人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH5955www.CRTER.org张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。

通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 []中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, ChinaAccepted: 2014-07-31人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1，3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031)文章亮点：1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。

临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。

在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。

然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。

本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。

二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。

纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。

2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。

3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。

因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。

4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。

例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。

同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。

三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。

2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。

3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。

4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。

5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。

6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。

四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。

通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。

前持评件耐觅 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月• 2385 ・脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究杨 莹，李政楠，王秀娟，李 伟，牟春琳，金 星，徐永胜•天津长和生物技术有限公司，天津301925摘 要：目的观察人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对异体总淋巴细胞和不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响，以及对 细胞因子分泌的影响。

方法分离并培养hUC-MSCs 及健康成人外周血淋巴细胞，以淋巴细胞为阴性对照，MTT 法检测共 培养(淋巴细胞：hUC-MSCs 为1：0.5、1 ： 1、1 ： 5、1 ： 10) 3 d 后淋巴细胞的增殖情况；流式细胞仪检测共培养体系中 CD4 CD25 FOXP3\ CD3 CD16* C D56\ CD4 CD45RA CCR7*的细胞比例；ELISA 法检测白细胞介素(IL) -2、IL-4、IL-10、 Y-干扰素(INF-?)细胞因子分泌情况。

结果 与阴性对照组比较，hUC-MSCs 对淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用(P< 0.05),抑制效果随数量增加而增强；hUC-MSCs 能够显著增加共培养体系中CD4CD25FOXP3*细胞比例(PV0.05),显著 降低CD4*C D45RA'CCR7‘细胞比例(PV0.05),对CD3 CD16 CD56*细胞比例无显著影响；hUC-MSCs 能够显著降低IL-2、 IL-4、INF-y 水平，显著增加IL-10的分泌水平(P<0.05)。

结论hUC-MSCs 具有免疫抑制功能。

收稿日期：2020-09-11基金项目：国家重点研发计划"干细胞及转化研究"重点专项(2019YFA0112100)；天津市科技计划项目(17ZXXYSY00020)*通信作者：徐永胜 E-mail :***********************关键词：脐带间充质干细胞；淋巴细胞；免疫反应；细胞因子中图分类号：R329 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2020) 12-2385-05DOI ： 10.7501/j.issn.l674-6376.2020.12.005Research on immunosuppressive function of umbilical cord mesenchymal stem cellsYANG Ying, LI Zhengnan, WANG Xiujuan, LI Wei, MU Chunlin, JIN Xing, XU Yongsheng Ever Union Biotechnology Company Limited, Tianjin 301925, ChinaAbstract: Objective To observe the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) on the proliferation of allogeneic total lymphocytes and different lymphocyte subsets, as well as the secretion of cytokines. Methods hUC-MSCs and peripheral blood lymphocytes of healthy adults were isolated and cultured; MTT method was used to detect the proliferation of lymphocytes by after co-culture for 3 days; the proportion of CD4+CD25 FOXP3 ., CD3 CD16 CD56* and CD4 CD45RA CCR7 in the co-culture system was detected by flow cytometry; ELISA was used to detect the secretion of IL-2, IL-4, IL-10 and INF-y. Results hUC-MSCs could significant inhibit the proliferation of T lymphocytes, and the anti-proliferative effect was enhanced with the increase of the number of lymphocytes; the proportion of CD4 CD25 FOXP3 cells in co-culture system was increased by hUC- MSCs (P < 0.05); the proportion of CD4TD45RA +CCR7+ cells showed a downward tendency, and the difference was statistically significant (P < 0.05); however, there was no significant difference in CD3 CD16 CD56+ cells. hUC-MSCs could reduce the levels of IL-2, IL-4 and INF-y, but increase the secretion level of IL-10, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion HUC-MSCs had immunosuppressive function.Key words: umbilical cord mesenchymal stem cells; lymphocytes; immune response; cytokines间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细 胞，因其具有多向分化潜能⑴、造血支持和促进干细 胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人 们的关注。

临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。

除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。

hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。

过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。

目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。

然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。

其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。

而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。

除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。

随着外泌体研究的深入，科学家发现它是参与细胞间物质与信息传递的重要一环。

对外泌体的研究兴趣也日益增长，主要集中在疾病诊断和细胞治疗领域。

由于脐带间充质干细胞具备采集方便、增殖能力强和免疫原性低的优势，其分泌的外泌体常被用于再生医学和各种疾病的治疗研究。

外泌体，来源：Alxerion Biotech01脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。

由于其来源无伦理学限制，容易获得且增殖速度快，免疫原性低，目前已广泛应用于治疗缺血性疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤和自身免疫性疾病等临床研究中,是细胞治疗和再生医学的首选。

外泌体，来源：Direct Biologics02外泌体（exosome, EXO）外泌体（exosome, EXO）是由细胞分泌的直径为30～100nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。

近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。

外泌体治疗的主要优势体现在：免疫原性比细胞更低，内容物稳定易保存，可通过改变细胞环境调节外泌体功能，易于量产。

但是，应用也有一些难点：分离纯化方法的选择和优化，如何向靶细胞递送药物等。

在制备高质量、均匀、大量的外泌体以及优化外泌体储存条件时也存在挑战。

外泌体，来源：Beckman Coulter03脐带MSC-EXO的应用在与MSCs具有相同功能的同时，脐带MSC-EXO还拥有更显著的安全性。

而且采集方便、增殖能力强和免疫原性低的优势，已被广泛用于再生医学及各种疾病的治疗研究。

肾脏疾病研究者发现，脐带MSC-EXO在体外和体内，对抗癌化疗药物顺铂诱导的肾毒性都具有治疗作用。

脐带间充质干细胞体外传代培养后细胞核型稳定性崔冬冰;何志旭;李永念;王凤昌【摘要】目的:研究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)在经过培养和传代后是否会出现染色体异常改变.方法:收集剖宫产足月胎儿脐带,采用胶原酶加胰酶消化法和机械法分离出UC-MSCs间充质干细胞贴壁培养传代,观察细胞形态、免疫表型及细胞增殖实验等生物学特性,利用G显带分析原代(P0)和第3～6代(P3～P6)细胞的染色体核型.结果:染色体核型分析显示,P0和P3～ P6 UC-MSCs均为正常二倍体核型,G显带未见染色体结构异常;UC-MSCs呈成纤维样形态生长,P3～P6代高表达CD73、CD90、CD44,并且UC-MSCs在培养2～3d时达到对数增长期.结论:UC-MSCs在体外连续传代培养6代以内染色体结构稳定,未出现染色体异常改变.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2013(038)005【总页数】6页(P449-453,457)【关键词】脐带;间充质干细胞;连续传代;核型分析;细胞,培养的【作者】崔冬冰;何志旭;李永念;王凤昌【作者单位】贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心,贵州贵阳550004;贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心,贵州贵阳550004;贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心,贵州贵阳550004;贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R349.5;R349.891.1 标本来源2例脐带取自贵阳仁爱医院产科健康足月新生儿剖宫产手术后，经家属同意捐献所得，新生儿性别为1男1女。

1.2 材料DMEM-低糖培养基(Gibco公司)、FBS(Hyclone公司)、Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、流式抗体试剂盒(BD公司)、CO2细胞培养箱(Thermo公司)、流式细胞仪(BD公司)、Leica核型分析系统、染色体培养基、秋水仙碱、甲醇、冰乙酸、、姬姆萨染液、细胞培养瓶等。

脐带间充质干细胞概述医学实验班70080103王雪彤脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动华尔通氏脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织胶(WhartonpsJelly),从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs)。

1人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的形貌分析：倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，低密度时较扁平,密度增加趋于融合时细胞变细长。

扫描电镜下观察呈长条状纤维样，细胞膜表面不光滑，有小结节状物，细胞无明显突起，细胞间无网络状连接。

透射电镜观察核大，不规则，核仁明显，常染色质多，异染色质少，胞浆少。

胞质内细胞器较少，以粗面内质网和线粒体为主，内有大量游离核糖体，部分细胞可见内质网月中胀。

植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(X200)例如三代细胞的形态学特征一一人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。

第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1,2;并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3;细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。

2人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的生物学特性：HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞，是别于两者之间的一类新的多能问充质细胞，它们之间既有联系又有差异。

根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会(theMesenchymalandTissueStemCellCommitteeoftheInternation2alSocietyforCellul arTherapy)制定的最低标准,脐带间充质干细胞(MSCs)需满足以下条件：1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；2)MSCs表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14或CD11b,CD79a或CD19和HLA2DR;3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。