蛋白质的沉淀
1、概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液 中析出的现象。 2、蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水 胶体。 稳定因素：水化膜 电荷 破坏稳定因素，就可使蛋白质颗粒 凝聚而沉淀。
3、沉淀方法：
①盐析法 ②有机溶剂沉淀 ③重金属盐沉淀 条件: pH＞pI (Pr- M+) ④某些酸类沉淀 条件： pH＜pI ( Pr+ X-) ⑤加热变性沉淀
①盐析法
加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出。 NaCl、 （NH4）2SO4、NaSO4等。 破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质 分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液 中的几种蛋白质分段析出。 分离制备蛋白质的常用方法。
②有机溶剂沉淀
与亚硝酸的反应
NH2 R—CH—COOH ﹢ HNO2 →
∣
OH R—CH—COOH +N2↑
∣
氨基酸
亚硝酸
羟基酸
+H2O
（五）蛋白质的颜色反应
作为蛋白质的定性和定量试验。 作为分析氨基酸的显色反应。 作为检验蛋白质水解是否完全。
1、双缩脲反应
NH2 C=O NH2 NH2 C=O NH2
蛋白质的理化性质和生化研究术
（一）蛋白质的分子量
（二）蛋白质的两性解离和等电点（pI） （三）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （四）蛋白质的变性 （五）蛋白质的水解 （六）蛋白质的颜色反应
（一）蛋白质的分子量
蛋白质是高分子化合物，一般分子质量 都在百万以上。 测定方法： 超速离心法 凝胶过滤法 聚丙烯酰胺电泳等
2、与水合茚三酮的反应
O ‖
2
‖ O 沸腾
∕
OH OH
+
蛋白质溶液
蓝紫色化合物
3、蛋白质黄色反应
蛋白质溶液 + 浓HNO3 白色沉淀
加热
含Phe、Tyr、Try的 蛋白质所特有的反应
黄色沉淀
4、米伦氏反应
米伦试剂：硝酸汞 亚硝酸汞 硝酸 亚硝酸的混合液 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产 生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。 酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都 有此反应。
当溶液处于某一pH值，蛋白质分子所带 正、负电荷相等，净电荷为零，呈兼性离子状 态，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点 （pI）。 不同的蛋白质，其等电点（pI）不同。
pI是蛋白质的特征性常数。 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离 子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。
几种蛋白质的等电点（pI）
透析
将蛋白质溶液(不纯)放入透析袋中， 放在流水中（纯水），让低分子杂质 （如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋 白质则留在袋中，分离纯化蛋白质。
半透膜阻留pr分子， 而让小的溶质分子 和水通过，以达到 除去蛋白质溶液中 小分子（盐、低分 子酸等）。
沉降作用
1、沉降概念： 蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重 关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋 白质浓度增高。 2、沉降速率： 在离心时，蛋白质分子在单位时间t（以 秒计）内下沉的距离x（以cm计）。以v表示。 v= dx/dt
天然状态，有催化活性
牛胰核糖核酸酶
尿素，β-巯基乙醇
SH
非折叠状态，无活性，-S-S-被还原成-SH
SH SH
SH SH
SH SH
SH
去除尿素，β-巯基乙醇
天然状态， -SH 氧化形成-S-S-， 有催化活性
５、实际应用
消毒灭菌 中毒的急救 临床检验 保存和制备生物制剂 有利于蛋白食物的消化吸收
细胞的破碎：
机械法： 高速组织捣碎法 玻璃匀浆器 研磨（加砂） 化学及生物化学法： 自溶 溶菌酶处理法 表面活性剂处理法
物理法： 反复冻融法 冷热交替法 超声波处理法 加压破碎法
十二烷基磺酸钠 氯化十二烷基吡啶 脱氧胆酸钠
细胞破碎
如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白 释放出来。 动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波等方法 破碎。 植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。 微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声 振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。
蛋白质的分离纯化和鉴定
提取 分离 纯化 鉴定
提取
提取通常是指用适当的溶剂和方法，从原料 中把有效成分分离出来的过程。经过处理和破细 胞的原材料中的有效成分，可用缓冲液，或稀酸、 稀碱、有机溶剂（如丙酮、乙醇）等溶液提取。 有时还可以用蒸馏水提取。
理想的提取溶剂应具备下述条件：
+ -
清蛋白
α1
α2
Β
γ球蛋白
电泳
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的 电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。
电泳方法：
自由界面电泳
区带电泳 纸电泳 凝胶电泳
圆盘电泳 平板电泳
（三）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
1、蛋白质是高分子化合物，分子量多在1万~100万之 间。 2、球状蛋白质的颗粒大小达1~100 nm范围，故蛋白 质有胶体性质。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水 胶体。 3、蛋白质分子大，不能透过半透膜。 4、蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心，可发生沉降。
苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。
反应条件:
NH3+
Pr COOH+
pH<pI
NH3+ Pr COOH
X-
NH3+XPr COOH
X- ：酸根
不溶性蛋白盐
一些常见的蛋白质沉淀剂
１、盐：破坏水膜，中和电荷 盐溶、盐析的概念 ２、有机溶剂：破坏水膜 ３、重金属盐： ４、一些酸类物质：与蛋白质生成不 溶性盐。如：苦味酸、单宁酸、
一些与食品相关的蛋白质的热变性温度/℃ 蛋白质
牛血清白蛋白 血红蛋白 鸡蛋白蛋白 肌红蛋白 热变性温度 65 67 76 79
蛋白质
α-乳清蛋白 β-乳球蛋白 大豆球蛋白 燕麦球蛋白
热变性温度 83 83 92 108
复性(renaturation)
蛋白质的变性程度较轻时，去除变 性因素后，蛋白质恢复原有空间构 象和生物活性的现象称为复性。
介电常数
介电常数是两种电荷被真空隔绝时的电 势与被介质隔绝时的电势的比值。 表示介质影响相反电荷间吸力的数值。
4、变性蛋白质的特征：
①理化性质的改变： 溶解度降低； 粘度上升； 易被蛋白酶水解； 不能结晶。 ②生物学性质的改变 生物活性表失（酶失去其催化活性、 激素失去其调节性、抗体失去其生物活 性、细菌蛋白失去其致病性。）
蛋白质名称 血清蛋白 肌球蛋白 胃蛋白酶 胰蛋白酶 卵清蛋白 白明胶 来源 人血 肌肉 猪胃 胰液 鸡蛋 动物皮 pI 4.64 7.0 2.8~3.0 5.0 4.8~4.9 4.8
３、电泳
带电颗粒向与其电荷相反的电极方 向移动。 意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和 分子量的测定。 血清蛋白电泳图谱：
蛋白质的紫外吸收
波长：280nm 引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸 (Tyr ,Trp)的共轭双键。 可用于蛋白质的定量分析。
色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱
蛋白质的别构作用
含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引 起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功 能发生改变的作用称蛋白质的别构作用。 因别构而产生的效应称别构效应。 正别构效应 负别构效应
（二）蛋白质的两性解离和等电点（pI）
１、两性解离 ２、蛋白质的等电点（pI） ３、电泳
１、两性游离
NH3
+
NH3+
∕ Pr ＼ COOOHH+
NH3 ∕ Pr ＼ COO-
∕ OHPr H+ ＼ COOH
阳离子
（pH＜PI）
兼性离子
（pH=PI）
阴离子
（pH＞PI）
２、蛋白质的等电点（pI）
有机溶剂：乙醇、丙酮等。 破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。 pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。 低温（0℃∽4 ℃）。
③重金属盐沉淀
氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。
反应条件:
NH3+ Pr COOOH-
pH＞pI
NH2 Pr COOM+
NH2 Pr COO-M+
M+： 重金属离子
不溶性蛋白盐
④某些酸类沉淀
蛋白质的颜色反应
反应名称
试
剂 颜
色
反应有关的基 团
有此反应的蛋 白质或氨基酸
双缩脲 反应
米伦反应
加NaCl及少 紫色 量稀CuSO4 加[HgNO3 Hg（NO3）2 HNO3]共热
粉红色
红色
2个以上 肽键 酚基
所有的蛋白 质
酪氨酸
酪氨酸 苯丙氨酸
黄色反应
浓HNO3及 NH3
黄色 桔色
苯基
蛋白质的颜色反应
沉降作用
1、沉降概念： 2、沉降速率： v= dx/dt
3、沉降常数（沉降系数，S）
单位引力场沉降分子下沉的速率。 S= v /ω2x v：沉降速率（dx/dt）可以从实验测得。 ω：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度/秒计。（即 2Л ×转子每秒钟的转速） x：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以cm计）。
5、乙醛酸反应
在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并 沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层 之间出现紫色环。 色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有 此反应。
