污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法

土壤修复后的监测指标1.引言1.1 概述概述部分的内容可以简要介绍整篇文章的主题和目的，以引起读者的兴趣并提供文章的背景信息。

下面是一个概述的例子：概述：随着人类对土地的不断开发和利用，土壤污染问题日益严重。

土壤污染不仅对农业生产和生态环境造成了威胁，还对人类健康产生了潜在风险。

为了解决土壤污染问题，土壤修复成为了一种重要的解决方法。

然而，仅仅进行土壤修复并不能保证修复效果的长期稳定性和可持续性。

因此，对土壤修复后的监测指标进行科学的评估和监测显得尤为重要。

本文将重点探讨土壤修复后的监测指标，通过对修复后土壤的物理、化学和生物指标进行监测和评估，旨在全面了解土壤修复效果，并为土壤修复方案的调整和优化提供科学依据。

同时，本文还将提出对土壤修复监测的重要性，强调监测工作在土壤修复过程中的作用和必要性。

通过对土壤修复后的监测指标的深入研究和分析，可以为土壤修复工作提供科学依据，促进土壤环境的健康恢复和可持续发展。

本文将从土壤修复的背景入手，详细介绍土壤修复后的监测指标，并总结土壤修复监测的重要性。

相信通过本文的阐述，读者将能够更好地了解土壤修复后的监测指标，并认识到其在土壤修复工作中的重要价值。

1.2文章结构文章结构部分的内容可以如下编写：1.2 文章结构本文将围绕土壤修复后的监测指标展开论述。

首先，我们将在引言部分概述土壤修复的背景，介绍土壤修复所面临的问题和重要性。

随后，正文部分将详细探讨土壤修复后的监测指标，包括常见的理化指标和生物学指标。

我们将介绍这些监测指标的基本含义、作用及其在土壤修复过程中的应用情况。

同时，将重点讨论这些监测指标与土壤修复效果的关系，以及如何通过监测来评估修复效果的可靠性和科学性。

最后，在结论部分，我们将对全文进行总结，并强调土壤修复监测的重要性，进一步探讨其在实践中的应用前景和挑战。

通过本文的阐述，我们旨在提供给读者一个全面、系统的了解土壤修复后的监测指标的知识，并为相关领域的研究和实践提供参考。

第 45 卷第 1 期 Vol.45 No.12024 年 3 月Mar. 2024农业科学研究Journal of Agricultural Sciences镉污染对农田土壤丛枝菌根真菌群落的影响屈洁1，2，3，刘文娟1，2，3，胡媛媛1，2，3，马建军4，李虹4，马琨2，3（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750021；2.宁夏大学西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地，宁夏银川750021；3.西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室，宁夏银川750021；4.宁夏农业环境保护监测站，宁夏银川750001）摘要：为揭示重金属镉（Cd）污染对农田土壤丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌群落组成及多样性的影响机制，以Cd污染区和未污染区农田土壤为研究对象，利用高通量测序方法，分析土壤AM真菌群落组成及多样性间的差异，研究农田土壤Cd污染下驱动AM真菌群落组成及多样性变化的主要土壤环境因子及其效应。

结果表明：Cd污染与未污染区农田土壤中AM真菌优势属均为球囊霉属（Glomus）和类球囊霉属（Paraglomus），所占比例为37.80%~57.27%；球囊霉属AM真菌的相对丰度存在极显著差异（P<0.01）。

Cd污染区域土壤中AM真菌群落物种数、Chao1指数比未污染区土壤分别低21.97%、22.36%，Shannon指数、Simpson指数分别低14.80%、5.26%，且差异极显著（P<0.01）。

非度量多维尺度（NMDs）分析表明，Cd污染区土壤AM真菌群落组成与未受污染区土壤间存在差异，Cd污染显著改变了土壤AM真菌群落的β多样性。

Cd污染下，土壤有效态Cd（P=0.004）和全磷质量比（P=0.042）是驱动AM真菌群落结构发生变化的主要因子。

土壤全Cd质量比（P=0.01）是引起AM真菌群落多样性变化的主要因素。

土壤有效态Cd质量比对AM真菌群落组成、土壤总Cd质量比对AM真菌多样性变化有直接效应；污染区土壤中Cd质量比较土壤全磷质量比更容易引起土壤AM真菌群落结构及多样性的变化。

土壤学家的100个土壤测试方法土壤，作为生命的基础，对于人类的生存和发展有着不可替代的重要作用。

然而，随着人类活动的不断扩张和加剧，土壤遭受了极大的破坏和污染。

因此，能够对土壤进行科学和全面的检测和评估就显得尤为重要。

作为从事土壤研究的土壤学家，我们需要掌握一定的土壤测试方法来保证研究的准确性和科学性。

在这里，我将向大家介绍100个常用的土壤测试方法。

一、土壤理化性质的测试方法1. 粘土矿物分析法：利用X射线衍射仪或显微镜对土壤中的粘土矿物进行分析，以推断土壤的物理、化学和性质。

2. 土壤水分测定法：采用重量计法或滤纸试吸法测定土壤的干湿状态，以评估土壤的含水量。

3. 土壤容重测定法：利用容重试验器测定土壤的容重，以评估土壤的质地和密实度。

4. 土壤有机质含量测定法：采用加热酸化法或燃烧法测定土壤中的有机质含量。

5. 土壤pH测试法：通过pH试纸、pH计等工具测定土壤的酸碱度，以评估土壤的肥力和化学性质。

6. 土壤电导率测定法：利用电导仪等工具测定土壤的电导率，作为评估土壤盐碱度的重要指标。

7. 土壤粘粒含量测定法：利用湿筛法、液限试验等方法测定土壤中的粘粒含量，以评估土壤的质地和结构。

8. 土壤饱和状况测定法：采用气压浸泡法、蒸汽浸泡法等方法测定土壤的饱和状况，以评估土壤的水力学特性。

9. 土壤孔隙度测定法：利用质量法、容重法等方法测定土壤的孔隙度，以评估土壤的渗透性和通气性。

二、土壤微生物和生物学特性的测试方法10. 土壤微生物孔板数法：利用孔板法测定土壤中微生物的数量和种类分布，以评估土壤的生物量和多样性。

11. 土壤微生物活性测定法：利用蔗糖降解法、ATP酶法等方法测定土壤微生物活性的大小，以评估土壤的养分循环和生命活力。

12. 土壤酶活性测定法：利用过氧化氢酶法、联苯胺酶法等方法测定土壤中酶活性的大小，以评估土壤的生物化循环和正常性。

13. 土壤呼吸速率测定法：利用CO2通量和氧化还原电位等指标测定土壤的呼吸速率，以评估土壤的微生物代谢和活力。

收稿日期：2008-05-13基金项目：中国科学院创新项目（KZCX2-YW-407）；中国科学院野外台站基金项目和国家科技支撑计划课题（2006BAD05B01作者简介：毕明丽（1984－），女，在读硕士，从事土壤肥力与养分循环研究。

E-mail:bi-yours@ *通讯作者：E-mail:wtyu@农田生态系统微生物多样性研究方法及应用毕明丽，宇万太*（中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016）摘要：微生物在农田生态系统中占据着很重要的作用，其结构和功能的多样性及变化在一定程度上反映了农田生态系统的基本状态，因此非常有必要应用有效的方法来研究农田微生物的多样性、分布及行为等。

但是通过传统的微生物培养和鉴定方法得到的微生物信息很片面，不足以代表微生物在农田生态系统中的真实情况。

而近几十年来兴起的微生物研究新方法突破了传统方法的限制，极大地促进了微生物学的发展。

本文介绍了现在常用的微生物多样性研究方法及其在农田生态系统中的应用现状。

关键词：微生物多样性；研究方法；分子生物学；农田生态系统中图分类号：S153.6文献标识码：A文章编号：0564-3945(2009)06-1460-07Vol.40,No.6Dec.,2009土壤通报Chinese Journal of Soil Science第40卷第6期2009年12月微生物是农田生态系统的重要组成部分，在动植物残体分解、养分循环、氮的固定、土壤结构与肥力保持和病虫害防治等方面都起着很重要的作用[1]，微生物的多样性和群落结构在一定程度上反映了农田生态系统的基本状况，保持微生物的生态过程和多样性是农业生产赖以生存的基础。

通过研究农田生态系统中微生物的分布和多样性，探讨农田生态系统的影响因素及其作用机理，可以为今后制定农业管理计划提供科学依据，具有很重要的理论和实践意义。

农田生态系统中微生物种类极其丰富，文献记载1g 农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子、数万个原生动物和藻类[2]，它们在农田生态系统中起着至关重要的作用。

土壤微生物多样性的概念土壤微生物多样性又称微生物群落结构,是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化[1] 。

它代表着微生物群落的稳定性,也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。

生物多样性还可以定义为生命的丰富度( richness of life) ,通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。

由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[2] 。

生物多样性作为指标在监测土壤变化和对胁迫的反映方面是重要的,同时对进一步了解土壤微生物群落状态也十分有用。

随着人们对环境资源保护意识的逐步加强和因人类影响而造成的多样性损失的客观存在,目前学术界对多样性问题倍加关注。

在微生物群落研究中,微生物的均衡性、丰富性和多样性是常用的指标[3] 。

[ 1 ] Pankhurst CE et al . Defining and assessing soil healt h and sustainable productiving [ A ] . 1997. Biological Indicators of soil Health[ C] CAB international . [ 2 ] 孙波,等. 土壤质量与持续环境Ⅲ. 土壤质量评价的生物学指标[J ] . 土壤, 1997 , 29 : 225～234.[ 3 ] Kennedy AC et al . Soil microbial diversity and t he sustainability of agricultural soils [J ] . Plant and Soil ,1995 (170) : 75～86.土壤微生物多样性研究的核心内容应是自然或干扰条件下土壤微生物的群落结构、种群消长、生理代谢、遗传变异及其演替规律,尤其是环境变更或管理分异条件下土壤质量的微生物学监测、评价与调控,以及土壤微生物种质资源的开发与应用。

土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望21土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望摘要：土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机质分解、养分释放和能量释放中起着重要作用量转移等中起着重要作用。

随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进,土壤微生物群落结构多样性,尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。

本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状,并对其未来研究方向进行了合理展望。

关键词：微生物群落结构土壤微生物群落土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等。

土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素,土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用。

由于土壤中微生物个体微小,数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因,目前为止大约仅1～10%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物在陆地生态系统中重要作用的认识。

虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。

近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群土壤微生物结构及其影响因素的研究、土壤微生物结构与生态功能的关系以及土壤微生物对土壤质量的维持，越来越受到土壤科学家、生态学家和微生物学家的重视。

[1]许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%~10%，传统的土壤微生物研究方法如分离计数法、显微镜法往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，虽然使用电子显微镜或荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态多样性进行观察，但是这两种方法并不能描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。

随着微生物研究技术的发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法。

《草甸生态系统土壤微生物群落特征和土壤多功能性的研究》篇一一、引言草甸生态系统作为自然生态系统的重要组成部分，具有独特的生态功能和生物多样性。

土壤微生物群落作为草甸生态系统的基础组成部分，对维持土壤健康、促进生态平衡具有重要作用。

同时，土壤的多功能性也是评价草甸生态系统健康与否的重要指标。

因此，对草甸生态系统土壤微生物群落特征及土壤多功能性的研究具有重要的科学意义和实践价值。

二、草甸生态系统土壤微生物群落特征1. 微生物群落结构草甸生态系统的土壤微生物群落主要由细菌、真菌、放线菌等组成。

这些微生物在土壤中形成复杂的网络结构，相互依存、相互制约，共同维持着土壤生态平衡。

不同草甸生态系统的土壤微生物群落结构存在差异，这与其地理位置、气候条件、植被类型等因素密切相关。

2. 微生物群落功能草甸生态系统土壤微生物群落具有分解有机物、固定氮素、溶解磷酸盐等功能。

这些功能对于维持土壤肥力、促进植物生长具有重要作用。

此外，土壤微生物还能通过其代谢活动影响土壤的物理、化学和生物性质，进一步影响草甸生态系统的功能和稳定性。

三、土壤多功能性草甸生态系统的土壤具有多种功能，如保持水土、净化环境、提供生物栖息地等。

这些功能的发挥与土壤的物理性质、化学性质和生物性质密切相关。

其中，土壤微生物群落是影响土壤多功能性的重要因素之一。

土壤微生物通过其代谢活动影响土壤的养分循环、有机物分解等过程，从而影响土壤的肥力和质量。

此外，土壤微生物还能通过其生物量、多样性和分布等特征影响土壤的物理结构和化学性质，进一步影响土壤的多功能性。

四、研究方法与数据分析1. 研究方法本研究采用野外采样和实验室分析相结合的方法，对草甸生态系统的土壤微生物群落特征和土壤多功能性进行研究。

具体包括采集不同类型草甸生态系统的土壤样品，通过PCR扩增、高通量测序等技术对土壤微生物群落结构进行分析；同时，通过测定土壤的物理性质、化学性质和生物性质，评价土壤的多功能性。

重金属污染对土壤微生物群落结构的影响重金属污染是近年来全球环境面临的主要问题之一。

其对土壤微生物群落结构的影响也逐渐受到关注。

本文将论述重金属污染对土壤微生物群落结构的影响与其机制，并从进行有效治理的角度提出建议。

一、重金属污染对土壤微生物群落结构的影响1. 重金属污染导致土壤微生物群落数量减少重金属污染会影响土壤微生物的生长和繁殖，甚至导致微生物死亡，因此会导致土壤微生物的数量减少。

沉积物、土壤微生物孔隙和土壤胶体颗粒表面几乎覆盖着重金属，以致于土壤中的微生物受到重金属的直接毒害。

2. 重金属污染影响土壤微生物群落的多样性研究表明，重金属污染会影响土壤微生物的种类分布和多样性，使得土壤微生物群落多样性降低。

该现象是由于重金属污染催化微生物之间的竞争，有些微生物会由于耐受性差而死亡或被淘汰，进而造成相对稳定的土壤微生物群落。

3. 重金属污染影响土壤微生物代谢特性重金属污染不仅导致土壤微生物数量减少和多样性下降，还会影响土壤中微生物的代谢特性。

研究发现，重金属例如镉、汞等会降低土壤微生物的呼吸速率、碳氮比等代谢特性。

在某些情况下，重金属污染会导致特定微生物菌株的菌丝分化减少和液滴分泌增加，影响微生物的生长速率。

二、重金属污染导致土壤微生物群落结构变化的机制1. 毒性作用重金属污染对土壤微生物的毒性作用是导致微生物死亡和数量减少的主要原因。

由于土壤中存在的微生物种类络绎不绝，其对重金属的敏感度也各不一样，这就导致土壤微生物群落的复杂性和多样性下降。

2. 影响微生物的代谢重金属的毒性作用主要由微生物代谢过程引起，它改变微生物代谢、酶系统、蛋白质合成和DNA结构。

一些微生物通过代谢产生化合物，并对环境产生影响来拓展土壤微生物群落的多样性，降低重金属污染对微生物的毒性效应。

3. 影响微生物之间的相互作用研究表明，重金属污染还将影响微生物之间的相互作用，从而导致土壤微生物群落结构的变化。

对重金属敏感的微生物会因缺乏合适的营养来源而慢慢死亡，占优势的重金属耐受微生物会不断增多，从而导致土壤微生物群落结构的改变。

土壤污染鉴定方法土壤污染是指土壤中存在有害物质的情况，它会严重影响土壤质量和生态系统的健康。

因此，及时准确地鉴定土壤污染非常重要。

本文将介绍几种常用的土壤污染鉴定方法。

首先，化学分析是最常用的土壤污染鉴定方法之一。

化学分析通过分析土壤中有害物质的种类和浓度来评估土壤的污染程度。

常见的化学分析方法包括土壤采样、样品前处理、仪器分析等。

通过化学分析，可以准确地确定土壤中污染物的种类和含量，从而确定土壤是否受到了污染。

其次，生物监测也是一种常用的土壤污染鉴定方法。

生物监测是利用一些生物物种（如昆虫、蠕虫、细菌等）对土壤环境敏感的特性来鉴定土壤污染。

通过观察生物物种的数量、种群结构以及生物指标的变化情况，可以判断土壤是否受到了污染。

例如，土壤中存在有毒物质时，生物物种会减少或死亡，种群结构可能发生变化，生物指标（如酶活性、生物多样性等）可能发生异常。

生物监测方法可以较早地发现土壤污染问题，并及时采取措施进行治理。

另外，物理分析也可以用于土壤污染鉴定。

物理分析主要是通过测量土壤的物理性质来评估土壤的污染情况。

土壤的物理性质包括土壤质地、含水量、密度等。

土壤污染会改变土壤的物理性质，如重金属污染会使土壤质地变硬、色泽异常，有机物污染会使土壤变得容易湿润并出现异味等。

因此，通过物理分析，可以初步鉴定土壤是否受到了污染。

最后，环境检测技术也可用于土壤污染鉴定。

环境检测技术是指利用现代科学和技术手段对土壤执行检测和监测的方法。

常见的环境检测技术包括光谱分析、电化学分析、气相色谱质谱法等。

这些技术可以对土壤中的污染物进行精确的鉴定和定量。

例如，光谱分析可以通过检测土壤中的光谱吸收情况来判断土壤中存在的化学成分，进而鉴定是否受到了污染。

综上所述，土壤污染鉴定是一项复杂而重要的工作。

它涉及到多领域的知识和技术，需要综合运用不同的方法进行检测和分析。

只有通过准确的鉴定方法，才能及时发现和解决土壤污染问题，保护土壤的生态功能和人类健康。

[摘要]土壤微生物多样性，包括微生物类群多样性、群落结构多样性以及遗传多样性等。

土壤微生物多样性对维持土壤生态系统稳定起重要作用，而且不同的土壤具有不同的土壤微生物群落。

影响土壤微生物多样性的因素很多，主要可以分为自然因素和人为因素。

[关键词]土壤微生物多样性影响因素[中图分类号]S15[文献标识码]A[文章编号]1003-1650(2015)12-0137-01土壤微生物多样性及其影响因素张记霞（包头轻工职业技术学院，内蒙古包头014035）土壤是微生物的大本营,是微生物生长和繁殖的天然培养基,土壤微生物资源在自然界中最为丰富多样。

土壤中微生物的种类较多，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物和显微藻类等。

而且数量也很大，l 克土壤中就有几亿到几百亿个微生物个体。

研究土壤微生物多样性及其影响因素对于稳定生态系统、开发生物资源以及促进土壤持续利用等方面具有重要意义，因此土壤多样性的研究得到了大多数学者的广泛关注和重视。

1土壤微生物多样性所谓土壤微生物多样性，即生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间相互作用的多样化程度。

尽管土壤微生物与生物环境之间的关系复杂多样、因种而异，但总体上可归纳为互生、共生、寄生、拮抗、捕食及竞争等六大关系[1]。

鉴此,土壤微生物多样性研究的核心内容应是自然或干扰条件下土壤微生物的群落结构、种群消长、生理代谢以及遗传变异等。

1.1物种多样性土壤微生物的物种多样性是指土壤中微生物的物种丰富度和均一度，这是微生物多样性的最直接的表现形式。

资料表明，自然界中95%～99%的微生物种群尚未被分离培养或描述过，从而推算地球上仅细菌就有10万～50万种[2]。

因为绝大多数微生物种群尚不能分离培养，所以目前重点研究一些对人类关系最为密切的物种，并通过培养基最大限度地培养各种微生物菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。

1.2结构多样性土壤微生物的结构多样性是指土壤微生物群落在细胞结构及组成上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因。

环境污染对土壤微生物群落多样性的影响随着工业化和城市化进程的不断加速，环境污染问题也越来越突出，成为全球共同的难题。

其中，土壤污染对生态环境和农业生产带来的危害尤为严重，然而对土壤微生物多样性的影响却备受忽视。

土壤微生物是土壤生态系统中不可或缺的组成部分，对土壤质量和生态系统功能的维持和调控起着至关重要的作用。

因此，本文将从环境污染对土壤微生物群落多样性的影响及其机制进行探讨。

一、环境污染对土壤微生物群落多样性的影响土壤微生物是土壤中微生物生物量最大的组成部分，同时也是土壤生物多样性中最丰富和最活跃的成分，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等多种类型的微生物。

环境污染对土壤微生物群落的多样性和丰度产生了显著的影响。

环境污染会改变土壤微生物生态系统的生态平衡，降低土壤微生物群落的多样性和丰度，使土壤微生物群落结构发生改变。

环境污染的影响是多方面的，主要包括以下几个方面：1. 降低土壤微生物群落的多样性环境污染会导致土壤生态系统的失衡，使得少数某些微生物数量大幅度增加，同时其他非优势种微生物数量减少，导致微生物群落多样性降低，甚至出现物种灭绝的现象。

例如，有研究表明，水体中汞的含量较高时，土壤微生物群落的种类和数量是会受到影响的（Zhou et al., 2019）。

2. 降低土壤微生物的生态功能环境污染会导致土壤微生物的适应能力下降，减少其对环境的修复能力，如土壤微生物的降解能力、腐生能力等受到影响，从而导致生态系统功能降低，影响到土壤生物多样性和生态系统可持续发展。

3. 逐步改变土壤微生物群落的结构环境污染也会导致优势种和非优势种微生物的数量发生变化，从而改变其群落结构。

不同污染物质会对不同微生物群落产生不同影响，因而土壤微生物群落结构变化的模式也比较复杂，可以是单一因素的影响，也可以是多种因素影响的结果。

二、环境污染对土壤微生物群落多样性的影响机制环境污染对土壤微生物群落多样性的影响机制主要有以下几个方面：1. 毒性作用环境污染物质中的有毒物质会直接杀死或破坏土壤微生物群落，从而改变了其多样性和结构。

土壤微生物多样性的主要影响因素摘要：土壤微生物是土壤生态系统的主要组成部分，而且不同的土壤具有不同的土壤微生物群落。

影响土壤微生物多样性的因素很多，主要可以分为自然因素和人为因素。

本文将从土壤微生物多样性的影响因素的两个方面阐述目前国内外土壤微生物多样性的研究现状。

关键词：土壤微生物；微生物多样性；影响因素土壤微生物系统作为稳定生态系统，是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础⑴。

在一定程度上地球生态系统的变化与土壤微生物群落的变化密切相关。

研究土壤微生物多样性的变化情况对评价生态系统、维护生态平衡有着十分重要的意义，因此土壤多样性的研究得到了广泛学者的关注。

影响土壤微生物群落的结构组成和多样性的因素可大体分成自然因素和人为因素两大类。

自然因素包括土壤类型、温度、水分、植被等；人为因素包括土壤的耕作方式、农药的施用、施肥的施用等。

本文将分别对几种有代表性的土壤微生物多样性影响因素加以阐述。

1•自然因素1.1 土壤类型地球上土壤类型是多种多样的，不同土壤类型中的微生物群落结构及组成也是千差万别的。

目前来许多的研究都表明土壤类型是土壤微生物群落结构的主要影响因素之一。

例如：Gelsomino等⑵通过比较不同地理位置的16种土壤微生物DGGE图谱发现土壤类型是决定土壤微生物群落结构的主要因素。

杨超等⑻ 研究了我国皖南烟区四种不同植烟土壤类型在烟叶生长期内的微生物种类、数量变化情况。

其结果表明了在不同的土壤环境下土壤微生物的数量和土壤养分含量呈正相关关系。

这同时也说明了土壤类型在土壤微生物多样性方面具有一定的影响力。

1.2植被情况生态系统中的植被可以通过影响土壤的含水量、通气性、温度、pH值等因素从而改变土壤的微生物组成结构。

Waid认为植被的类型、数量和化学组成可能是土壤生物多样性变化的主要推进力量⑷。

通过对美国北部泥炭地生态系统中土壤微生物活性和功能类群组成的研究，Melany等发现植被类型影响土壤微生物活性及功能类群［5］。

微生物群落多样性调查及其生态功能评估微生物群落是地球上最为丰富多样的生物群体之一，它们广泛分布于各种环境中，包括土壤、水体、大气和生物体内。

微生物群落多样性的调查与生态功能评估对我们深入了解微生物的生态学特征、生态功能以及与环境相互作用具有重要意义。

微生物群落多样性的调查是通过分析微生物的种类、数量和相对丰度来揭示微生物群落的组成和结构。

常用的方法包括16S rRNA高通量测序技术和气候室技术。

这些方法可以帮助我们识别和分类微生物，并了解它们在不同环境中的分布情况。

同时，通过比较不同样本之间的微生物多样性指数，如丰富度指数、均匀度指数和多样性指数，可以得出微生物群落的多样性水平。

通过这些调查手段，我们可以揭示微生物群落的时空分布规律，了解不同环境因素对微生物群落多样性的影响。

微生物群落的多样性对环境具有重要生态功能。

首先，微生物群落是地球生物圈中最大的生物量储藏库之一，它们参与了物质循环，如有机质的降解和氮、磷等元素的循环。

其次，微生物群落能够维持土壤的肥力和生物多样性。

土壤微生物参与了土壤碳和营养元素循环，通过分解有机物质释放养分供植物吸收，进而影响植物的生长和生理状态。

此外，微生物群落还可以抑制病原菌的生长，维持生态系统的稳定性。

还有些微生物具有产酶、产抗生素和固氮等特殊能力，在农业和医药领域也具有广泛应用前景。

生态功能评估是评价微生物群落对环境的重要性和敏感性的方法。

通过将微生物群落的多样性和丰度与环境因子进行相关分析，可以研究微生物群落对环境因素的响应和适应能力。

例如，当我们调查不同土壤样本中微生物群落多样性时，可以将样本的土壤温度、湿度、酸碱度等环境参数进行测量，并与微生物多样性指数进行相关分析。

这样可以得出不同环境因素对微生物群落多样性的影响程度。

同时，通过实验室条件的模拟和野外调查数据的对比，可以评估微生物群落对环境变化的响应能力和适应性。

微生物群落多样性调查与生态功能评估在生态学和环境科学研究中具有重要意义。

土壤微生物多样性研究方法3钟文辉1,233　蔡祖聪1(1中国科学院南京土壤研究所,南京210008;2南京师范大学化学与环境科学学院,南京210097)【摘要】　概述了研究土壤微生物多样性的主要方法.传统上,土壤微生物群落的分析依赖于培养技术,使用各种培养基最大限度地培养各种微生物群体,但仍只能培养和分离出一小部分土壤微生物群落.使用Biolog 分析、磷脂脂肪酸分析和核酸分析等方法,可研究和表征那些现在还不能够被培养的土壤微生物,从而获取关于土壤微生物群落多样性的更多和更完整的信息.关键词　土壤　微生物多样性　Biolog 磷脂脂肪酸　核酸分析文章编号　1001-9332(2004)05-0899-06　中图分类号　S15413　文献标识码　AMethods for studying soil microbial diversity.ZHON G Wenhui 1,2,CAI Zucong 1(1Institute of Soil Science ,Chi 2nese Academy of Science ,N anjing 210008,China ;2College of Chemist ry and Environmental Science ,N anjing Norm al U niversity ,N anjing 210097,China ).2Chin.J.A ppl.Ecol .,2004,15(5):899～904.This paper gave a review on the main methods for studying soil microbial diversity.Traditionally ,the analysis of soil microbial communities relied on culturing techniques ,using a variety of culture media.However ,only a small fraction of the soil microbial community has been cultured and isolated with this a pproach.Other methods such as Biolog GN analysis ,phospholipids fatty acids analysis and nucleic acid 2based analysis can be used to study and characterize soil microbes which currently cannot be cultured ,and to get more and complete information about soil microbial community.K ey w ords S oil ,Microbial diversity ,Biolog ,FL FA ,Nucleic acid 2based analysis.3国家杰出青年基金资助项目(40125004).33通讯联系人.2002-02-20收稿,2003-07-15接受.1　引 言生物多样性包括物种多样性、遗传(基因)多样性和生态系统多样性.土壤微生物多样性包括在栖息地中微生物分类群的多样性和在微生物分类群内的遗传多样性,以及包括群落结构的变异性、相互作用的复杂性、营养水平(tropic level )和共位群(guild )数量(功能多样性)在内的生态多样性.其中遗传多样性可认为是遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布,反映微生物群落中总的遗传潜力.功能多样性则是指发生在一个群落中的碳源利用模式或作用过程数[33].土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类:一类是用于分析土壤中可培养的微生物群落;另一类是用于分析土壤的整个微生物群落.第一类分析方法基于微生物分离菌(isolates )的形态判别、微生物分离菌在Biolog GN 微滴定板中的反应和微生物分离菌的脂肪酸甲酯谱(FAME profiles )等.后一类分析方法不需要培养微生物,包括群落水平的生理特性(CL PP )分析(如在Biolog GN 微滴定板中的反应分析)、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids ,PL FA )方法和核酸分析(nucleic acid 2based analysis )方法等.2　琼脂培养基培养方法这是用于估计微生物多样性的传统方法.琼脂培养基培养方法是在琼脂培养基平板上接种培养,可作以下用途:跟踪特定分类组(group )或功能组的微生物数量,并评价在该平板上的微生物群落的组成.在后一种情况下,需从琼脂平板上将菌落分离出来,并对分离菌进行鉴定.由所得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构.培养基的成份影响微生物的生长状况,故培养基的选择可强烈影响所得菌落的多样性[34,64].菌落形成单位(CFU )的数量通常随培养基营养浓度的降低而增加[40,49].然而,只有一小部分土壤微生物群落可用这种方法得到.F •gri 等[16]用荧光显微镜检术检出的细菌数比用培养基培养得到的细菌数提高100～1000倍.根据Amann 等[3]的评估,大约80%～99%的微生物种不可培养或未能得到培养,说明大部分微生物的特征不能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述.此外,琼脂培养基培养方法需要使用包括分子生物学手段在内的分析技术,才能完成对微生物种的鉴定,分析工作烦琐,工作量大.由于以上局限性,在出现新的评价微生物多样性的方法,特别是分子方法以后,该传统方法已逐渐失宠.3　Biolog GN 方法Biolog GN 分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法.它是基于微生物利用碳源能力的不同,利用Biolog GN 系统来研究微生物的碳源利用模式的方法.Biolog GN 微滴定板的每一个孔中含有一种不同的碳源(共95种)、其它营应用生态学报　2004年5月　第15卷　第5期 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,May 2004,15(5)∶899～904养物和四氮唑染料.接种微生物悬浮物于微滴定板孔中后,将滴定板保温一段合适的时间,通过测定伴随的四氮唑染料的还原,而定期监测底物的氧化.Biolog GN微滴定板原来用作对细菌分离菌进行分类[6].然而,这种方法现已被改进,用于表征土壤微生物群落的功能潜力,即被用于估计诸如碳源利用模式等功能多样性[21].Biolog GN分析方法当作此用途时,接种物是来自土壤微生物群落的混合物(而不是纯培养),所得结果采用一定的统计方法进行分析.采用该方法时接种量和培养时间很重要.研究表明,底物的氧化取决于所用接种物的组成和密度[20,23,77].另外,被接种的微生物的生理状态可能影响底物利用的动力学和模式[35].在测定过程中,微生物只在含有适合其利用碳源的孔中生长[21,23,77].因此,所观察到的底物利用模式可能只反映了那些在Biolog GN微滴定板孔中能够生长的微生物的功能特性,且很可能不是所有的微生物都对Biolog反应特征有贡献[23,28].所得到的碳源利用模式也不一定反映接种的微生物群落中数量上占优势的成员的功能潜力[62].该方法已用于了解土壤[23,41,77]和根际[20]中微生物群落间的差异,也有的研究者用它确定非土著微生物或转基因植物对土壤[13,75]、植物凋落物[32,52]、根际[28]和叶际[28]微生物群落的影响.Biolog GN方法具有快速而可再现的特点.然而,该方法对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性[62],故与从琼脂平板分离微生物的传统方法有同样的局限性;另一缺点是被测试的底物不能准确地代表出现于生态系统中的底物类型.因此,Biolog反应特征只能粗略地代表实际土壤微生物群体底物利用的动力学特征.4　磷脂脂肪酸方法411　PL FA在微生物中的分布磷脂脂肪酸谱(PL FA profile)常被用于研究复杂群落中微生物的多样性[54,79].磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基本组分.PL FA是磷脂的组分,具有结构多样性和高的生物学特异性,是特别有效的生物标记物,可用于了解微生物群落结构.总PL FA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的[74],且在大多数情况下PL FA的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势.至今,已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据.PL FA或酯链PL FA(EL2PL FA)的总量已被用作土壤样品中微生物生物量的指示物(indicator)[80].细菌含有在其它生物中常见的直链脂肪酸,如油酸或顺型异油酸[十八碳2112稀酸(顺),简写为18∶1ω7或18∶1ω7c]等单不饱和脂肪酸(MU FA).然而,细菌独特的脂肪酸是具分枝链、环丙基和β2羟基脂肪酸.这些脂肪酸在其它生物体中不普遍存在[38].支链脂肪酸主要发现于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性的硫酸盐还原菌、Cytophaga 和黄杆菌属[24],而环丙基脂肪酸常见于革兰氏阴性菌株以及革兰氏阳性厌氧菌株[57].MU FA特别是18∶1ω7具有厌氧2去饱和酶途径的真细菌特征,很多这种细菌是革兰氏阴性菌[79].虽然MU FA可出现在革兰氏阳性和阴性细菌中,但在革兰氏阳性细菌中它们对总PL FA的相对贡献很少(< 20%),故MU FA可用作革兰氏阴性细菌的通用生物标记[57].多不饱和脂肪酸(PU FA)被认为是真核生物的特征性脂肪酸.亚油酸(十八碳29,122二稀酸(顺,顺),简写为18∶2ω6)可作为真菌的一个通用生物标记.但Sundh等[66]推断,这种脂肪酸可能不是对每一生态系统都合适的生物标记,可能只在植物细胞不存在的生态系统中是真菌的较好标记.非酯链未取代脂肪酸(non2ester2linked unsubstantiated FA,N EL2UNSFA)是鞘脂和缩醛磷脂的组分.鞘脂已发现存在于拟杆菌属/黄杆菌属[60].近来也发现革兰氏阴性多聚氯酚降解细菌(被鉴定为Sphingomonas属)含有鞘脂[46].缩醛磷脂主要存在于梭状芽孢杆菌属等厌氧细菌中[74],只有很少数的好氧和兼性厌氧细菌含有缩醛磷脂[79].真菌菌丝中已被检测出存在长链非酯链羟基取代脂肪酸(non2ester2 linked hydroxyl substituted FA,N EL2HYFA)[75].在脂肪酸第10位碳原子处甲基分枝是放线菌所特有的[37].表征几大类微生物的重要脂肪酸见表1.表1　表征微生物的PLFA[29,32]T able1PLFA signatures of microbes微生物类型Microbial group磷脂脂肪酸标记Phospholipids fatty acid signatures细菌Bacteria in general含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸(如15∶0、i15∶0、a15∶0、16∶0、i16∶0、16∶1ω5、16∶1ω9、16∶1ω7t、17∶0、i17∶0、a17∶0、cy17∶0、18∶1ω5、18∶1ω7、18∶1ω7t、i19∶0,a19∶0和cy19∶0等)Contain saturated or monounsaturated fatty acids ester2linked to glycerol革兰氏阳性细菌Gram2positive bacteria含有多种分枝脂肪酸Contain more branched fatty acids革兰氏阴性细菌Gram2negative bacteria含有多种羟基脂肪酸Contain more hydroxylated fatty acids;MU FA厌氧细菌Anaerobes cy17∶0,cy19∶0好氧细菌Aerobes16∶1ω7、16∶1ω7t、18∶1ω7t硫酸盐还原细菌Sulfate2reducing bacteria10Me16∶0、i17∶1ω7、17∶1ω6甲烷氧化细菌Methane2oxidizing bacteria16∶1ω8c,16∶1ω8t,16∶1ω5c,18∶1ω8c,18∶1ω8t,18∶1ω6c嗜压/嗜冷细菌Barophilic/psychrophilic bacteria20∶5,22∶6黄杆菌Flavbacteri um bal usti num i17∶1ω7,Br2OH215∶0芽孢杆菌Bacill us spp1各种枝链脂肪酸Various branched chain fatty acids放线菌Acti nobacteria10Me16∶0、10Me17∶0、10Me18∶0等真菌Fungi 含有特有的磷脂脂肪酸如18∶1ω9、18∶2ω6、18∶3ω6、18∶3ω3Contain a specific PL FA such as 18∶1ω9、18∶2ω6、18∶3ω6、18∶3ω3蓝细菌Cyanobacteria含有多不饱和脂肪酸如18∶2ω6Lipids containing polyunsaturated fatty acids such as18∶2ω6微藻类Microalgae16∶3ω3原生动物Protozoa20∶3ω6、20∶4ω6i、a、cy和Me分别表示反异(anteiso)、异(iso)、环丙基(cyclopropyl)和甲基(methyl)分枝脂肪酸009应　用　生　态　学　报 15卷412　PL FA的分离和分析PL FA的提取和分析是PL FA方法的关键步骤.PL FA 的提取主要采用简单提取、扩展提取和商用微生物鉴定系统(MIDI)提取等方法[79].简单提取用于提取EL2PL FA.先用有机溶剂提取土壤中的细胞脂类,将提取液上样于硅酸键合固相抽提柱(solid2 phase2extraction silicic acid bonded phase column,SPE2SI),分别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱,可将脂类裂解,并分离出中性脂、糖脂和磷脂.用温和碱性甲醇将磷脂水解和皂化,得到酯链脂肪酸甲酯(EL2FAME),进一步用GC或GC2MS进行定性和定量测定.这种提取方法不能将非酯链PL FA(N EL2 PL FA)从脂类中解离和提取出来.扩展提取方法是在简单提取方法的基础上延伸的,可用于提取包括EL2PL FA和N EL2PL FA在内的全PL FA.用与简单提取方法相同的操作方法从土壤样品中抽提脂类,将磷脂从脂类中解离出来,用碱性甲醇水解和皂化,接着用氨丙基键合,SPE柱(aminopropyl2bonded SPE2column,SPE2NH2)分离皂化产物,得到未取代脂肪酸甲酯.酯链羟基取代脂肪酸(EL2HYFA)甲酯和不皂化脂.未取代脂肪酸甲酯用苯磺酸键合.SPE柱(benzenesulphonic2acid2bonded SPE column, SPE2SCX)分离,得到酯链饱和脂肪酸(EL2SA TFA)、酯链单不饱和脂肪酸(EL2MU FA)和酯链多不饱和脂肪酸(EL2PU2 FA)组分.不皂化脂经酸水解后,用SPE2NH2柱分离,可得到非脂链脂肪酸(包括N EL2UNSFA和N EL2HYFA).得到的EL2PL FA和N EL2PL FA进一步用GC或GC2MS进行定性和定量分析.采用这种方法可使多数类型的脂肪酸根据它们结合成脂类的本来状况(酯链,非酯链)而得到分离.检测结果用多变量统计方法加以分析.除上述方法外,有些研究者还用MIDI来提取和分析脂肪酸[9,24,30].其操作方法包括用皂化/裂解液将脂肪酸从脂类中裂解出来,在80℃下加入甲醇盐酸溶液,使脂肪酸甲基化形成FAME,提取FAME,进行GC分析等几个步骤[24].最后,用MIDI开发商提供的自动程序软件对FAME进行分析.该方法的主要问题是提取的脂肪酸包括来自有生活力的细胞脂类和可能部分来自于细胞外的脂类[79].用简单提取方法和MIDI方法提取土壤PL FA得到的脂肪酸谱相似[9,19],一般有20至48种脂肪酸(最多72种),其中直链脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占15%～25%和30%～50%;甲基分枝脂肪酸占25%～40%.采用扩展提取方法检测到的PL FA的数量介于190至360种之间,且显示出不同地点、不同耕种方式的土壤中脂肪酸的总量和种类数以及百分比分布有显著差异[65,81].N EL2PL FA占总PL FA量的21%～25%,EL2SA TFA和羟基取代脂肪酸(包括EL2HYFA 和N EL2HYFA)也大量存在.413　PL FA方法的特点和局限性PL FA方法是一种快速、可靠而可重现的分析土壤微生物群落结构的方法,可用于表征在数量上占优势的土壤微生物群落,包括不可培养微生物.该方法最适合用作总微生物群落分析,而不是专一的微生物种类的研究[15].PL FA的组成和浓度受土壤微生物生长条件和生理状态的影响[31,74].另外,包括PL FA在内的所有的土壤生物标记都存在可萃取性(extractability)和未知的稳定性问题.土壤的生物标记稳定性主要取决于与降解过程有直接关系的温度、湿度和其他条件[31].5　核酸分析方法511　总DNA分析研究表明,土壤微生物大体的群落组成和总的遗传多样性可通过测定群落DNA的解链行为和复性率来确定[70,73].在溶液中变性单链DNA的复性率随着DNA复杂性的增加或在溶液中不同DNA分子数量的增加而下降;DNA浓度越大,复性越快.Cot1/2表示复性一半的Cot(DNA浓度和复性时间的乘积)值,与DNA的复杂程度成正比,被用作多样性指数[71]或用于估计基因组的大小.用该方法分析表明,在未扰动的有机土壤中微生物群落基因组大小相当于6000～10 000大肠杆菌基因组的大小,而在耕作土壤或受重金属污染土壤中相当于350～1500大肠杆菌基因组的大小,且这些估计值可能是保守的[50,72].但该方法的分辨率低,只能确定土壤微生物群落的大体差异.另外,通过测定碱基在群落DNA中的分布,即鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔百分率(%G+ C),也可得到有关总的群落组成的信息[12].512　基于PCR的核糖体DNA分析51211概述　大多数DNA多样性研究以核糖体RNA (rRNA)或其编码基因rDNA为对象.在微生物多样性研究中,人们最感兴趣的是小亚基RNA(SSU rRNA)或其编码基因SSU rDNA.SSU rDNA包括保守区和变异区.保守区内核苷酸序列恒定,在分类上相距远的微生物分类群之间才有差异;变异区能够显示微生物分类种的差异.SSU rDNA的这种独特的特性可被用来对微生物进行系谱分类.目前人们已经对很多种已知微生物的SSU rDNA/rRNA序列进行了测序(大多数工作是对原核生物16S rDNA/rRNA进行的),建立了SSU rDNA/rRNA序列数据库.该数据库正在不断扩大,目前已有足够大的数据库来对微生物进行系谱分类.rDNA分析中,通常用PCR扩增SSU rDNA,扩增产物用凝胶电泳分离并进行分析.目前最常用的分析方法的基本步骤如下[7,14,43,45,55,56]:抽提土壤DNA→PCR扩增SSU rDNA(16s rDNA或18s rDNA)→PCR产物的变性梯度凝胶电泳(D GGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)分离及带谱分析→回收D GGE电泳片段→DNA序列测定→将测得的SSU rDNA序列与rDNA序列数据库中已知微生物的rDNA序列相比较→获得土壤中可能含有的微生物(包括不可培养微生物)的信息.与rDNA分析有关的问题包括rDNA序列的异质性(heterogeneity)[47]和SSU rDNA的数量变化较大[18]等. 51212DNA的抽提和纯化　抽提的DNA的质量影响后续PCR扩增的效率和准确性.抽提中应尽可能避免DNA断1095期 钟文辉等:土壤微生物多样性研究方法 裂.模板的浓度对PCR扩增有影响.过低的模板浓度可能会导致扩增失败或不正确的扩增[10],故抽提效率应该高,以保证有足够的模板浓度[26].此外,被抽提的DNA必须纯化,因为土壤中可能含有抑制PCR反应的腐殖酸[68].不同的土壤类型要用不同的DNA抽提方法[4,45].抽提方法可分为两种:一是先抽提土壤中的微生物细胞,再将细胞裂解和回收DNA;二是直接抽提土壤中的DNA.第一种方法得到的是在数量上占优势的微生物的DNA,DNA纯度较高;第二种方法较方便、抽提较完全,得到的DNA更能代表总群落[71].目前大多数研究者采用第二种方法,该方法经过改进后,已经能够做到避免腐殖酸对PCR的抑制[31].对于很多土壤,用商用抽提试剂盒能够快速而有效地直接抽提和纯化DNA[5],对另一些土壤需要用烦琐的其它抽提方法.从不同土壤类型抽提DNA的得率不同,变化范围在2～35μg・g-1之间[4].51213　rDNA的PCR扩增　首先慎重选择待扩增的rDNA 区域.rDNA的PCR扩增常采用不同的引物和扩增条件分别扩增原核微生物16S rDNA或真核微生物18S rDNA的全序列或部分序列[14,17,27,36,63].PCR扩增中存在着一些问题,如PCR产物的组成不一定反映原始DNA模板的组成[25,53,67]; PCR产物也不一定能反映原始DNA模板的相对数量.定量PCR方法操作烦琐,需要进一步改进和完善,才能在实际中应用[48].51214PCR产物的凝胶电泳分离　分离效果比较好的凝胶电泳方法有D GGE或TGGE.D GGE或TGGE均可对具有同等长度并具有不同的核苷酸序列的DNA片段进行快速、可再现分离[27,44].D GGE分离是基于DNA片段在具线性变性梯度的聚丙稀酰胺凝胶中迁移率的不同,常用的变性剂有脲和甲酰胺[44].TGGE可区分单个碱基水平发生取代的DNA 分子[61].两种方法电泳效果基本相同[27].不同微生物群落的rDNA电泳后带型不同[22].凝胶电泳的低分辩率仍然是该方法存在的一个问题[69].51215rDNA的PCR产物的分析　用PCR方法从土壤和微生物分离菌中扩增的rDNA可利用扩增的核糖体DNA限制性分析(the amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA)技术进行分析.在该方法中DNA被用一种或几种限制性酶消化,所得片段用凝胶电泳分离.该方法的不足之处是一组(分类群)微生物在分析中可得到几个片段,故分辨率较低.这个问题已在末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T2RFL P)分析中得到解决.该方法是ARDRA的发展,在PCR中引入了荧光标记的引物,PCR产物也用一种或几种限制性酶消化,借助荧光标记对消化片段进行分离和鉴定[39,42].rDNA间隔区分析(ribosomal internal s pacer analysis, RISA)[1,8]则基于原核生物16S和23S rDNA基因之间的间隔区的长度多态性,用PCR方法对该间隔区进行扩增,扩增产物用凝胶电泳分离并分析带谱,也可对DNA带进行测序,从而获得更详细的信息.513　杂交分析与rDNA的保守和变异序列同源的DNA片段可制成寡核苷酸探针,用于杂交分析.探针可用在不同的杂交技术中,包括菌落和经克隆的PCR扩增子的杂交、群落DNA的斑点印迹、狭线印迹杂交和完整细胞的荧光原位杂交(fluores2 cence in situ hybridization,FISH)[2,3,51,70].在使用印迹技术的杂交中,从细菌菌落或经克隆的PCR扩增子中来的16S和23S rRNA基因的PCR产物,可印迹到尼龙膜或硝酸纤维素膜中.该印迹与经放射性同位素、地高辛配基或其它半抗原标记的核苷酸探针杂交.这种方法常用于检测和鉴定细菌,确定土壤中细菌群体的多样性和结构[51,59],比较微生物分类群变异率[59].Ritz等[58]应用整个群落DNA杂交技术,研究了在不同条件下土壤微生物群落结构的变化.在FISH中,可用表面荧光显微镜术,对具有与荧光探针杂交的核酸分子的微生物细胞进行观察和计数[11].FISH技术使直接显现(visualization)土壤栖息地的微生物成为可能[29],可用于对土壤样品中的微生物(包括不可培养微生物)进行原位检测[3].参考文献1　Acinas SG,Anton J,Rodriguez2Valera F.1999.Diversity of free2 living and attached bacteria in offshore western Mediterranean wa2 ters as depicted by analysis of genes encoding16s RNA.A ppl Env2i ron Microbiol,65:514～5222　Amann RI,K rumholz L,Stahl DA.1990.Flu orescent2olig onucleotide prob2 ing of whole cells for determ inative,phylogenetic,and environmental studies in m icrobiology.J Bacteriol,172:762～7703　Amann RI,Ludwig W,Schleifer KH.1995.Phylogenetic identifica2 tion and in situ detection of individual microbial cells without culti2 vation.Microbiol Rev,59:143～1694　Anthony G,O’Donnell,G rres EG.1999.16S rDNA methods in soil microbiology.Current Opi nion Biotechnol,10:225～2295　Barthelet 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al.1997.Changes in soil mi2 crobial properties and phospholipid fatty acid fractions after chloro2 form fumigation.Soil Biol Biochem,29:1325～1336作者简介　钟文辉,男,1965年生,博士,副教授,主要从事环境微生物学和环境生物技术研究,发表论文20多篇,出版专著和高校教材4部.E2mail:w.h.zhong@409应　用　生　态　学　报 15卷。

土　壤 (Soils), 2004, 36 (4): 346~350土壤微生物多样性实验研究方法概述 章家恩 蔡燕飞 高爱霞 朱丽霞　（华南农业大学热带亚热带生态研究所广州 510642）摘 要对有关土壤微生物多样性，包括微生物类群多样性、群落结构多样性、功能多样性以及基因多样性等的描述与表征方法进行了探讨，同时，对当前国内外土壤微生物多样性的一些实验研究方法，包括土壤微生物分离培养方法、Biolog微平板方法、FAME分析方法和分子生物学方法等进行了介绍和评述。

并指出在土壤微生物多样性研究中，如果可能的话，需要将各种方法结合起来使用，方可得到有关土壤生物多样性的较为全面的信息和理解。

关键词土壤微生物；生物多样性；FAME；Biolog；PCR中图分类号 Q938.1；S154.36生物多样性是当今国际上共同关注的问题，它也因此日益成为学术界的热点研究领域之一。

目前在地上部植物和动物的多样性方面开展了大量的研究，但对土壤生物多样性，特别是在土壤微生物多样性方面的研究仍较薄弱。

其中一个重要的原因就是在土壤微生物多样性的研究方法方面还存在着较大的困难和缺陷，很多方法还不能全面地、准确地研究土壤微生物多样性状况。

为此，本文对当前国内外土壤微生物多样性研究方法进行概述，旨在为相关研究提供一些参考。

１ 土壤微生物多样性的表示方法　生态学意义上的“生物多样性”是指生物与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，一般包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性3个层次[1]。

生物多样性通常用“多样性指数”来表示。

生物（物种）多样性指数的计算一般需要知道群落中物种的种数以及各物种的个体数等相关的信息。

对于土壤微生物，由于方法上的限制和微生物自身的变异性，目前还不可能将土壤中的全部微生物培养出来，而且对于土壤微生物种属的鉴定分类也是一件不易的工作。

因此，在实际研究中，通常从某一侧面或某一角度来近似或间接地描述土壤微生物的多样性状况。

微生物生态系统丰富度与功能多样性关系研究微生物是地球上最为丰富的生物群体之一，生活在各种环境中，如土壤、水体、空气和动物体内。

微生物虽然微小，但是在维持生态系统的稳定与运作方面扮演着极其重要的角色。

微生物的多样性以及其在生态系统中的功能都受到了广泛的研究。

其中，微生物生态系统丰富度与功能多样性关系研究是一个重要的方向。

在本文中，我们将深入探讨微生物生态系统丰富度与功能多样性的关系。

一、微生物的生态系统丰富度与功能多样性微生物是生态系统中最丰富的生物群体之一。

微生物丰富度指的是在一个生态系统中存在的不同微生物种类的数量。

通常情况下，微生物群落的丰富度越高，代表着生态系统的稳定性越强。

在生态系统中，不同的微生物种类会扮演着不同的角色，如分解有机物、氮循环、光合作用等等。

这些不同的角色使得微生物在生态系统中担负着不可替代的功能。

这也是微生物功能多样性的体现。

二、微生物生态系统丰富度与功能多样性的研究方法微生物生态系统丰富度与功能多样性之间的关系是一个极其复杂的话题，需要多种学科的知识和研究方法。

在研究微生物生态系统丰富度与功能多样性的关系时，通常会采用以下几种方法：微生物DNA测序分析、微生物群落功能水平分析、微生物与生态系统功能分析等。

1.微生物DNA测序分析微生物DNA测序分析可以帮助研究者深入了解微生物群落的基因组成，从而评估微生物生态系统丰富度和功能多样性。

通过测序分析，可以快速、准确地检测出样本中存在的各种微生物物种的数量和多样性指数。

从而探究微生物群落的丰富度以及微生物物种之间的互作关系。

2.微生物群落功能水平分析微生物群落功能水平分析可用于评估不同微生物在生态系统中的功能。

这种方法从群落功能的角度研究微生物的角色，点出环境失衡的源头，并探究生态系统的自我修复机制。

同时，这种方法还可通过对微生物的基因组进行测序分析，进一步探究微生物的代谢能力和群体结构，以更好地了解微生物在生态系统中的功能。

土壤微生物功能基因丰度检测方法一、土壤样本采集土壤样本采集是微生物功能基因丰度检测的第一步，需要选取具有代表性的土壤样品。

采集时应避免人为因素对土壤微生物群落的影响，同时注意保持土壤的原有结构和活性。

采集后的土壤样品应立即进行保存，以避免微生物群落的改变。

二、基因提取基因提取是微生物功能基因丰度检测的重要环节，主要目标是提取出土壤微生物的基因组DNA。

在这一步，需要采用有效的DNA提取试剂盒，按照试剂盒的操作说明进行操作，以保证基因提取的质量和效率。

三、基因扩增基因扩增是通过PCR技术，将特定的基因片段进行扩增的过程。

在此步骤中，需要根据所检测的微生物功能基因设计特异性引物，以便对目标基因进行选择性扩增。

同时，要控制好PCR反应的条件，确保扩增的准确性和特异性。

四、测序分析测序分析是对扩增后的基因片段进行序列测定，以获得目标基因的准确序列。

目前常用的测序技术包括Sanger测序和下一代测序（NGS）技术。

NGS技术具有高通量、高灵敏度等优点，适合对大量样本进行测序分析。

五、数据处理与丰度计算数据处理是对测序得到的原始数据进行处理和清洗，去除低质量的数据和噪音。

随后，根据特定的算法和计算模型，对目标基因的丰度进行定量分析。

这一步骤中，可以采用一些生物信息学软件和工具，如QIIME、PICRUSt等。

六、结果解读与报告结果解读是根据丰度计算的结果，对土壤中微生物功能基因的分布和丰度进行解释和分析。

在报告中，需要详细说明检测方法、数据分析和解读过程，并给出明确的结论。

同时，要结合实际情况，对微生物功能基因的生态学意义进行阐述。

七、质量控制与误差分析为保证检测结果的准确性和可靠性，需要进行严格的质量控制和误差分析。

这包括对实验过程的监控、重复实验的验证以及对不同实验结果的分析和比较。

通过质量控制和误差分析，可以及时发现并纠正实验中的问题，提高检测结果的可靠性。

八、生物信息学分析生物信息学分析是对测序得到的基因序列进行系统的分析和解释。