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高效液相色谱法

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高效液相色谱法

高效液相色谱法
21
3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。 可用作正相色谱得固定相,洗脱剂常用
非极性或弱极性溶剂,加入适量得极 性溶剂,以调节洗脱强度。 极性小得先出峰,极性大得后出峰。
22
正相色谱常用固定相结构
氰 基
-(CH2)3C=N
氨 基
-(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇
-(CH2)3OCH(OH)CH2OH
等。
33
反相色谱得特点
A 适于分离带有不同疏水基团得化合物。 B 可通过改变溶剂组成与pH,来分离不同极
性得化合物。 C 可分离从极性到非极性得宽范围得化合物。
34
正相色谱得应用
正相色谱适用于分离极性化合物。如:酚 类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟 基化合物、氨基酸与药物等。这些样品在 正己烷或其它烷烃溶剂中得溶解度很小, 在极性溶剂中得溶解度良好。用正相色谱 分离可得到较好得效果。
2)装柱要求 均匀紧密、不破坏颗粒、不形 成裂缝 、颗粒粗细不可分级
53
3、色谱柱柱效得评价
最小理论塔板数 n＞104 分离度R≥1、5 拖尾因子 f =0、95-1、05 相对保留值得再现性
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4、 色谱柱得保 养
注意流动相得纯化 防止堵塞与污染 柱得操作压力＜装填柱得压力 应该用进样阀进样 防止柱得反冲 贮存色谱柱时应防止干涸 使用保护(预)柱
11
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
(1)无定形全多孔硅胶 : YWG ( 2)球形全多孔硅胶:YQG (3)堆积硅珠:YQG
高分子多孔微球:YSG
13
化学键合相色谱固定相
将固定液得官能团键合在载体得表面 而构成化学键合相。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;

高效液相色谱法 HPLC

高效液相色谱法 HPLC
点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓

二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）

高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)

高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)

• 在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非 极性的配基（烷基、苯基等）上的保留， 就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基 结合而造成的。
• 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越 牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增 加，其保留值也增大。
（2）计量置换模型
• 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当 样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之 间结合面上的溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被 “挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样 品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶 剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个，与保留时被“挤” 走的溶剂分子相等。
2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、 分子量大、高极性的有机物（70~80%的有机 物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500~800μL），易制备。 (4)分离效率降低。
二、一般分离流程
高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，
§7-1 一般流程及分离原理
一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑， 新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力 和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min） →分离速度↑（7~8个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。
• 另外，对照（a）和（d）可以 发现刚上样后，溶质分子形成的 色带（又叫谱带）较窄，而到了 （d）中，各组分的谱带明显变 宽，这说明同一组分沿柱子移动 时，存在着扩散问题，即谱带的 扩散。
图7-2 三组分样品 分离过程示意图

高效液相色谱法

高效液相色谱法

第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。

HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。

具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。

目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。

将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。

C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。

经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。

它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。

HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。

由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。

高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。

经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。

至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。

15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。

高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)

4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相 反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中， 使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保 留行为的一种色谱法。
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5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检 测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换 色谱法不同的是分离组分的检测器不同）
1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相 溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是 在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高 了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
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2、固定相 (1)担体(表面多孔型) 它是30～ 40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为 1 ～ 2μm的多孔硅胶。由 于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装 填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。
高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
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§3- 1 高效液相色谱法概述
一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做 流动相的新色谱技术.
而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性 增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大 分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。
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②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色 谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱ห้องสมุดไป่ตู้离条件的选择。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。

第五章高效液相色谱法

第五章高效液相色谱法
2019/7/25
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，

高效液相色谱法

高效液相色谱法

正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段

仪器分析-高效液相色谱法

仪器分析-高效液相色谱法
提高检测灵敏度。
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER

高效液相色谱法

高效液相色谱法

60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定

仪器分析第4讲 高效液相色谱法

仪器分析第4讲 高效液相色谱法

经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。

高效液相色谱法

高效液相色谱法
➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢空间排阻色谱法（SEC）
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2

高效液相色谱法

高效液相色谱法

高效液相色谱法高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是用于分离、定量、分析化合物的一种方法。

它以根据分子在固定相和液相之间的相互作用而分离样品。

本文将深入探讨高效液相色谱法的原理、应用和未来发展方向。

一、高效液相色谱法的原理高效液相色谱法的分离机理基于非极性、极性、离子交换和尺寸排除等不同的相互作用。

一般而言，液相为一种流动相，并通过柱子中的固定相与待测化合物相互作用。

根据它们与液相和固定相之间的相互作用，化合物会沿柱子分离出来，最终得到纯化的化合物。

二、高效液相色谱法的应用HPLC是一种广泛应用于制药、化学、食品科学和环境分析中的技术。

它可以分离和确定化合物的数量和结构。

以下是HPLC技术在不同领域中的应用：1.制药领域：HPLC技术用于对药品的定量分析、纯化和结构分析。

2.食品科学：HPLC可以用于分析食品中的添加剂、色素、维生素、氨基酸和酸、碱等。

3.化学领域：HPLC用于成分分析、物质纯度和纯化。

4.环境分析：HPLC技术可以用于检测水和土壤中污染物的浓度。

三、高效液相色谱法的未来发展方向1.更高效的柱技术：柱子是HPLC的核心部件之一，因为它们直接影响到分离的质量和速度。

未来的发展方向是更高效的柱技术，以支持更快的分析速度。

2.开发基于互联网的分析：互联网的出现带来了新的分析方法，因为通过数据分析和在线传输收集的信息能够实时分析。

将HPLC技术融合到互联网中，应该会得到一种新的分析技术。

3.集成分析平台：未来的高效液相色谱法分析将成为全自动过程，包括自动进样、色谱开展和数据分析等方面。

用于HPLC技术的集成分析平台将会是未来的发展方向。

四、结论高效液相色谱法作为分析化学中的重要技术，其原理和应用已为不同领域的研究提供了很大帮助。

未来，随着技术的进步和新的需求的出现，高效液相色谱法的发展前景将会更加广阔。

高效液相色谱法HPLC

高效液相色谱法HPLC
• 所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面 的综合效益。
五、高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱 2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反 之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase ）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可 用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温 类似，不同的是气相色谱改变温度，
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分 在最佳条件下得以分离。
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
举例：芳酸及其酯类药物分析
合成氨基水杨酸钠时，以间氨基酚为原料的 生产路线较为普遍，因此在成品中可能含有未 完全反应的间氨基酚。USP(24)采用离子对高效 液相色谱法检测间氨基酚的限量。
色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶 (C18,10um)；色谱柱为250mmX46mm；流动 相为磷酸二氢钠液(0.05mol/L)—磷酸氢二钠液 (0.05mol/L)—甲醇(含氢氧化四丁基铵 1.9g)(425:425:100)；检测波长为254nm；流速 为1.5ml/min。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相

（四） 亲和色谱固定相

亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。


极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
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子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实
质是样品分子与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子 间的作用。作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液
分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱 等类型。


流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分；
按极性可分为极性、弱极性、非极性；
按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂:
己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。

§3-1 高效液相色谱法的特点
HPLC： 是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型
分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极
为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱 基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、 高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、 灵敏度高、操作自动化的特点。
形成不同颜色的色带，他把玻璃管叫作”色谱 柱”，碳酸钙叫作“固定相”纯净的石油醚叫
作“流动相”。由此得名为“色谱“。该法后
来虽广泛用于无色物质的分离，但“色谱“一 词却被沿袭使用。

液相色谱分离原理及分类
液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相推动进入色谱柱。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离

高效液相色谱法的实际应用
※
利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中
的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质；反相
色谱分离水溶液中的物质（生化物质）。
※
用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法 分析离子型体的含量（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离 子等）。
※

流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - 影响容量因子k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间
出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分
子化合物。 利用手性固定相可以分离具有手性的化合物。

※
§3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
基础

热力学理论：塔板理论——平衡理论
理论

动力学理论：速率理论——Vander方程


液相色谱能完成难度较高的分离
气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，
与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而
在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高 选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以
上的液体作流动相，增大分离的选择性。
为减少传质阻力的影响， HPLC 对固定相均匀性和粒度的要 求更高。广泛使用薄壳型固定相和化学键合相固定相。 液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱 分离条件的选择。

在HPLC中, 速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可 以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u
故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。
影响分离的主要因素有流动大于0.5 cm/s时, H～u 曲线是一段斜率不大的直线。降
同的H-u曲线。

HPLC与GC的差别
1．分析对象的区别
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；
但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物
的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的
20%。
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质
溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量
操作严格，这是它的主要缺点。 在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。

高效液相色谱法的特点
高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色 谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施 加高压。
高速：分析速度比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力


液固吸附色谱法（吸附色谱）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等， 较常使用是 5 ～ 10μm 的硅胶吸附剂。流动相为各种不同极性 一元或多元溶剂。 分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离 (利用溶质分 子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 。)
大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型 样品均可检测用途广泛，占有机物的80%。

2．流动相差别的区别 GC ：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合 作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合
作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分
§3-3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
• 液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography)
• 液液分配色谱法（LLC）
（liquid-liquid partition chromatography ） • 离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography） • 空间排阻色谱法（SEC） （steric exclusion chromatography）
研制高效柱填料是一活跃领域。

3. 流动相及流动相的极性
• 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。可显著改变组
分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。
• 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固
定相的极性，称为正相液液色谱，极性柱也称正相柱。
• 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱， 非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺 序相反。
离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，
改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，
当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动 相也可以增大分离选择性。

3．操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4．其他
液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。

高效液相色谱法吸取了气相色谱与经典液相色谱优点， 并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前 高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上 有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、 多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离 和分析。
HPLC尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵，
加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备， 流速最高可达 103cm· min-1。HPLC所需的分析时间较之经典液 相色谱法少得多，一般少于 1h 。 高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一 步提高了分析的灵敏度。
低流速，柱效提高不是很大。但
在实际操作中，流量仍是一个调 整分离度和出峰时间的重要可选 择参数。

2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其
选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度；

HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均 匀的球形固定相（dp≤10μm）；首选化学键合相， 匀浆法装柱；
2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流
动相——甲醇，约1ml/min；
3. 柱温的选择：选室温25℃左右。

第三章 高效液相色谱法
（High Pertormance Liquid Chromatography）
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树
脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。
戴安UltiMate3000
t R t0 (1 K
S ) Vm
S kK Vm
分离前提：分配系数K不等或容量因子k不等。

固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
硅胶 原理：吸附
特点：峰易拖尾
适用：分离极性化合物 高分子多孔小球 原理：吸附+分配，兼小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
吸附的水→固定液

液液分配色谱法（分配色谱法）
流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶，有一个明 显的分界面。溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：


高效液相色谱与气相色谱
液相色谱所用基本概念与气相色谱一致：保留值、塔板
数、塔板高度、分离度、选择性等。 液相色谱所用基本理论也与气相色谱基本一致：塔板理 论与速率方程。 液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相， 而液体和气体的性质不相同，由于液体的扩散性比气体 的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，流动相 传质阻力就显得特别重要，而纵向扩散项对色谱峰的扩 展基本上可忽略；而在气相色谱中，流动相传质阻力可 以忽略不计，而纵向扩散项的影响很明显。从而形成不