最新23流式细胞仪检测技术.ppt

DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
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20
.
21
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测，成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
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3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
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4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞

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Zhou University
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流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪
• 雏形: 1949年--- Coulter 计数器
•
1959年--- B型Coulter计数器
•
1972年: BD(Becton-Dickinson)
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了 半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
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高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本 流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流 经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数 据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次 通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细 胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用 于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的 培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器， 适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage

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光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分 光镜等光学元件组成，将不同波长的光信 号送入不同的探测器
滤片
1）长通滤片（long pass filter，LP ) 2）短通滤片（short pass filter，SP ) 3）带通滤片（band pass filter，BP）
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只允许特定波长以上的光通过 ，如LP500
带电细胞液滴通过静电场而 发生偏转，落入收集器中， 其他液体则被当作废液抽吸 掉，完成细胞分选的目的。
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（二）FCM分选技术要求
细胞分选对仪器的性能要求较高 分选是流式细胞仪的重要功能之一 分选功能的装置较为复杂
► 分选指标
分选速度
分选纯度 分选收获率
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分选速度
1
每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分 选速度至少达5000个/秒左右。
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生 物及人工合成微球等
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第一节 流式细胞术的分析及分选原理
液流 系统
光学 系统
流式 细胞仪
光学 原理
光电转 换原理
电子 系统
测试 原理
4
激光
光电 倍增管
放大电路
流式细胞仪是集
多种技术为一体的 新型高科技仪器
激光技术 单克隆抗体技术 细胞荧光化学技术 光电测量技术 电子物理技术 电子计算机技术
1、散射光信号：分为前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter， SSC）。
散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术， 被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小 的内部结构。
2、荧光信号
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前向散射光检测器

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜外表抗原的强度或其核内物质的 浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续 的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信 号进展计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来， 还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
电子系统负责光电转换和数据处理
1 散射光信号
侧向角散射光 〔SSC〕 Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性
激
前向角散射光〔FSC〕
发 光
Forward Scatter：细胞相对大小及其外表积
光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪的信号分析
外周全血细胞散射光双参数点图 〔红细胞溶解后〕
新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的
二、流式细胞仪的构造组成
Principles of Flow Cytometric analysis
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 电子系统 ➢ 分选系统
三、流式细胞仪的根本构造
液 流 系 统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是 把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子 通过激光束。
根据散射光信号 从人白细胞中鉴别出不同亚群：
白细胞
淋巴细胞 单核细胞 粒细胞
流式细胞仪的信号分析
2荧光信号
利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析： 检测多种细胞外表标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平 为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群
流式细胞仪的信号分析
荧光信号的分析
流式仪器一览
流式细胞仪一览

• 凋亡相关蛋白：
• Fas • Bcl-2
细胞凋亡—PI分析
调亡细胞
正常G0/G1期细胞
Events
PI - Fluorescence
细胞凋亡—Active Caspases-3
细胞凋亡—Caspases-3
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—BrdU
FCM的应用——免疫学
FCM的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
FCM的科研应用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
细胞周期分析——PI单染
细胞周期分析——ModiFit 分析
细胞周期分析——ModiFit 分析
大鼠生精细胞分析——PI单染
细胞凋亡—PI加Annexin V双染
PI
FITC-Annexin V
淋巴细胞亚群分析
FITC-CD4 PE-CD8
CY5.5-CD3
培养细胞表面粘附分子表达
培养细胞表面粘附分子表达
第23讲
流式细胞仪检测技术 （FCM）
EPICS XL 流式细胞分析仪
Dual Parameter Histograms
细胞组学研究的过去、现在和未来
18世纪，明视野显微镜发明 放射自显影 暗视野光镜，相差显微镜， 微分干涉对比显微镜，偏振 光显微镜，荧光显微镜 细胞成像定量分析系统 细胞计数仪
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等

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流式细胞仪分析技术及应用
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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流式细胞术
(Flow Cytometry, FCM)
第一节 流式细胞仪的原理
Principle of Flow Cytometer
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
台式流式细胞仪
落地式流式细胞仪
一、工作原理 （一） 液流系统
细胞样品和包裹在外的鞘液，保
证细胞逐个以相同的速度、相同的 轨迹检测区。单细胞流技术。
（二）激发光与光速成形系统
多为氩离子气体激光（488nm）， 用圆柱形透镜聚焦成高15um、宽57um 椭圆形光斑——检测区。长轴垂直细 胞流和激光束中心轴，短轴与细胞轴 一致并重叠。 保证每一细胞受到一致 的光照。单细胞照明技术。
第二节 数据的显示与分析 一、信道值 二、单参数点图及直方图
三、双参数直方图（二维点图）
四、三维图及等高图
谢谢聆听
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION
（三）细胞信号检测与分析和处理系统 细胞产生散射光和荧光信号360度发
射。分光镜和滤光片将不同波的光分
开，光电倍增管及电子线路接收并转化
为电信号，模数转化器量化为数字信号
由计算机采集、分析、显示和存储。单
细胞检测技术。
• 二、流式细胞仪检测 • 1.散射光测定 • 2.荧光测定 • 3.细胞分选原理

便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理

（1） 液流系统 目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel
reactive antibody, PRA）检测。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如 大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。