酶的固定化和固定化酶反应动力学62页PPT

缺点 结合力弱，对pH、离子强 度、温度等因素敏感，酶 易脱落，酶的装载容量较 小 偶联条件激烈，易引起酶 失活；成本高
交联条件激烈，机械性能 差
仅可用于低分子量的底物
固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶 的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂 和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地 保持较高的酶活力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提 高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的 分离纯化，从而提高产品质量。
低； —大多数情况下可以提高酶的稳定性； —可以增加产物的收率，提高产物质量； —有利于实现管道化、连续化以及自动化
操作，易于与各种分离手段联用。
固定化酶的缺点
• 但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶 的活力难免有一定损失；
• 而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应； • 也不适宜于需要辅助因子的反应。 • 胞内酶必须经过酶的分离过程
• 固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项技术
• 1969年固定化氨基酸酸化酶在工业生产中被正式应用
• 1971年的第一届国际酶工程会议上，正式 采用固定化酶（immobilized enzyme）
固定化酶的优点
• 优点： —易于将酶与底物及产物分离，因而产物
相对容易提纯； — 酶能够重复利用，使用效率提高，成本
由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
非必需基团
酶
非活性中心
分
子
活性中心外
必需基团
必需基团
结合基团 活
活性中心
性

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❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
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❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
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载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
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❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
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❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
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❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。

溶液颜色变化
拓展深化 固定化酵母细胞的制备与应用 1．制备固定化酵母细胞
(1)酵母细胞的活化 活化就是让由于缺水而处于休眠状态下的微生物重新恢复正 常的生活状态。酵母菌活化需要1 h左右，酵母细胞活化后 体积变大。 (2)配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液。 (3)配制海藻酸钠溶液：将0.7 g海藻酸钠放入50 mL小烧杯中， 加入10 mL水，用酒精灯小火加热(或者间断加热)，边加热 加搅拌，反复几次，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。 如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低， 则形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响
2．固定化细胞的方法与优缺点 (1)细胞固定化的方法 ①包埋法 a．含义：将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞 的方法。 b．凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于微 生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼 脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等。 ②吸附法 a．动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器 壁、微载体和中空纤维等载体上。
[思维激活1] 日常生活中人们用来蒸馒头的发酵粉在浸泡宜 用凉水、温水还是开水？ 提示 浸泡发酵粉最好用温水——温度过低，不利于发挥 酶活性；温度过高会杀死酵母细胞。
1．固定化酶的方法 酶的固定化方法大致可以分为以下三类： (1)包埋法：是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹 在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素 等半透性高分子膜中，如下图C、D。 (2)共价键结合法：是指将酶分子相互结合，或将其结合 到纤维素、琼脂糖、离子交换树脂等载体上的固定方式， 也叫交联法或化学结合法，如下图B。 (3)物理吸附法：是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法， 固体吸附剂多为活性炭、多孔玻璃等，如下图A。

第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )

• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。

稳定性等
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持

包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法

“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
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概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
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三 固定化酶的性质
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固定化细胞的优点 (1)固定化细胞含有一系列的酶，可以催化一系列的反应。 (2)反应的条件较易控制。 (3)使用时间更长。
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1．生产酒精时，使用固定化细胞比固定化酶更好，原因不包括( ) A．固定化细胞中含有一系列酶(与生产酒精有关) B．固定化细胞比固定化酶更经济、成本更低 C．固定化细胞需要提供营养物质 D．固定化细胞比固定化酶对环境条件要求低
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(4)制备固定化大肠杆菌的步骤为： ①______________________________________________________________； ②______________________________________________________________； ③______________________________________________________________； ④______________________________________________________________。
优点
催化效率高、耗能低、 污染低
①既能与反应物接触， 又能与产物分离 ②可以反复利用
成本低，操作容易、 寿命长
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①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。 ②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受 外界影响也较小。
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二、固定化酶的制备及利用 1．酶的固定化：(1)18.6%的 CaCl2 溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。 (2)3.65 mol/L 的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。 (3)在 5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。 (4)0.1 mol/L 的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。 (5)放 1 mg/mL 的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理 3.5 h)。 ↓

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D．溴化氰法
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（三）交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法称为 交联法。往往与其他方法连用
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（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
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（四） 包埋法
包埋法分为网格型和微囊型 1．网格型 2．微囊型
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（二）结合法
1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
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1 离子键结合法
常用载体:纤维素， 葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度
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2 共价键结合法
（ 1 ）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
（ 2 ）常用载体：天然高分子、人工合成 的高聚物、无机载体
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1．网格型
(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微 网格中，制成一定形状的固定化酶，称为 网格型包埋法。也称为凝胶包埋法
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2．微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，
参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不
能自行再生 有机辅因子价格昂贵
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辅酶固定化的方法：
2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化 氰法以及重氮偶联法等共价偶联。
3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之 间传递的障碍。
固定化酶与固定化细胞