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土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系，其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用，包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此，对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况，为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术近年来，随着高通量测序技术的不断发展和成熟，DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中，Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势，能够产生数百万到数十亿个序列，适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制，如读长短、测序偏差和寡核苷酸错误等，需要进行数据过滤和样本对比等后续分析。
二、FISH技术FISH（Fluorescence In Situ Hybridzation）是一种在原位的方法，能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA探针标记靶细胞的核酸序列，配合荧光探针进行检测和成像，可以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优势在于高分辨率的成像和定量准确性，能够提示具体的微生物存在形态，如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术PCR-DGGE（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因，然后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取-1K2SO4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
应用生态学报2013年8月第24卷第8期Chinese Journal of Applied Ecology，Aug．2013，24（8）：2301－2309武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落特征*吴则焰1，2林文雄2＊＊陈志芳3方长旬2张志兴2吴林坤2周明明2沈荔花2（1福建农林大学生命科学学院，福州350002；2福建农林大学农业生态研究所，福州350002；3福建农林大学林学院，福州350002）摘要运用BIOLOG微平板技术，对武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落结构和代谢功能多样性进行研究，探讨不同植被类型对土壤微生物群落的影响．结果表明：不论是土壤理化性质、酶活性，还是反映土壤微生物代谢功能多样性的平均颜色变化率（AWCD），青冈林和米槠林代表的天然林均明显优于马尾松林和杉木林代表的人工林，荒地最差．AWCD随着培养时间的延长而逐渐增加，但不同植被类型土壤AWCD值具有较大差异．碳水化合物和羧酸类碳源是各植被类型土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小．土壤微生物Simpson指数、Shannon指数、丰富度指数和McIntosh指数也呈现天然林高于人工林的趋势．主成分分析表明，从31个因素中提取的与碳源利用相关的主成分1、主成分2分别能解释变量方差的56．3%和30．2%，不同植被类型土壤微生物碳源利用特征出现分异，在主成分分离中起主要贡献作用的是胺类和氨基酸类碳源．研究结果可为进一步探讨植被多样性与土壤微生物多样性之间的关系奠定基础．关键词武夷山土壤微生物群落多样性植被类型BIOLOG文章编号1001－9332（2013）08－2301－09中图分类号S718．5；Q938文献标识码ACharacteristics of soil microbial community under different vegetation types in WuyishanNational NatureＲeserve，East China．WU Ze-yan1，2，LIN Wen-xiong2，CHEN Zhi-fang3，FANG Chang-xun2，ZHANG Zhi-xing2，WU Lin-kun2，ZHOU Ming-ming2，SHEN Li-hua2（1Col-lege of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou350002，China；2Instituteof Agroecology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou350002，China；3College of For-estry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou350002，China）．-Chin．J．Appl．Ecol．，2013，24（8）：2301－2309．Abstract：By using Biolog Ecoplate system，this paper studied the structure and functional diversityof soil microbial community under different vegetation types in Wuyishan National NatureＲeserve，aimed to probe into the effects of vegetation type on the diversity of soil microbial community．Theresults showed that the soil chemical properties，soil enzyme activities，and average well color de-velopment（AWCD）were higher in natural forest than in planted forest，and were the lowest inabandoned field．The AWCD reflecting soil microbial activity and functional diversity was increasedwith increasing incubation time，but there existed significant differences among different vegetationtypes．The carbon sources mostly used by soil microbes were carbohydrates and carboxylic acids，followed by amino acids，phenolic acids and polymers，and amines had the lowest utilization rate．The Simpson index，Shannon index，Ｒichness index and McIntosh index in natural forest were ho-listically higher than those in planted forest．Principal component analysis（PCA）identified2prin-cipal component factors in relation to carbon sources，explaining56．3%and30.2%of the varia-tion，respectively．The carbon sources used by soil microbial community differed with vegetation*福建省教育厅省属高校项目（JA12118）资助．＊＊通讯作者．E-mail：wenxiong181@163．com2012-11-19收稿，2013-05-17接受．types．Amino acids and amides were the two main carbon sources separating the2principal compo-nent factors．The results of this study could provide basis for further approaching the relationships between vegetation diversity and soil microbial community diversity．Key words：Wuyi Mountains；soil microbe；community diversity；vegetation type；BIOLOG．在植被-土壤系统中，土壤微生物不仅参与养分循环和物质代谢过程，直接影响地球生物化学循环，对植物凋落物降解、土壤理化性质改善起重要作用，而且通过改善土壤有机质等非生物因子间接影响植被生长［1］．土壤微生物既受到地上植被影响，又通过其自身性质的改变反作用于植被，与植被形成相互作用的反馈体系［2－3］．群落多样性作为土壤微生物生态学特征的关键指标［4］，近年来已成为生态学研究领域的热点问题，许多学者对其开展了大量研究，目前主要集中在环境变化与人为干扰对土壤微生物多样性的影响方面，如环境胁迫［5－6］、作物连栽［7］、化感作用［8］、施肥方式［9］等，其研究方法也不断改进和完善［10－13］．其中，BIOLOG分析法通过测定微生物对单一碳源利用程度，来反映微生物群体水平的生理轮廓，以此研究微生物群落的功能多样性．该方法简便、快速、灵敏度高、分辨力强，现已广泛应用于土壤微生物群落的功能多样性研究［14］，如比较不同土壤类型［15］、同类土壤不同植物物种［16－17］、不同管理策略下的农业土壤［18］、不同植被根际与非根际［19］的土壤微生物群落的代谢多样性等．在森林生态系统中，植被类型是影响土壤微生物群落的重要因素，地上植被显著影响着土壤微生物的群落结构及多样性［20］．Bach等［21］认为，凋落物和根系分泌物是土壤微生物的主要碳源，不同树种的微生物群落组成各异．此外，森林植被类型还可以间接影响森林土壤的理化性质，如pH、有机质含量、土壤结构和微气候等，进而对土壤微生物群落产生重要影响［22－23］．武夷山国家自然保护区作为中亚热带森林生态系统的典型代表，具有丰富的植物资源，是研究森林生态系统结构和功能的理想场地．许多学者对其开展了大量研究，但不同植被类型土壤微生物群落特性研究甚少，仅见何容等［24］、金裕华等［25］分别开展了土壤微生物量、土壤酶活性随海拔梯度变化的动态规律研究．本研究采用BIOLOG微平板技术，对武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落结构和代谢功能多样性的变化规律进行研究，旨在探讨不同植被类型土壤微生物群落功能的差异，解析地上植被和土壤微生物群落的相互关系．研究结果不仅可为揭示中亚热带森林生态系统土壤微生物变化规律提供理论依据，而且为进一步探讨植被多样性与土壤微生物多样性之间的关系奠定基础．1研究地区与研究方法1.1研究区概况武夷山国家自然保护区（27ʎ32'—27ʎ55'N，117ʎ24'—118ʎ02'E）是全球同纬度带保存最完整、面积最大的典型中亚热带原生性森林生态系统，是世界生物多样性保护的关键地区．该区位于福建省西北部，总面积99975hm2，属中亚热带季风气候，年均温17．6ħ，年降雨量1864mm，年相对湿度78% 84%，无霜期253 272d．其地质地貌属红色砂砾岩分布区，地层构造为中生代白垩纪，是第三纪系沉积的赤石群碎屑岩地层．区内植被垂直带谱分布完整，沿海拔植被带依次为常绿阔叶林、针叶林、亚高山矮林和高山草甸，主要优势树种为米槠（Cas-tanopisi carlesii）、青冈（Cyclobalanopsis glauca）、马尾松（Pinus massoniana）、杉木（Cunninghamia lanceola-ta）、黄山松（P．taiwanensis）、肿节竹（Oligostachyum oedogonatum）、白檀（Symplocos paniculata）、青茅（Calamagrostis brachytricha）等．1.2研究方法1.2.1土壤样品采集与处理2012年4月，分别选取海拔、坡度、光照等生态因子相近的米槠林、青冈林、马尾松林、杉木林等4种典型植被类型（其中米槠林和青冈林为天然林，马尾松林和杉木林为人工林，以荒地为对照），样地基本情况见表1．在每种植被类型下设置4个20mˑ20m样地，每个样地相距大于200m．在每个样地内用直径为3．5cm的土钻以S型分别采集5钻0 20cm深度土壤，混合为1个土样，装入封口袋并放入装有冰块的保温箱．土样带回实验室后充分混匀并分为2份，一份过2mm 筛后放在4ħ冰箱保存，用于土壤微生物群落特征及酶活性测定；另一份自然风干后过筛，用于土壤理2032应用生态学报24卷表1样地基本情况Table1Basic condition of plots调查植被Vegetation类型与年限Vegetation typeand years群落组成Community component海拔Altitude（m）坡度Slope（ʎ）郁闭度Canopydensity荒地Abandoned field（CK）长期荒置极少量芒萁A very small amount of Dicranopteris dichotoma35821－米槠林Castanopisi carlesii forest 天然林米槠+紫金牛+黑莎草C．carlesii+Ardisia japonica+Gahnia tristis387210．9青冈林Cyclobalanopsis glauca forest 天然林青冈+青茅+肿节竹C．glauca+Calamagrostis brachytricha+Oli-gostachyum oedogonatum373230．9马尾松林Pinus massoniana plantation 人工林，19年马尾松+檵木+芒萁P．massoniana+Loropetalum chinense+D．dichotoma365190．8杉木林Cunninghamia lanceolata plantation 人工林，19年杉木+淡竹+芒萁C．lanceolata+Phyllostachys glauca+D．di-chotoma330250．8化性质测定．1.2.2土壤理化性质及酶活性测定土样基本理化性质的测定采用林大仪［26］的方法．其中，土壤总有机碳（TOC）用重铬酸钾外加热法，全氮（TN）用半微量凯式法，全磷（TP）用硫酸-高氯酸消煮法，全钾（TK）用NaOH熔融火焰光度法，土壤pH值用水浸提电位法（土水比为1ʒ2．5），土壤含水率用质量法测定．土壤酶活性采用关松荫［27］的方法测定．其中，脲酶活性用靛酚蓝比色法测定，以24h后1g土壤中NH3的毫克数表示；蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以24h生成葡萄糖的毫克数表示；磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定，以2h后1g土壤中释放出酚的毫克数表示；过氧化氢酶活性用KMnO4滴定法测定，酶活性以每克土相当于0．1 mol·L－1KMnO4的毫升数表示．每个处理均设无基质对照，且每个处理3次重复，整个试验设无样品无基质对照．1.2.3土壤微生物群落功能多样性测定土壤微生物群落功能多样性测定采用BIOLOG ECO微平板法［28］．称取5g鲜土于经高压灭菌的三角瓶中，加入100mL含0．85%的NaCl无菌水，封口，120 r·min－1振荡30min，冰浴静置2min，取上清液5 mL于灭菌过的100mL三角瓶中，加入45mL无菌水，重复稀释3次，制得1ʒ1000的提取液，立即用于ELSIA反应．将BIOLOG-ECO平板预热到25ħ，用移液器取150μL提取液于各个孔中，28ħ恒温培养168h，每24h用Elx800TM酶标仪读取590nm 的吸光值．1.3数据处理土壤微生物群落利用碳源的整体能力，用平均颜色变化率（average well color development，AWCD）表示：AWCD=［∑（C i－Ｒ）］/n．其中：C i为所测定的31个碳源孔吸光值；Ｒ为对照孔吸光值；n为碳源数目．土壤微生物群落功能多样性指数分析采用Shannon指数、Simpson指数、丰富度指数和McIntosh 指数［29］．采用SPSS11．5软件进行数据统计、主成分分析和相关分析．2结果与分析2.1不同植被类型土壤理化性质及酶活性不同植被类型土壤理化性质差异显著（表2）．土壤pH在（4．37ʃ0．01） （5．02ʃ0．02），表明该地区植被土壤为典型的南方酸性土壤．土壤平均含水率在（25．1ʃ0．5）% （39．3ʃ0．3）%，表明该地区土壤含水率普遍较好，排序为青冈林＞米槠林＞马尾松林＞杉木林＞荒地，即天然林含水率高于人工林，荒地含水率最低．不同植被类型土壤化学性质存在较大差异，TOC和TP含量均为米槠林＞青冈林＞马尾松林＞杉木林＞荒地，TN和TK含量均为青冈林＞米槠林＞杉木林＞马尾松林＞荒地，表明天然林土壤养分含量明显大于人工林，荒地土壤养分含量最低．总体而言，天然林土壤理化性质优于人工林，荒地土壤最差．不同植被类型土壤酶活性差异显著（表3）．荒地各种土壤酶活性均低于其他样地．4种植被中，土壤脲酶活性最高的是米槠林（2．42ʃ0．05mg·g－1·24h－1），最低的是杉木林（1．58ʃ0．06mg·g－1·24 h－1），大小排序为米槠林＞青冈林＞马尾松林＞杉木林；磷酸酶活性最高的是米槠林（0．69ʃ0．04 mg·g－1·2h－1），最低的是马尾松林（0．37ʃ0．0230328期吴则焰等：武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落特征表2不同植被类型土壤部分理化性质Table2Soil chemical properties of different vegetation types植被类型Vegetation type pH含水率Water content（%）总有机碳TOC（g·kg－1）全NTN（g·kg－1）全PTP（g·kg－1）全KTK（g·kg－1）荒地Abandoned field（CK）4．82ʃ0．01c25．1ʃ0．5e52．39ʃ0．88e0．30ʃ0．01e0．07ʃ0．01d11．18ʃ0．08e米槠林Castanopisi carlesii forest4．73ʃ0．03d38．2ʃ0．2b149．17ʃ2．36a0．76ʃ0．02a0．28ʃ0．02a17．87ʃ0．09b青冈林Cyclobalanopsis glauca forest4．37ʃ0．01e39．3ʃ0．3a133．76ʃ1．14b0．69ʃ0．04b0．19ʃ0．01b20．63ʃ0．05a马尾松林Pinus massoniana plantation4．90ʃ0．01b31．9ʃ0．5d93．43ʃ1．10c0．42ʃ0．02d0．17ʃ0．01b14．19ʃ0．04d杉木林Cunninghamia lanceolata plantation5．02ʃ0．02a33．6ʃ0．7c78．28ʃ1．03d0．47ʃ0．02c0．11ʃ0．01c15．96ʃ0．09c 同列不同字母表示差异显著（P＜0．05）Different letters in the same column meant significant difference at0．05level．下同The same blow．表3不同植被类型土壤酶活性Table3Soil enzyme activities of different vegetation types植被类型Vegetation type脲酶Urease（mg·g－1·24h－1）磷酸酶Phosphatase（mg·g－1·2h－1）蔗糖酶Sucrase（mg·g－1·24h－1）过氧化氢酶Catalase（mL·g－1·20min－1）荒地Abandoned field（CK）1．12ʃ0．06e0．13ʃ0．02e12．19ʃ0．15e1．09ʃ0．05d米槠林Castanopisi carlesii forest2．42ʃ0．05a0．69ʃ0．04a43．94ʃ1．31a1．94ʃ0．03b青冈林Cyclobalanopsis glauca forest2．28ʃ0．06b0．56ʃ0．03b31．46ʃ0．62b2．81ʃ0．07a马尾松林Pinus massoniana plantation1．76ʃ0．03c0．37ʃ0．02d25．23ʃ0．47c1．57ʃ0．04c杉木林Cunninghamia lanceolata plantation1．58ʃ0．06d0．48ʃ0．01c19．05ʃ0．41d1．65ʃ0．03cmg·g－1·2h－1），大小排序为米槠林＞青冈林＞杉木林＞马尾松林；蔗糖酶活性最高的是米槠林（43．94ʃ1．31mg·g－1·24h－1），最低的是杉木林（19．05ʃ0.41mg·g－1·24h－1），大小排序为米槠林＞青冈林＞马尾松林＞杉木林；过氧化氢酶活性最高的是青冈林（2．81ʃ0．07mL·g－1·20min－1），最低的是马尾松林（1．57ʃ0．04mL·g－1·20min－1），大小排序为青冈林＞米槠林＞杉木林＞马尾松林．总体而言，4种土壤酶活性表现出共同的特征，即天然林土壤酶活性高于人工林，荒地土壤最低．2.2不同植被类型土壤微生物利用碳源动力学特征2.2.1土壤微生物利用全部碳源变化特征BI-OLOG微平板板孔平均颜色变化率（AWCD）反映了土壤微生物利用单一碳源的能力，是土壤微生物活性及群落功能多样性的重要指标［30］．计算不同植被类型土壤AWCD值的3次重复平均值，绘制AWCD 随时间动态变化曲线（图1）．由图1可知，土壤微生物总体变化趋势为：随着培养时间的延长，其利用碳源量逐渐增加，AWCD值呈S型曲线变化，但不同植被类型土壤平均颜色变化率存在较大差异．24h以内AWCD值最低，表明土壤微生物活性较低，碳源基本未被利用；24h以后AWCD值随时间增加而逐步增大，碳源开始被明显利用，其中青冈林和米槠林土壤的AWCD升高较快，杉木林和马尾松林土壤的AWCD上升较为缓慢．在72 96h内各植被类型土壤AWCD增长速率均达到最高，96h后逐渐趋于缓图1不同植被类型土壤微生物群落AWCD随时间变化Fig．1Changes of soil AWCD in different vegetation types with time．CK：荒地Abandoned field；Ca：米槠林Castanopisi carlesii forest；Cy：青冈林Cyclobalanopsis glauca forest；Pi：马尾松林Pinus massoniana plan-tation；Cu：杉木林Cunninghamia lanceolata plantation．下同The same below．4032应用生态学报24卷慢增长．培养168h后，各植被类型土壤的AWCD值均达到最大，大小顺序依次为青冈林＞米槠林＞杉木林＞马尾松林，其中青冈林最高（1．307），表明青冈林的土壤微生物群落代谢活性在4种植被中最高；马尾松林土壤AWCD值最低（0．750），表明马尾松林的土壤微生物群落代谢活性最低．2.2.2土壤微生物对不同碳源利用强度分析按化学基团的性质将ECO板上的31种碳源分成6类，分别是氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类．6类碳源均呈现出随着培养时间的延长，微生物利用碳源量逐渐增加的趋势．表4为每类碳源的AWCD平均值，由表4可知，不同植被类型土壤微生物对6类碳源利用率差异显著．不同植被类型土壤微生物对氨基酸类、碳水化合物类、聚合物类和酚酸类利用率呈现一致的规律，即青冈林＞米槠林＞杉木林＞马尾松林＞荒地；羧酸类利用率大小排序为米槠林＞青冈林＞杉木林＞马尾松林＞荒地；胺类利用率大小排序为米槠林＞杉木林＞青冈林＞马尾松林＞荒地．总体而言，在4种植被中，青冈林和米槠林代表的天然林土壤微生物对主要碳源利用率较高，马尾松林和杉木林代表的人工林土壤微生物对主要碳源利用率较低，青冈林对氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类碳源利用率分别为马尾松林的167．4%、149．4%、117．0%、187.9%、133．3%和130．2%．碳水化合物和羧酸类碳源是4种植被土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小．2.3土壤微生物群落功能多样性指数分析群落多样性指数可用来表征土壤微生物群落利用碳源的程度．根据培养96h的AWCD值计算得到不同植被类型土壤微生物群落的Simpson指数、Shannon指数、丰富度指数和McIntosh指数（表5）．结果表明，武夷山不同植被类型土壤微生物群落功能多样性用不同指数表示时存在较大差异．Simpson 指数可反映土壤群落中最常见物种，该值大小顺序是青冈林＞米槠林＞杉木林＞马尾松林，表明青冈林土壤中某些优势菌生长旺盛．Shannon指数反映了微生物群落物种变化度和差异度，Shannon指数较高代表微生物种类多且分布均匀，该值米槠林最高（4．69ʃ0．25），马尾松林最低（3．70ʃ0．20），表明米槠林土壤微生物群落种类最多且较均匀．丰富度指数表示被利用的碳源数目多少，该值米槠林最高（17．35ʃ1．28），马尾松林最低（11．99ʃ0．87），表明表4不同植被类型对土壤微生物群落6类碳源利用率的影响Table4Effects of different vegetation types on substrate utilization by soil microbial community植被类型Vegetation type 氨基酸类Amino acid碳水化合物类Carbohydrate羧酸类Carboxylic acid聚合物类Polymer胺类Amine酚酸类Phenolic acids荒地Abandoned field（CK）0．12ʃ0．01d0．34ʃ0．02d0．64ʃ0．02d0．20ʃ0．01e0．07ʃ0．01d0．24ʃ0．03d米槠林Castanopisi carlesii forest0．69ʃ0．03a1．05ʃ0．06b1．32ʃ0．03a0．54ʃ0．04b0．25ʃ0．03a0．79ʃ0．07a青冈林Cyclobalanopsis glauca forest0．72ʃ0．05a1．24ʃ0．09a1．24ʃ0．05b0．62ʃ0．02a0．16ʃ0．03bc0．69ʃ0．01b马尾松林Pinus massoniana plantation0．43ʃ0．01c0．83ʃ0．04c1．06ʃ0．06c0．33ʃ0．01d0．12ʃ0．02c0．53ʃ0．06c杉木林Cunninghamia lanceolata plantation0．58ʃ0．02b0．91ʃ0．03c1．12ʃ0．03c0．41ʃ0．01c0．19ʃ0．02b0．51ʃ0．03c表5不同植被类型土壤微生物群落功能多样性指数Table5Diversity indices for soil microbial communities of different vegetation types植被类型Vegetation type Simpson指数Simpson indexShannon指数Shannon index丰富度指数ＲichnessMcIntosh指数McIntosh index荒地Abandoned field（CK）0．59ʃ0．01e2．27ʃ0．16d7．83ʃ0．65d0．68ʃ0．05c米槠林Castanopisi carlesii forest0．96ʃ0．01b4．69ʃ0．25a17．35ʃ1．28a1．20ʃ0．09a青冈林Cyclobalanopsis glauca forest1．02ʃ0．01a4．37ʃ0．25ab16．32ʃ1．10a1．20ʃ0．13a马尾松林Pinus massoniana plantation0．81ʃ0．01d3．70ʃ0．20c11．99ʃ0．87c0．97ʃ0．10b杉木林Cunninghamia lanceolata plantation 0．89ʃ0．01c4．05ʃ0．18bc14．20ʃ1．03b0．89ʃ0．02b50328期吴则焰等：武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落特征米槠林土壤微生物利用碳源数目最多．McIntosh 指数反映了碳源利用种类数的不同，并能区分不同利用程度．米槠林和青冈林的McIntosh 指数都高于马尾松林和杉木林，表明米槠林和青冈林土壤微生物种类较为丰富，碳源利用程度较高．多样性指数分析结果表明，武夷山土壤微生物群落功能多样性在一定程度上受到不同植被类型的影响．不同多样性指数均反映出相同的规律，即天然林土壤微生物功能多样性明显高于人工林．2.4土壤微生物群落代谢功能主成分分析利用培养96h 的AWCD 值，对不同植被类型土壤微生物利用单一碳源特性进行主成分分析．根据主成分提取原则［12］，提取与土壤微生物碳源利用功能多样性相关的2个主成分累计贡献率达到86.5%．其中，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）依次可解释变量方差的56．3%和30．2%．因其他主成分贡献率较小，故只分析PC1和PC2（图2）．从图2可以看出，培养96h 时马尾松林和杉木林位于主成分1的负端；米槠林和青冈林位于主成分2的负端．可见，主成分1和主成分2基本上能够区分天然林和人工林土壤微生物群落特征．进一步将主成分得分系数与单一碳源AWCD 值作相关分析，在31种碳源中与PC1相关的有16个，其中12个呈正相关，主要是碳水化合物类和羧酸类；4个呈负相关，主要是胺类和氨基酸类碳源．而与PC2相关的碳源有4个，其中3个氨基酸类碳源呈负相关．可见，在主成分分离中起主要贡献作用的是胺类和氨基酸类碳源．2.5土壤理化性质与微生物群落功能多样性的相关性分析土壤养分含量，尤其是土壤有机质是土壤微生图2不同植被类型土壤微生物群落代谢主成分分析Fig．2Principal component analysis for carbon utilization of soil microbial communities in different vegetation types．表6土壤理化性质与微生物群落功能多样性相关系数Table 6Correlation coefficients between soil characteris-tics and microbial community functional diversitySimpson 指数Simpson index Shannon 指数Shannon index 丰富度指数Ｒichness McIntosh 指数McIntosh indexpH－0．394－0．512－0．476－0．579含水率Water content0．729*0．784*0．795*0．744*总有机碳TOC 0．914＊＊0．892＊＊0．903＊＊0．923＊＊全氮TN 0．834＊＊0．829＊＊0．807＊＊0．886＊＊全磷TP0．5020．6060．6310．497全钾TK0．3940．4170．4010．375*P ＜0．05；＊＊P ＜0．01．物重要的碳源和氮源，为探讨土壤养分与土壤微生物群落多样性之间的关系，进行土壤理化性质与微生物群落多样性的相关性分析（表6）．结果表明，土壤微生物群落功能多样性各指标与土壤总有机碳、全氮呈极显著正相关，与土壤含水率呈显著正相关．3讨论土壤微生物群落多样性的影响因素众多，其中植被类型是最重要的因素之一．本研究运用BI-OLOG 微平板法分析武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落多样性差异．结果表明，不论是土壤理化性质、酶活性，还是反映土壤微生物代谢功能多样性的平均颜色变化率（AWCD ）、功能多样性指数，均表现为天然林优于人工林，荒地最差．可见，在立地条件一致的情况下，不同植被类型导致土壤微生物群落结构和功能的不同．具体而言，AWCD 表现为随着培养时间的延长，其利用碳源量逐渐增加，但不同植被类型土壤的AWCD 值具有较大差异，天然林土壤AWCD 值明显大于人工林，与毕江涛等［31］、张文婷等［32］的研究结果相似．青冈林和米槠林代表的天然林土壤微生物对主要碳源利用率高于马尾松林和杉木林代表的人工林，碳水化合物和羧酸类碳源是各植被类型土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小．土壤微生物Simpson 指数、Shannon 指数、丰富度指数和McIntosh 指数也呈现天然林高于人工林的趋势．PCA 分析表明，不同植被类型土壤微生物群落代谢多样性能够明显区分．从31个因素中提取的与碳源利用相关的主成分1、主成分2分别能解释变量方差的56．3%和30．2%，不同植被类型土壤微生物碳源利用特征出现分异，在主成分分离中起主要贡献作用的是胺类和氨基酸类碳源．土壤微生物群落多样性是土壤养分、水热状况、6032应用生态学报24卷凋落物和根系分泌物等因素综合作用的结果，反映了土壤肥力状况与植物营养的密切关系．研究表明，在森林生态系统中，土壤微生物与植物类型紧密相连，不同植被类型通过改变凋落物数量和组成影响土壤理化性质，进而导致土壤微生物组成、数量和分布差异［33－35］．在本研究中，青冈林和米槠林代表的天然林土壤微生物群落多样性明显高于马尾松林和杉木林代表的人工林，表明不同植被类型影响了地下土壤微生物群落特征．土壤理化性质与微生物群落功能多样性相关性分析表明，土壤微生物群落功能多样性各指标与土壤总有机碳、全氮之间存在极显著正相关，与土壤含水率呈显著相关．可见，不同植被类型影响土壤微生物多样性的主要因素在于土壤有机质含量的差异．该结论与钟文辉和蔡祖聪［36］对近年来国内外研究成果的总结相一致．土壤有机质含量对于提供维持土壤各种功能所必需的能量、底物和生物多样性至关重要，是影响土壤微生物群落组成的关键因素，且受有机质转化的影响，士壤有机碳与土壤微生物功能多样性之间存在明显的相关性．天然林和人工林的林分凋落物数量和质量不同，导致土壤养分含量存在较大差异．在野外调查中发现，青冈林和米槠林群落林下物种多样性较为丰富，林分凋落物数量也多于马尾松林和杉木林，使其土壤总有机碳、全氮、全磷、全钾等养分均显著优于马尾松林和杉木林．土壤微生物群落功能多样性指数分析表明，青冈林和米槠林土壤Shannon多样性指数和Simpson指数都较高，说明其凋落物更易分解，在土壤中形成的有机质含量相对要高，从而更有利于土壤微生物生长和代谢．其次，土壤含水量不同，导致土壤微生物活性存在较大差异．Gordon等［37］和Xiang等［38］研究发现，较高的土壤含水量可提高土壤微生物活性．人工林的水土流失较天然林严重［39］，加剧了作为土壤微生物群落碳源的土壤有机质流失，使得土壤微生物生存的环境条件受到影响，因而人工林土壤微生物群落多样性相应减低．再者，天然林和人工林植物根系分泌物与脱落物不同．与人工林相比，天然林群落物种多样，结构更为复杂，具有较高的根系生物量和根系分泌物，为土壤微生物提供了丰富的碳源，其土壤微生物的结构和功能也相应增强．可见，在立地条件一致的情况下，不同的植被类型影响土壤微生物群落多样性，与人工林和荒地相比，天然林不仅更有利于提高土壤理化性质，且在增加利用某类或多类碳源的微生物种群（多样性指数）、提高微生物群落利用单一碳源的整体能力（AWCD）方面具有显著优势，这对于改进森林生态系统管理经营策略具有重要的指导意义．土壤微生物作为森林生态系统的重要组成部分，通过相互竞争、协调、驱动养分循环等作用影响着植物多样性，所以仅研究地上植物显然难以解释生态系统的整体作用机制．研究土壤微生物群落的结构和功能多样性，对于揭示植物-土壤-微生物之间的关系意义重大［40］．目前，土壤生物多样性是当今生物多样性研究中的一个薄弱环节，《Science》2004年304卷同时刊登了7篇关于土壤生物和生物多样性的文章，特别强调了研究土壤生物多样性的重要性和迫切性［41］．本研究利用BIOLOG法分析武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落特征，取得了理想效果．然而，BIOLOG法只能表征土壤中快速生长或富营养微生物活性，不能反映土壤中生长缓慢的微生物活性，且只能对环境微生物群落进行比较和识别以及群落活性与功能分析，无法直接获取微生物群落结构的详细信息．尽管BI-OLOG分析法存在一定缺陷，但它仍然是研究土壤微生物代谢功能的一种快速有效方法．由于土壤微生物的复杂性和土壤中绝大多数微生物不可培养性，必须结合其他群落结构分析方法开展土壤微生物群落功能类群研究．随着研究深入和技术改进，结合其他土壤微生物研究方法，如末端限制性片段长度多态性（T-ＲFLP）、磷脂脂肪酸（PLFA）、土壤蛋白质组学等分子生物学方法，将有助于进一步揭示中亚热带森林生态系统土壤微生物多样性与地上植被多样性之间的关系．参考文献［1］Zhang Y-Y（张燕燕），Qu L-Y（曲来叶），Chen L-D （陈利顶），et al．Soil microbial properties under differ-ent vegetation types in Loess hilly region．Chinese Jour-nal of Applied Ecology（应用生态学报），2010，21（1）：165－173（in Chinese）［2］Jia GM，Cao J，Wang C，et al．Microbial biomass and nutrients in soil at the different stages of secondary forestsuccession in Ziwuling，northwest China．Forest Ecologyand Management，2005，217：117－125［3］Sinha S，MastoＲE，Ｒam LC，et al．Ｒhizosphere soil microbial index of tree species in a coal mining ecosys-tem．Soil Biology and Biochemistry，2009，41：1824－1832［4］Jin Z-Z（靳正忠），Lei J-Q（雷加强），Xu X-W（徐新文），et al．Microbial diversities of shelter forest soilsin the extremely arid area．Acta Ecologica Sinica（生态学报），2009，29（8）：4548－4559（in Chinese）［5］Zhou L-L（周玲莉），Yao B（姚斌），Xiang Y-Z70328期吴则焰等：武夷山国家自然保护区不同植被类型土壤微生物群落特征。
生态学报2010,30(3):0817)0823Ac ta Ecologica S inica微生物生态研究中基于BI OLOG方法的数据分析王强1,戴九兰2,吴大千1,余悦1,申天琳1,王仁卿1,2,*(1.山东大学生命科学学院,山东济南250100;2.山东大学环境研究院,山东济南250100)摘要:B I OLOG微平板法作为一种方便快速的微生物检验技术,已广泛应用于环境微生物检测,微生物生态研究等方面,发挥着越来越重要的作用。
该方法可以获得关于微生物群落碳源利用能力的大量数据,反映出关于微生物活性的丰富信息。
然而大量的数据也对解释和分析提出了挑战,分析了应用于BIOLOG产生数据的统计分析方法,对常用的AW CD值计算,多样性指数计算,主成分分析(PCA),聚类分析,相关、回归等方法深入探讨,阐述各自的功能、不足以及在应用中容易出现的问题。
另外也对一些不常见的方法,如非参数多元分析(N on-Para m etric version ofMANOVA/P er m utati on version ofMANOVA)、动力学参数分析、多元回归树、典范对应分析等也进行了讨论。
通过对不同方法应用目标和原理的分析论述了各自优缺点,对微生物研究中基于B I OLOG方法数据分析的选择应用提供参考。
关键词:B I OLOG;多元统计;环境微生物;数据分析;微生物生态Statistical anal ysis of data fro m B I OLOG m ethod i n the study of m icrobi al ecologyWANG Q iang1,DA I Ji u l a n2,WU D aqian1,YU Yue1,SHEN T ianli n1,WANG Renq i n g1,2,*1In stit u te of Ecology and B io d iversit y,Colle g e of L i fe Sc ie nce,Shandong Un i versit y,Ji c nan250100,China2E nvironm ent R esearc h In stit u t e,S handong Un i v e rsit y,J i c nan250100,Ch i naAbstract:The BI OLOG method has been w idely used to study m i crobial co mm un ity dyna m ics and has pr oved to be a useful tool in the research o fm icrobial ecology.A s a quic k and conve n i ent m et hod,it can prov i de a great a m ount o f data which reflect co mmun ity-level physi olog ical profili ng of m icrobial co mmunities.H o wever,the anal ysi s and interpretation of these multivari ate data has turned out to be one of t he intractable c ha llenges i n studies.T his wor k i ncl uded different methods previousl y appli ed i n BI OLOG analysis and clarified the pur poses and functi ons of these statistical m ethods.AWCD (A verage well color development)val ue,diversity i ndices,PCA(pri ncipal co m ponent ana l ysis),cluster analysis, correlati on analysis and regressi on analysis w ere d iscusse d acc ordi ng to their purposes,a l ong w ith co mm on m i stakes and abuses.W e a lso i nvolved a Non-Par a m etric version of MANOVA,catabolic profiles m ethods,canon ical correspondence analysis and mult i ple regressi on tree analysis as extensions.T hiswork w ill hel p the application of the BI OL OG m et hod and m i pr ove understanding of the functions of m icroor ganis m s i n ecosyste m s.K eyW ords:BI OLOG;multi variate statistics;environ m ental m icr obes;data analysis;m icrobial ecology微生物是地球化学循环中的重要组成部分,由于其分布广泛,对环境敏感、易变异,且在生态系统中具有不可替代的作用,近年来受到了越来越多的重视[1-2]。
土壤微生物群落的结构与功能分析土壤是人类最重要的资源之一，其上生长着各种植物，供人类食用。
而支持土壤中植物生长的是丰富多样的土壤微生物，如细菌、真菌和原生生物等。
土壤微生物群落的结构和功能对土壤健康和生态系统的稳定性有着重要的影响。
本文将介绍土壤微生物群落的结构和功能分析方法以及它们在生态学和农业生产上的应用。
一、土壤微生物群落的结构分析土壤微生物群落的结构通常是指土壤微生物的种类和数量。
通过DNA提取和PCR扩增等分子生物学方法，可以获取一定的土壤微生物丰度数据和多样性信息。
具体而言，我们可以通过以下方法来分析土壤微生物群落的结构：1. 高通量测序技术高通量测序技术通常指Illumina测序平台。
通过将土壤DNA片段插入到Illumina通用测序适配器中，然后通过PCR扩增，最后将扩增产物纯化后进行高通量测序。
这种方法可以产生大量的数据，使得研究人员可以同时获得微生物群落的多样性和种类信息。
2. 16S rRNA测序16S rRNA基因是微生物中一种具有高度保守性的核糖体RNA分子。
利用16S rRNA基因的序列来对微生物进行分类和鉴定已成为最常用的方法之一。
通过利用引物筛选该基因片段，可以通过PCR扩增生成DNA产物然后进一步进行测序。
这种方法在微生物的培养和分离比较困难的情况下，显得尤为有用。
3. 其他方法除了高通量测序和16S rRNA测序之外，还可以利用DGGE、T-RFLP和FISH等技术来分析土壤微生物群落的结构。
二、土壤微生物群落的功能分析土壤微生物群落的功能通常包括物质循环、能量转换和生境保持等方面。
因此，在分析土壤微生物群落功能时，我们通常关注微生物拥有哪些代谢功能以及这些功能对土壤生态系统的影响。
1. 生物量测定生物量测定是通过测量微生物群落的总体积或总重量来估计微生物群落的数量和代谢活性程度的方法。
这种方法可以使研究人员更准确地预测微生物对土壤生态系统的能力。
2. 基础、包氧和脱氯代谢微生物基础代谢是指其对有机物进行分解和羟化的能力。
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长期有核心期刊论文转让!有机肥料对土壤微生物多样性影响研究进展何康摘要:主要介绍了传统法、BIOLOG法、磷脂脂肪酸(PLFA)法、PCR分析法进行土壤微生物多样性分析的优缺点,阐述了有机肥概念,综述了有机肥对土壤微生物多样性的影响。
指出施用有机肥对微生物多样性的不同影响,合理配施有机肥对于土壤微生物数量、结构和组成都有影响,有助于降低作物发病率,同时能够有效提高作物产量和产值。
文章还针对当前研究的方法和探索的方向进行了归纳和总结,对今后有机肥关于微生物的研究方向进行了展望。
关键词:有机肥;微生物;多样性土壤微生物是土壤有机质和养分转化、循环的动力,是土壤具有生命力的标志性特征,与土壤健康和肥力有着密切关系,对周围环境的变化做出迅速反应,在土壤不断的形成、发育、能量传递和物质转换过程中发挥着非常重要的作用,是目前评价土壤质量的重要指标,对自然元素循环具有重要意义[1]。
随着近年来,人口的急速增加、自然环境和资源的过度开发使用、环境问题的加剧和外来生物物种的入侵,使得土壤微生物多样性受到了强烈的影响和干扰[2-4]。
多层次的深入研究土壤微生物多样性能有助于了解土壤目前的状况,并以此为基础制定生态环境保护、自然资源合理利用的措施。
随着研究技术的更新和完善,微生物多样性研究方法和层次都得到了大幅度提升和改善,有关土壤微生物多样性的研究方向和角度愈发深入[5-6]。
本文在前人研究的基础上重点探讨了目前较为常见的几种土壤微生物多样性的研究方法,以及施用有机肥对土壤微生物多样性影响的研究进展。
1 土壤微生物多样性主要分析方法传统微生物多样性的研究分析方法的原理是根据已知的目标微生物特性来选择合适的培养基进行实验培养,然后通过对各种微生物在培养期间的生理生化特征和外观形态不同的变化进行区分鉴定。
利于衡量小型微生物群体的多样性,其优点是简便快捷。
但是由于技术条件的限定,常导致微生物富集生长,且反映的微生物信息有限,误差大[7-9]。
土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(Mierobia lBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L-1 K2SO4（图水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L-1 K2SO4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L-1K2Cr2O7—12 mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N 、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass ，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um 3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO 2，根据释放出的CO 2:的量和微生物体矿化率常数Kc 可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol ·L -1K 2SO 4（图水比为1:4；w ：v ），振荡30min （300rev ·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL 聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol ·L -1K 2SO 4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL 上述土壤提取液于150mL 消化管（24mm х295mm ）中，准确加入10mL0.018mol ·L -1K 2Cr 2O 7—12mol ·L -1H 2SO 4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min （放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
