直接抗人球蛋白试验操作规程

直抗人球蛋白试验操作规程1. 引言直抗人球蛋白试验是一种常用的实验方法，用于检测人体血液中球蛋白的含量。

这个操作规程旨在提供进行直抗人球蛋白试验的详细步骤和注意事项，以确保实验结果的准确性和可重复性。

2. 实验材料•直抗人球蛋白试剂盒：包括试剂A、试剂B、试剂C等。

•96孔酶标板：用于进行反应的载体。

•微量移液器和相应的移液头。

•20μL、200μL和1000μL的移液枪。

•酶标仪：用于测量光密度的仪器。

3. 实验步骤步骤一：样本预处理1.1 收集人体血液样本，并放置于无菌离心管中。

1.2 将血液样本离心10分钟，以分离血浆。

1.3 将血浆转移至新的离心管中，并离心10分钟，以去除细胞残渣。

步骤二：试剂准备2.1 打开直抗人球蛋白试剂盒，取出试剂A、试剂B和试剂C，并放置在实验台上。

2.2 适量的稀释试剂A，根据试剂盒中的说明书的建议稀释比例。

2.3 静置室温约1小时，使稀释后的试剂A达到室温。

步骤三：酶标板涂布3.1 打开96孔酶标板，用100μL稀释后的试剂A将每孔涂布。

3.2 将酶标板在4°C冰箱中静置过夜。

步骤四：反应孔操作4.1 准备一个新的96孔酶标板，并标记每个孔。

4.2 用吸管将25μL的血浆样本分别加入每个孔中。

4.3 加入100μL试剂B，并慢慢混合。

4.4 静置30分钟，在37°C恒温摇床上进行孵育。

步骤五：洗涤5.1 用洗板机将反应孔中的液体彻底清除。

5.2 使用洗涤缓冲液进行洗涤，每个孔洗涤3次。

步骤六：酶标反应6.1 加入100μL试剂C，并慢慢混合。

6.2 再次静置30分钟，在37°C恒温摇床上进行孵育。

步骤七：终止反应7.1 加入100μL终止液，停止反应。

步骤八：测量光密度8.1 将酶标板放入酶标仪中。

8.2 选择适当的检测波长，测量每个孔的光密度值。

4. 注意事项•所有实验操作必须在洁净无菌的环境下进行，以避免污染。

•严格按照试剂盒说明书中的稀释比例来制备试剂，避免试剂使用不当。

抗人球蛋白试验（coombs实验）
直接试验：实验原理：本实验是检查不完全抗体试验，包括直接试验和间接试验。

直接试验和间接试验阳性为红细胞表面不完
全抗体存在及血清中游离的不完全抗体存在，判定结果凝
集为阳性。

试剂：
1、受检者红细胞：取患者全血脱纤维蛋白或抗凝，离
心除上清液，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，
然后制成10%的红细胞悬液。

2、受检血清
3、正常0型混合红细胞：取数名正常0型抗凝血，离
心除血浆，用大量生理盐水洗涤红细胞3—5次，然
后制成10%的红细胞悬液。

4、抗人球蛋白血清
5、抗D血清
6、AB血清
7、0.85%生理盐水
操作方法：
取试管3支
1 2 3
反应物（低）
受检者阳性对照阴性对照
受检者压积红细胞 2 ——
对照同型压积红细胞— 2 2
抗D血清— 4 —
AB血清—— 4
将2 3 管置37℃水浴中1小时，然后3支试管均用大量生理盐水洗涤两次，每管再以生理盐水配成10%的红细胞悬液。

直接试验：
取小试管4支
反应物（滴）
受检者盐水对照阳性对照阴性对照
抗人球蛋白血清 2 — 2 2。

抗人球蛋白试验标准操作规程1.目的为规范抗人球蛋白试验（Cooms试验）的技术操作，保证试验结果的准确性，为临床诊断及治疗提供依据，特制定本规程。

2.适用范围适用于输血科（血库）进行抗人球蛋白试验。

3.职责输血科（血库）技术人员负责抗人球蛋白试验的操作。

4.原理利用抗人球蛋白试剂可与致敏在红细胞上的抗体和（或）补体结合，使红细胞出血肉眼可见的凝集的原理，检测红细胞是否被抗体和（或）补体致敏。

5.所需设备和试剂设备普通离心机，血型血清学专用离心机，电热恒温水浴箱，普通显微镜。

试剂抗人球蛋白试剂（多特异性或单特异性），IgG抗-D试剂，AB型血清（红细胞不规则抗体筛选阴性），10%O型、RhD阳性红细胞悬液。

6.检测环境条件室温应保持在18-27℃，湿度应保持30%-70%。

7.步骤与方法7.1抗人球蛋白试验阴、阳性对照及DAT阳性红细胞的制备7.1.1抗人球蛋白试验阴性对照：取3%O型、RhD阳性红细胞悬液50ｕl,加入AB型血清（红细胞不规则抗体筛选阴性）100ｕl，37℃孵育30min，用生理盐水充分洗涤3次，每次洗涤后将盐水倒尽，以滤纸将管口残余的盐水吸去，最后1次洗涤滤干后加入抗人球蛋白试剂100ｕl，混匀，以120g离心1min后镜检应无凝集。

7.1.2 抗人球蛋白试验阳性对照及DAT阳性红细胞的制备：取10%O型、RhD阳性红细胞悬液100ｕl，加入IgG抗-D试剂600ｕl，37℃孵育30min，用生理盐水充分洗涤3次，每次洗涤后将盐水倒尽，以滤纸将管口残余的盐水吸去，最后1次洗涤滤干后加入生理盐水500ｕl，配成浓度约为2%的红细胞悬浮液备用，取该红细胞悬液50ｕl加抗人球蛋白试剂100ｕl，混匀，以120g离心1min后肉眼观察红细胞应显凝集（阳性对照）。

配制的2%红细胞悬液即为DAT阳性红细胞悬液。

7.2 DAT步骤试验管取受检者3%红细胞悬液50ｕl，用生理盐水充分洗涤3次，每次洗涤后将盐水倒尽，以滤纸将管口残余的盐水吸去，最后1次洗涤滤干后加入抗人球蛋白试剂100ｕl，混匀，以120g离心1min，肉眼观察有无凝集，若不见凝集，以显微镜观察，并记录结果。

直接抗球蛋白试验（DAT）标准操作规程
1.目的直接检测体内已被抗体或补体致敏的红细胞。

2.适用范围主要用于自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病和溶血性输血反应的检查。

3.所需仪器和材料离心机、水浴箱、抗球蛋白试剂等。

4.执行标准《临床检验操作规程》。

5.原理将抗球蛋白血清加入已经致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面被结合的抗体球蛋白与抗球蛋白试剂的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集而判出红细胞表面是否含有被致敏的抗体或补体。

6.操作程序取试管1支加患者红细胞标本0.05ml，用足量生理盐水洗涤红细胞3-4次，每次倾倒盐水沥干，然后加最适稀释度抗球蛋白血清0.05ml,-1ml,混匀，1000r/min离心，1分钟取出，立即轻轻摇动试管观察结果。

结果判断⑴红细胞凝集为阳性，表明体内红细胞已被抗体和(或)补体致敏；⑵红细胞不凝集为阴性，置室温5分钟，再离心观察结果，如红细胞凝集，是补体反应的结果；如红细胞不凝集，应在反应试管中加入0.05ml对照细胞（即被IgG或C3包被的标准O型红细胞），混匀后，立即离心观察结果，如对照细胞阳性，上述阴性结果可靠，如对照细胞阴性，阴性结果不可靠，可能是洗涤不成功，或抗球蛋白试剂失效。

XXX医院直接抗人球蛋白试验操作规程1.目的保证试验结果的准确性，确保临床输血安全。

仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录合格证件的正品。

9.试剂保存和性能指标9.1.保存：直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）应置于2~8℃冷藏保存，切勿反复冻融。

储存条件下有效期为24个月。

9.2.性能指标：直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）为多特异性试剂。

外观：应澄清透明，无杂质；灵敏度试验：分别与强抗体[抗D(IgG)]，中等强度抗体(抗Jka)和弱抗体(抗Fya)致敏细胞反应，结果均为阳性。

/分③加入2滴抗IgG,C3d，以3400转/分钟（1000g）离心15秒。

④将取出的试管持一定角度并轻轻摇动直至松动所有的细胞，然后反复倾斜试管，直至呈现均匀的细胞悬液（阴性）或凝集物（阳性）为止。

⑤用肉眼或借助光学显微镜观察凝集情况，并按凝集程度进行初步判读结果并记录。

⑥若初步判读结果为阴性，则在室温中放置5~10分钟，再离心一次，重新判读结果并记录。

⑦阳性对照试验（IgG抗D致敏细胞）：将1滴阳性对照细胞加入干净的试管中；再加入2滴直接抗人球蛋白试剂（抗）1分红细胞不凝集为阴性反应，表示红细胞上没有相应抗体存在。

13.质量控制与注意事项①红细胞洗涤不充分，微量残留的未结合的球蛋白将中和抗人球蛋白试剂，影响试验结果的准确性。

②直接抗人球蛋白试验的试管在初读结果之后，应再放在室温中5~10分钟，这样孵育后，对C3d或IgA致敏红细胞有增强作用，重新离心后观察结果可使初判的阴性结果转变为阳性结果；而IgG致敏的红细胞在孵育后反应可能会更弱。

③试剂中含有0.1%W/V叠氮钠，若摄入人体会引起中毒。

④直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）为体外诊断试剂。

抗人球蛋白试验操作规程临床输血质量管理体系文件名称：抗人球蛋白试验标准操作规程持有部门：输血科医务科制订者：××××××制订日期：××年××月××日执行日期：××年××月××日审核者：×××审核日期：××年××月××日版本/修改状态：A/0技术性规程文件编号：HZYY-CBT/SOP 003核准者：×××核准日期：××年××月××日文件页数:共3页文件性质：□普通□限制（仅限本院范围，未经授权）抗人球蛋白试验操作规程抗人球蛋白试验（又称Coombs试验）分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验，直接抗球蛋白试验是直接把抗球蛋白加入患者的红细胞悬液中，若红细胞已被抗体致敏便出现凝集，用以检测红细胞表面结合的抗体，如新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血的检查。

间接抗球蛋白试验是将已知（未知）抗原的红细胞和未知（已知）抗体的血清混合，然后加入抗球蛋白血清，若抗原抗体相对应，即出现可见的红细胞凝集。

用以检测游离于血清中的抗体，亦可用已知抗原的红细胞检测血清中的相应抗体效价，输血前的交叉配血或不相容输血后的抗体测定。

抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上IgG抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测定补体组分（C3C49.1目的标准抗球蛋白实验的技术操作，包管实验成效的准确性，为临床举行诊断及治疗供给依据。

9.29.39.49.5职责输血科(血库)技术人员负责抗球蛋白试验。

合用范围合用于临床须举行抗球蛋白实验的各种血标本。

原理所需材料和设备9.5.1材料抗球蛋白试剂、IgG抗-D抗体、AB型血清、3%Rh（D）阳性红细胞悬液、患者血标本。

抗人球蛋白试验操作规程抗人球蛋白试验（又称Coombs试验）分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验，直接抗球蛋白试验是直接把抗球蛋白加入患者的红细胞悬液中，若红细胞已被抗体致敏便出现凝集，用以检测红细胞表面结合的抗体，如新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血的检查。

间接抗球蛋白试验是将已知（未知）抗原的红细胞和未知（已知）抗体的血清混合，然后加入抗球蛋白血清，若抗原抗体相对应，即出现可见的红细胞凝集。

用以检测游离于血清中的抗体，亦可用已知抗原的红细胞检测血清中的相应抗体效价，输血前的交叉配血或不相容输血后的抗体测定。

抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上IgG抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测定补体组分（C3、C4）。

9.1目的规范抗球蛋白试验的技术操作，保证试验结果的准确性，为临床进行诊断及治疗提供依据。

9.2职责输血科(血库)技术人员负责抗球蛋白试验。

9.3适用范围适用于临床须进行抗球蛋白试验的各种血标本。

9.4原理9.5所需材料和设备9.5.1材料抗球蛋白试剂、IgG抗-D抗体、AB型血清、3%Rh（D）阳性红细胞悬液、患者血标本。

9.5.2 设备普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱。

9.6检测环境条件室温应保持在18～27℃，湿度应保持30%～70%。

9.7操作步骤9.7.1 直接抗球蛋白试验9.7.1.1取受检者红细胞，以生理盐水充分洗涤3次，末次洗涤后将上清液倒尽，用滤纸将管口残余的盐水吸去，再配成3%红细胞盐水悬液。

9.7.1.2取试管3支，分别标记好受检者、阳性对照、阴性对照。

其中受检者试管中加入3%受检红细胞盐水悬液1滴，再加入抗球蛋白血清1滴，混匀。

9.7.1.3阳性对照管抗球蛋白血清1滴，IgG抗-D致敏的3% RhD阳性红细胞盐水悬液1滴，混匀。

9.7.1.4阴性对照管抗球蛋白血清1滴，AB型血清致敏的正常人3% Rh（D）阳性红细胞悬液1滴，混匀。

9.7.1.51300g离心15s，肉眼观察有无凝集，若肉眼不见凝集，以显微镜检查，记录结果。

直接抗人球蛋白试验操作规程【目的】检查体内致敏红细胞。

【范围】可疑新生儿溶血病、溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血以及 药物诱导的贫血患者的血液标本。

【原理】抗球蛋白试验(AGT)又称Coombs 试验，是测定结合在红细胞上的抗 体和/或补体的主要方法。

抗体分子和补体成份都是球蛋白。

用人球蛋 白免疫动物使其产生抗体即抗人球蛋白。

抗人球蛋白试剂可凝集被人球 蛋白致敏的红细胞，抗人球蛋白试剂可以和致敏在红细胞上的人球蛋白 反映，通过桥梁作用使致敏红细胞出现凝集,呈现阳性反应。

直接Coombs 试验用于检测体内已被抗体或补体致敏的红细胞，可用于新生儿溶血病 的诊断，自身免疫性溶血性贫血的诊断，研究药物致敏的红细胞，输血 反应的研究。

【试剂和材料】1 .多特异性抗球蛋白试剂、抗IgG 、抗C3d 。

2 . EDTA 抗凝的受检者红细胞2ml 。

【操作程序】1、直接Coombs 试验类别：操作规程 生效日期：2014. 11 部门：输血科 修改日期：2014. 10 名 称：直接抗人球蛋白试验操作规程 新 增:1.1将1滴受检者3%红细胞悬液加入干净的试管中，用生理盐水洗涤3次（3400r∕min,离心Imin）。

每次洗涤后，将上清液全部倒出。

G,抗C3d）或抗IgG或抗C3d,1.2加入2滴多特异性（抗Ig3400r∕min,离心15秒，用肉眼或借助显微镜观察凝集，并记录结果。

1.3判读结果须一定角度轻轻摇动试管直至松动所有的细胞，然后反复倾斜试管，直到均匀的细胞悬液（阴性）或者凝集物（阳性）为止。

1.4如阴性结果，在室温中放置5~10分钟，再离心一次，重读结果。

这样做阴性反映有事会变成阳性。

2、阳性对照2.1每批新的试剂，或在4℃保存时间过长，需做阳性对照试验，至少每月一次。

1滴阳性对照细胞加2滴直接抗人球蛋白试剂，离心判读结果。

2.2在试验中，于判为阴性的试管中加入1滴阳性对照细胞，再离心，然后重悬浮，判定结果。

直接抗人球蛋白试验（DAT）操作规程 SXYJ-GZ-02101目的用于检测体内致敏的红细胞。

2适用范围研究药物致敏的红细胞、免疫性溶血性贫血的诊断、新生儿溶血病的诊断、输血反应等鉴定。

3职责检测者依据此程序进行直接抗人球蛋白试验操作。

4材料与设备抗人球蛋白试剂（-IgG/-C3d、-IgG、-C3d）、阴性对照细胞（试剂红细胞）；一次性使用滴管、试管、玻片；KUBOTA KA-2200型离心机；CH20BIMF200型电子显微镜等。

Biovue工作站（包括微柱凝胶卡、低离子增强液、孵育器、离心机）。

5操作方法5.1试管法5.1.1待检标本应为EDTA抗凝血，吸出部分红细胞，用0.9%生理盐水充分洗涤四遍，配制成2%红细胞盐水悬液。

5.1.2取待检红细胞盐水悬液1滴，移入加有2滴抗人球蛋白血清的小试管内，混匀。

5.1.3阴性对照抗人球蛋白血清2滴，加2％试剂红细胞悬液1滴，混匀。

5.1.4待检管以及阴性对照管同时以3400转/分，离心15秒（KA-2200型离心机Ⅱ档），轻轻揺动，肉眼及显微镜下观察结果。

5.2微柱凝胶法方法参见微柱凝胶技术操作规程（SXYJ-GZ-0228）。

6结果判定原则如阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为直接抗人球蛋白试验阳性，不凝集者为阴性。

凝集强度可参见SXYJ-GZ-0202: 5.2.1.6对结果进行判断。

7注意事项7.1标本采取后应立即进行试验，延迟或中途停止试验可使抗体从细胞上丢失。

7.2抗人球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则，可产生前带或后带现象而误为阴性结果。

7.3也有将浓的抗人球蛋白血清在白瓷板上做倍量系列稀释，再各加受检者10％洗涤红细胞悬液1滴，不断转动瓷板，肉眼观察凝集反应。

凡出现凝集的最高稀释倍数的倒数即为直接抗人球蛋白试验效价。

这种效价并不表示受检者红细胞被不完全抗体致敏的强度。

7.4受检红细胞一定要用盐水洗涤4次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。

抗人球蛋白检测卡操作程序
抗人球蛋白检测卡操作程序（微柱凝胶免疫检测法）
(一)直接抗人球蛋白试验（DAT）
1.将准备好的检测卡做好标记
2.将各待检者红细胞用生理盐水洗涤后配成0.8％红细胞悬液
3.阴性对照红细胞：将健康男性0型红细胞配成0.8％红细胞悬液
4.将各待检者0.8％红细胞悬液50ul加入1-5管，阴性对照红细胞
加入第6管
5.专用离心机离心5min（900rpm 2min,1500rpm 3min）
6．肉眼观察结果
（二）不规则抗体筛检和鉴定试验（IAT）
1. 将准备好的检测卡做好标记
2. 分离被检者血清／血浆
3. 将0.8％Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ筛检红细胞各50ul分别加入对应的微管中
4. 将待检者血清／血浆分别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ微管中，各50ul
5. 37℃孵育15min
6.专用离心机离心5min（900rpm 2min,1500rpm 3min）
7. 肉眼观察结果。