DNA的酶切鉴定

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA 按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。

实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。

限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。

限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。

各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。

这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。

这类酶如EcoB、EcoK等。

第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。

由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。

因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。

II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。

根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。

关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。

限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。

影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。

DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。

T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。

实验九 DNA的酶切一、原理1．三类限制酶限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。

限制酶可分为3类。

I类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。

Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。

而I类限制酶结合在识别序列上，但却随机地切割回转到被结合酶处DNA。

在基因工程中I类和Ⅲ类限制酶都不常用。

常用的是I类限制酶。

2．Ⅱ类限制酶Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割裂一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。

基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种I类限制酶。

3．限制性内切酶(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoR I识别序列为：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。

(2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。

(3)切割方式两种A．错位切割大多数限制性内切酶不在识别序列的对称轴上切割DNA链，而在偏离对称轴数个核甘酸处切割。

错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为粘性末端(Cohesive Ends)。

带有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。

B.沿对称轴切割，一些酶在对称轴处切割，产生平齐末端(Blunt Ends)。

(4)同裂酶(同切口限制性内切酶)一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。

然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。

这些酶称为同裂酶(Ischizomers)。

有—些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau3A I，识别序列在BamHl之内。

两种酶切割反应要求最严的成分是底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。

提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反心，有些甚至改变识别序列两种酶切割后得到相同末端．所以这两种酶产生的片段可以连接。

第1篇一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的原理和应用。

2. 熟悉质粒DNA的提取和纯化方法。

3. 学习琼脂糖凝胶电泳技术，分析酶切结果。

4. 探讨影响酶切效率的因素。

二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一种能够识别双链DNA上的特定序列，并在识别序列处切割DNA的酶。

根据酶切位点的不同，限制性核酸内切酶可分为两类：Ⅰ类酶和Ⅱ类酶。

本实验所使用的是Ⅱ类酶，如HindⅢ、EcoRⅠ等。

质粒DNA的提取和纯化是分子生物学实验中的基本操作，通过提取和纯化可以获得高纯度的质粒DNA，便于后续的酶切、连接、转化等操作。

琼脂糖凝胶电泳技术是一种常用的分子生物学分离技术，通过电泳分离不同分子量的DNA片段，从而对酶切结果进行鉴定。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（如HindⅢ、EcoRⅠ）3. 琼脂糖4. DNA marker5. Tris-HCl缓冲液6. 10×Loading buffer7. 1×TAE电泳缓冲液8. 0.5×TAE电泳缓冲液9. 0.5%琼脂糖凝胶10. 紫外灯11. 显影液四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）将质粒DNA加入Tris-HCl缓冲液中，加入等体积的酚/氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。

（2）取上清液，加入等体积的氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。

（3）取上清液，加入2/3体积的95%乙醇，混匀，室温放置10分钟。

（4）将沉淀物用70%乙醇洗涤，室温放置5分钟。

（5）将沉淀物溶于适量TE缓冲液中，即为纯化的质粒DNA。

2. 酶切反应（1）将纯化的质粒DNA加入酶切缓冲液中，加入限制性核酸内切酶，混匀。

（2）37℃水浴孵育2-3小时，或根据酶的说明书进行。

（3）加入适量DNA loading buffer，混匀。

3. 琼脂糖凝胶电泳（1）制备0.5%琼脂糖凝胶，加入1×TAE电泳缓冲液。

（2）将酶切反应产物加入凝胶孔中，同时加入DNA marker。

一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。

2. 掌握质粒DNA的提取方法。

3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。

4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。

二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。

在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。

本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。

通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。

2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。

- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。

- 连接电源，进行电泳。

- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。

4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。

- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。

- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。

五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。

2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。

- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。

酶切鉴定实验报告酶切鉴定实验报告引言：酶切鉴定是一种常用的分子生物学技术，通过酶切作用将DNA分子切割成特定的片段，从而确定DNA的序列和结构。

本实验旨在通过酶切鉴定技术，对DNA进行切割并进行分析，以进一步了解DNA的特性和应用。

材料与方法：实验所需材料包括DNA样品、限制性内切酶、缓冲液、电泳仪等。

首先，将DNA样品与限制性内切酶和缓冲液混合，反应一段时间后，将反应产物进行电泳分离。

接着，通过电泳仪观察DNA片段的迁移距离，并与已知的DNA标准进行对比，从而确定DNA的大小和序列。

结果与讨论：实验结果显示，经过酶切作用后，DNA样品被切割成多个片段。

通过电泳分离，我们观察到这些片段在凝胶上形成了明显的条带。

根据条带的迁移距离，我们可以初步确定DNA片段的大小。

进一步分析发现，不同的限制性内切酶对DNA的切割方式各不相同。

有些酶会将DNA切割成等长的片段，而有些酶则会产生不等长的片段。

这是由于限制性内切酶对DNA的特定序列具有识别和切割的能力。

通过比较不同酶切产生的片段大小，我们可以推断出DNA的序列和结构。

此外，我们还发现不同的DNA样品在酶切鉴定实验中表现出不同的特点。

有些DNA样品在特定的酶切条件下会产生多个片段，而有些则只会产生少数片段。

这可能是由于DNA样品中存在不同的限制性内切酶切割位点或序列变异导致的。

通过进一步的研究，我们可以深入了解这些DNA样品的特性和变异情况。

酶切鉴定技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。

例如，在基因工程领域，科学家们可以利用酶切鉴定技术对重组DNA进行构建和验证。

通过切割和连接不同的DNA片段，他们可以构建出具有特定功能的重组DNA，并用于生物制药和基因治疗等领域。

此外，酶切鉴定技术还可以用于检测和鉴定病原微生物的DNA，从而帮助医生进行疾病的诊断和治疗。

结论：本实验通过酶切鉴定技术对DNA进行了切割和分析，初步确定了DNA的大小和序列。

通过观察不同酶切产生的DNA片段，并与已知的DNA标准进行对比，我们可以进一步了解DNA的特性和应用。

质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。

2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。

3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。

二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。

酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。

在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。

三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。

2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。

3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。

4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。

5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。

6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。

7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。

四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。

最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。

五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。

在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。