.根据实验需求选择合适的酶种类。

不同的酶具有不同的特异性，需要根据目标蛋白质序列选择具有相应酶切位点的酶。

同时还需要考虑所选酶的活性、稳定性和安全性。

3.实验条件优化在进行酶切实验前，需要对实验条件进行优化。

主要包括底物浓度、缓冲液pH值、离子强度、反应温度和时间等方面的优化。

通过调整实验条件可以提高产物的产量和质量。

4.产物检测方法选择根据实验需求选择合适的产物检测方法。

常用的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。

需要根据目标产物性质选择适宜的检测方法以便于后续分析。

酶切操作流程
酶切操作又称限制酶切，是一种基因工程技术中常用的方法。

步骤如下：
1. 选取所需的限制酶，它必须能够切割待处理DNA，而不会切割其他不需要处理的DNA。

2. 准备待处理的DNA，这通常是通过PCR扩增、酵母菌基因库、人类基因库等方法获得的。

3. 按照酶制造商提供的说明书，将选定的限制酶加入待处理DNA 中。

4. 在适当的温度下，将加有限制酶的DNA溶液放置一段时间，以便酶切反应进行。

5. 检查反应产物，可以通过凝胶电泳等方法来确定切割的效果。

6. 对反应得到的DNA进行处理，如将其连接到表达载体、进行基因重组、序列测定等。

酶切操作可以用于基因工程的多个方面，如构建质粒、检查基因突变、抽取DNA等。

它的操作简单、容易操作，已广泛用于基因工程领域。

酶切后没有条带的原因
酶切后没有条带可能有多种原因，包括但不限于以下几点：
1.PCR产物问题：如果PCR产物有问题，可能导致酶切后没有条带。

这可能由于引物设计不正确、
PCR程序设置的退火温度过高或样本提取过程中出现问题。

2.电泳问题：电泳操作可能出现问题，例如电泳时间过长导致DNA跑出胶，或者制胶时出现问题，
如忘记加EB等，或加EB时胶温度过高。

3.酶切条件问题：如果酶切条件掌握不当，例如酶的活性受到影响，可能导致质粒被切碎，从而在
电泳图上无法看到条带。

4.质粒问题：质粒本身可能存在问题，如质粒上酶切位点太多导致质粒被降解为小片段，电泳时跑
出去了或是太小难以从电泳图上显示出来。

此外，如果质粒上只有一种酶的酶切位点或是其中一种或两种酶失活，或两个酶的位点非常接近，也可能导致电泳图上无法看到条带。

5.凝胶浓度问题：如果凝胶浓度过大，可能使marker（相当于阳性对照）的大条带都跑不开，导致
电泳图上无法看到条带。

要确定具体原因，可能需要进行进一步的实验和调查。

例如，可以通过重新进行PCR或酶切实验，检查电泳和制胶过程，以及确认酶的活性和酶切条件等，来找到问题的根源。

酶切注意事项嘿，朋友们！今天咱来聊聊酶切那些事儿。

酶切啊，就像是一场精细的手术，可不能马虎哟！你想想看，酶就像是一把特别的小剪刀，要在特定的地方把 DNA 咔嚓剪开。

这可不是随便乱剪就行的，要是剪错了地方，那可就糟糕啦！就好比你要剪一件衣服，得找对位置剪，不然好好的衣服不就毁了嘛。

首先呢，你得选对酶。

不同的酶有不同的脾气和喜好呢，有的喜欢这个序列，有的喜欢那个序列。

所以啊，在开始之前，一定要好好研究清楚，可别瞎选哟！这就跟找对象似的，得找个合适的，不然相处起来多别扭呀。

然后呢，反应条件也很重要。

温度啦、pH 值啦，这些都得把握好。

温度太高，酶可能就被热坏啦；温度太低，酶可能又懒得干活。

pH 值不合适的话，酶也会不高兴的哟。

这就像人一样，在舒服的环境里才愿意好好工作嘛。

还有啊，酶切的时候用量也得注意。

用少了吧，切不完全；用多了吧，又浪费。

这就跟做菜放盐似的，放少了没味道，放多了又咸得没法吃。

再有就是反应时间啦。

太短了可能没切完，太长了又怕酶把不该切的地方也给切了。

这就像跑步比赛，跑太快容易摔倒，跑太慢又赢不了比赛呀。

另外，可别小瞧了那些杂质哦。

一点点杂质都可能影响酶切的效果。

就好像一碗汤里掉进了一粒沙子，那喝起来感觉可就差远啦。

而且呀，做实验的时候一定要仔细再仔细。

别毛手毛脚的，把试剂弄洒了或者搞错了顺序，那可就前功尽弃咯。

这就像搭积木，一步错步步错呀。

总之呢，酶切虽然看似简单，里面的学问可大着呢！大家一定要认真对待，多积累经验，这样才能保证实验的成功呀。

可别不当回事儿，不然到时候哭都没地方哭去！酶切可是很重要的一步，它关系到后续的实验能不能顺利进行呢。

所以呀，大家一定要好好记住这些注意事项，让我们的酶切实验顺顺利利的，加油吧！原创不易，请尊重原创，谢谢!。

酶切不彻底的原因
酶切不彻底可能有多种原因，具体如下：
1.酶切位点不完全匹配：酶切位点是酶识别并切割DNA或RNA的特定序列。

由于序列的突变或变异，酶与酶切位点之间可能存在一定程度的不匹配，导致酶无法完全切割底物。

2.酶切条件不理想：酶的活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。

如果这些条件没有得到精确的控制，可能会影响酶的活性，导致不完全酶切。

3.酶量不足：酶量不足会导致其无法完全完成切割反应。

4.蛋白质与DNA样品结合：在某些情况下，蛋白质可能会与DNA样品结合，这可能会阻止酶与DNA的充分接触，从而导致酶切不彻底。

5.酶活力不足：如果酶的活力不足，其切割能力就会受限，可能导致酶切不彻底。

6.外切核酸酶污染：如果反应体系中存在外切核酸酶，它可能会降解已切割的DNA片段，导致酶切产物不完整。

酶切反应原理酶切反应原理酶切反应是一种广泛应用于生物学、分子生物学、基因工程等领域的技术。

它是利用特定的酶对DNA分子进行切割，从而实现DNA分子的特定序列分离和提取的方法。

本文将详细阐述酶切反应的原理。

一、DNA结构为了更好地理解酶切反应的原理，首先需要了解DNA结构。

DNA是双链螺旋结构，由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G和胞嘧啶C）组成。

两条链通过氢键相互配对，A与T形成两个氢键，G 与C形成三个氢键。

这种稳定的配对方式保证了DNA分子在遗传信息传递中的准确性。

二、限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别和切割DNA特定序列的酶。

它们广泛存在于细菌和古菌中，并且具有高度的特异性和高效率。

目前已经发现了数百种限制性内切酶，并且不同种类之间具有不同的切割位点和切割方式。

三、酶切反应酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。

在酶切反应中，首先需要选择一种合适的限制性内切酶，并确定其特定的切割位点。

然后将待处理的DNA分子与该限制性内切酶一起加入反应体系中，经过一定时间后，DNA分子会被该限制性内切酶在特定位点上进行断裂。

四、DNA片段在酶切反应中，被限制性内切酶识别和断裂的DNA分子称为DNA片段。

根据不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段。

这些DNA片段可以通过电泳等方法进行分离和提取，从而实现对特定序列的精确检测和分析。

五、应用由于其高度的特异性和高效率，酶切反应已经成为现代生物学、分子生物学、基因工程等领域中最为重要和常用的技术之一。

它被广泛应用于基因克隆、基因组测序、PCR扩增、DNA指纹鉴定等方面，为人类认识生命、治疗疾病和改善人类生存环境做出了巨大贡献。

六、总结酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。

它通过选择不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段，从而实现对特定序列的精确检测和分析。

关于酶切的有用知识酶切是分子生物学中常用的，如何选择酶切缓冲液，提高酶切效率，是一个十分关键的问题，本人摘用了其它论坛的内容，另外将逐步整理，使酶切问题能够比较容易解决，希望大家补充：1.PCR产物的酶切。

PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：（1）酶切缓冲液。

每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg 等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。

在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html。

（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？分两次酶切。

即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。

一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大；（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

（2）酶切温度。

酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。

双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

（3）酶切时间。

酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

酶切检定的标准
酶切检定的标准主要包括以下步骤：
1. 酶切位点的选定：对于酶切验证来说，选定好的位点至关重要，一般来说是选择唯一的位点，最好双酶切。

就是说选择的酶切位点在目的质粒上是唯一的，两个唯一的位点双酶切会产生掉带，即是质粒线性化，同时会切掉片段，通过凝胶电泳图来判断所切掉的片段是否和预期的大小一致，如一致可以断定目的基因已经插入该质粒中。

2. 提纯重组质粒：对重组质粒进行提纯，以便进行后续的酶切操作。

3. 酶切反应：使用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割质粒，释放出插入片段。

对于可能存在双向插入的重组子，还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向。

4. 凝胶电泳检测：通过凝胶电泳检测插入片段和载体的大小，判断所切掉的片段是否和预期的大小一致。

如果一致，可以断定目的基因已经插入该质粒中。

以上是酶切检定的标准步骤，具体的操作可能会根据不同的实验条件和要求有所不同。

在进行酶切检定时，需要注意安全性和准确性，遵循实验规范和操作程序，确保实验结果的可靠性和准确性。

酶切酶连原理
酶切酶连原理是一种常用的基因克隆技术，通过利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，将目的基因与载体DNA进行切割和连接，从而构建重组的DNA分子。

首先，使用限制性核酸内切酶对目的基因和载体DNA进行酶切，产生具有特定粘性末端的DNA片段。

这些片段具有相同的粘性末端，可以通过DNA连接酶将其连接在一起。

在连接过程中，需要确保目的基因与载体DNA的粘性末端序列相互匹配，以确保正确的重组。

连接后的重组DNA分子可以转入宿主细胞中进行表达或保存。

此外，为了提高酶切酶连的效率和特异性，通常会使用特定的缓冲液和交联剂。

同时，为了去除未酶切和未连接的DNA片段，需要进行电泳和胶回收等操作。

总之，酶切酶连原理是基因工程中常用的技术之一，可用于构建基因表达载体、基因敲除载体、基因治疗载体等，具有重要的应用价值。

酶切反应的正确操作方法酶切反应是一种常用的生物学实验方法，可以将DNA分子在特定的酶切位点切割成较小的片段。

以下是酶切反应的正确操作方法：1. 准备酶切反应体系：在一个无菌的微量离心管中，准备以下反应体系：DNA 样品，10倍的切割缓冲液（通常是50-100 mM Tris-HCl，1-10 mM MgCl2，pH 7.4-8.0），适量的选择性限制性内切酶（根据实验需求选择合适的酶），通过溶剂添加到反应体系中。

2. 混合反应液：将切割缓冲液和DNA样品轻轻混匀，然后加入适量的酶，再次轻轻混匀。

注意避免产生气泡。

3. 孵育反应：使用合适的温度和时间对反应体系进行孵育。

反应条件会因所用酶而有所不同，通常会在37C孵育1-2小时，但具体条件需参考酶的说明书。

4. 终止反应：加入适量的酶切终止缓冲液（通常是约5倍于切割缓冲液的量），终止缓冲液中包含酶缓冲液的成分，可用于停止酶切反应。

5. 分离DNA片段：将反应液通过凝胶电泳或其他分离方法，将切割得到的DNA 片段与未切割的DNA片段分离开。

需要注意的是，在进行酶切反应时，应注意以下几点：- 确保实验环境和工作台面的无菌性，避免外源性DNA的污染。

- 使用高质量的DNA样品，以确保反应的准确性和重复性。

- 按照酶的说明书严格控制反应条件，包括温度、孵育时间等。

- 注意避免气泡的产生，以免影响反应的进行。

- 使用适量的酶，以免过度切割或切割不完全。

- 酶切反应结束后，及时停止反应并进行下一步的实验操作，避免长时间孵育造成DNA片段的进一步切割。

以上是酶切反应的正确操作方法，希望对你有所帮助。

如有需要，请参考相关文献或咨询专业人士进行进一步的实验设计和操作指导。

酶切注意事项1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。

因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端⾄少保留有若⼲个碱基才能保证酶的有效切割。

有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

2、回收PCR产物：回收的PCR产物⽚段=1：10　，⼀般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为?g 单位的 DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分⼦量）所得数值即为?g,也可以直接⽤这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66µg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。

3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多⼈建议酶切过夜，其实完全没有必要，⼀般酶切3个⼩时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。

酶切体系不宜过⼤，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最⼤量，否则酶切不完全，酶的⽤量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解 1ugDNA。

4、两种酶切的条件不同时，分别进⾏两次酶切，切完⼀个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切⾼温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切⾼盐浓度要求的。

5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因⼦螯合，影响酶切效果，可放⼤酶切体积或重新浓缩质粒。

6、限制酶的选择⾮常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率⾼的限制酶，提前看好各公司的双切酶所⽤公⽤的BUFFER，以及各酶在公⽤BUFFER⾥的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶⼿法不准，很容易割下⼤块的胶，影响纯化效率。

酶切基础知识酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。

DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。

当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。

如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。

若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。

若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。