蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密
泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。
2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。
鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。
《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。
一、泛素样蛋白的来源及功能
1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域
2. 泛素样蛋白连接后的结果
3. 泛素样蛋白修饰途径的起源
4. 前景展望
二、泛素化途径与人体免疫系统调节
1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系
2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用
3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用
4. 泛素修饰系统在自身免疫机制中的作用
5. 研究展望
三、针对泛素修饰系统的肿瘤治疗方案
1. 泛素连接系统是致癌信号通路的重要治疗靶标
2. 针对泛素连接酶的治疗方法
3. E3连接酶与肿瘤血管形成之间的关系
4. 针对抗凋亡蛋白
5. 去泛素化酶在肿瘤进展中的作用
6. 针对肿瘤细胞的蛋白酶体
7. 非降解途径的泛素化修饰作用与肿瘤发生之间的关系
8. 干扰泛素蛋白识别过程
9. SUMO修饰过程与癌症的关系
10. 未来还将面临的挑战
四、扩展阅读
一种新型抗癌药物——NEDD8活化酶抑制剂
五、其它
1. 内体ESCRT装置能分选泛素化修饰的膜蛋白
2. 内质网的泛素化机制
3. DNA修复过程中的泛素以及SUMO修饰机制
下一期预告：生物信息学在癌症研究中的应用
癌症是一种由遗传和表观遗传改变而引起的疾病。随着各种“组学”技术的进展，癌症的研究正在经历一场革命。后基因组学时代的生物技术进展使分子生物学家得以较为精细地研究DNA（基因组学）、mRNA（转录组学）和蛋白质（蛋白质组学），试图在完整背景下描述癌症的技术革新为研究者获得更多有用的资料，并在新途径下去研究及整合提供了机遇。虽然存在一定的实际困难，但很多的
方案正在开发中，目的是整合关于实例的信息、方案和其它不同来源的资料，以鉴定出重要的趋势和方法，最终找到治疗或诊断癌症的新途径。下一期《生命奥秘》将讨论癌症治疗方法的革命，重点放在生物信息学方面，并进一步讨论如何分析各种组学信息，和它们的应用如何改变了癌症的治疗方法。
一、泛素样蛋白的来源及功能2010-09-21
真核生物蛋白可以通过与各种小分子物质或蛋白质相结合的方式被修饰。在众多的修饰方式当中有一种就是与泛素蛋白或泛素样蛋白（UBL）相结合，采用这种修饰方法可以对多种生理过程进行调控。UBL蛋白可以控制被修饰蛋白与其它生物大分子（比如蛋白酶体或染色质）间的相互作用。各种UBL系统都会使用相应的酶来催化修饰反应，不过这些修饰反应中大部分都是暂时的。有越来越多的证据表明这种UBL修饰途径来自原核生物的硫转移酶系统（sulphurtransferase system）及相关酶类。而且，在真核生物的共同祖先中，类似于UBL连接酶和UBL去连接酶的蛋白也是广泛存在的，这些证据都说明UBL修饰系统不是起源于真核生物。
真核细胞内的蛋白都会经历各种翻译后修饰，这些修饰过程极大地扩展了蛋白的功能多样性和动力学多样性。蛋白可以通过与磷酸基团、甲基化基团、乙酰基团或某些蛋白质基团（通常这种连接方式都是短暂的）相连接的方式被修饰。而泛素蛋白修饰方式就是上述与蛋白质相连的修饰方式中第一个被发现的。现在，我们已经对这种修饰途径研究得非常透彻了。泛素蛋白是一小分子蛋白，它在真核生物界非常保守，但是在真细菌界（Eubacteria）和古细菌界（Archaea）都不存在。泛素蛋白还可以与上千种不同的蛋白结合。
泛素化过程是一个复杂的过程（背景知识框1）。UBL修饰途径也与泛素化修饰途径类似。参与UBL修饰途径的酶虽然各不相同，但在进化上都与参与泛素化途径的酶具有相关性。由于泛素蛋白与UBL蛋白具有相同的三维核心结构——β-抓握折叠（β-grasp fold）结构——这说明各种不同的UBL修饰系统都源自一个共同的祖先。
背景知识框1：泛素蛋白连接机制
泛素蛋白（图中绿色圆圈所示）是由76个氨基酸残基组成的多肽，它可以被一系列的酶促反应活化，进而与底物靶蛋白相连接（如图中箭头所示）。UBL修饰系统采用的也是类似途径。
有三种酶——E1、E2和E3——参与了泛素修饰反应，这包括多泛素蛋白合成反应，即在一个泛素蛋白的基础之上再添加好几个泛素
蛋白（如图中括号所示）。
E1酶负责活化泛素蛋白、E2酶通过转硫醇作用从E1酶处获得泛素蛋白，并将其与底物蛋白相结合，然后E3酶将泛素蛋白与底物连接（在某些情况下会先形成一种硫酯中间产物，然后再与底物结合）。所有真核生物编码的E2和E3同工酶种类非常多，其中E2同工酶有几十种，而E3同工酶则多达数百种。这样，细胞就能对多种蛋白进行各种方式、特异性的修饰和调节，而且这些修饰调控作用也都会受到严密的时空调控。
泛素蛋白的C末端通常都经由酰胺键（amide linkage）与靶蛋白的氨基团连接在一起。最常见的连接是与靶蛋白赖氨酸的ε氨基团相连，不过也可以与靶蛋白的N末端相连。此外，最近还发现泛素蛋白可以与靶蛋白上的半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸相连。在多泛素链中，一个泛素蛋白分子的赖氨酸侧链与另一个泛素蛋白的C末端相连，如此反复形成多泛素链。泛素蛋白含有7个赖氨酸残基，所有这些赖氨酸残基都可以参与上述多泛素链的合成过程。
泛素蛋白的C末端含有甘氨酸残基，在泛素蛋白与其它蛋白相连之前，该残基必须被活化。最初，C末端被E1酶腺苷酰化，随后E1酶的半胱氨酸侧链攻击泛素蛋白的C末端，形成E1-泛素蛋白硫酯中间产物。然后被活化的泛素蛋白被“移交”给E2酶活性位点中的半胱氨酸残基，再在E3酶的共同作用下，催化靶蛋白泛素化反应。E3酶在识别靶蛋白底物的过程中起到了关键性作用（不过有些UBL 途径不需要E3酶的参与）。在泛素化修饰途径中，还有一些不同的E3酶可以催化泛素蛋白与被单泛素化修饰或多泛素化修饰的靶蛋白相连接。这些E3酶有时也被称为E4酶（尤其是在延伸多泛素侧链时）。去泛素化酶（DUB）可以将靶蛋白上的泛素蛋白水解下来，由于DUB酶的存在，泛素化作用只能是暂时的。
这种由泛素蛋白和其它UBL蛋白负责的动态修饰过程构成了一个可逆的“开关”，来控制底物蛋白的不同功能状态，调控细胞内的多种生理活动过程。
泛素蛋白于1975年被首次发现。之后的10年间，我们对泛素修饰系统的进化前体分子（evolutionary precursors）进行了深入的研究。泛素蛋白被认为是真核生物蛋白中最保守的蛋白之一，但直到最近都还没有很好的、足够灵敏的序列比对方法在细菌蛋白质中发现序列相似的蛋白质。不过，近两年技术方法的快速发展彻底改变了这种情况。首先，序列比对方法变得更为先进了，因而发现了许多泛素蛋白以及泛素修饰系统参与蛋白之间的相似之处，也发现了很多细菌蛋白之间的相似之处；其次，结构测定研究发现，在很多原核蛋白、真核蛋白中都有泛素样折叠结构，不过这些蛋白之间在序列上的相似性很低；第三，在对次级代谢产物和酶辅因子，比如原核生物里的硫胺素（thiamine），即维生素B1等的机理分析中发现了UBL蛋白的激活与连接机制。
这些研究进展说明，泛素系统是由各种早就在原核生物里存在的、经历了多样化改变的组成元件和反应体系进化而来的。
在泛素修饰过程中存在的多样性非常奇特，修饰的结果取决于泛素蛋白是以单体形式还是多聚体形式与靶蛋白相连接（图1）。各种不同的泛素蛋白间的连接形式决定了被修饰蛋白的命运。当靶蛋白被多泛素化途径修饰之后会与26S蛋白酶体这种多亚基蛋白酶复合物结合，然后被降解，靶蛋白降解后泛素蛋白会被循环利用。细胞利用这种途径降解那些“多余的”蛋白质，以保证细胞周期的正常进行，保证转录调节、蛋白质含量、信号转导甚至昼夜节律等的正确性。泛素化修饰也有非降解作用，比如介导膜蛋白内吞作用和蛋白质胞内运输作用、参与染色质介导的转录调节作用、DNA修复作用以及信号复合体合成等等。泛素化途径与细胞内这么多的功能都有关系，这就不难解释为什么我们会发现越来越多的疾病都与泛素化途径失调有关了。这些疾病包括癌症、Angelman综合征等严重智力障碍疾病，帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病等神经变性性疾病以及II型糖尿病等等。
1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域
对UBL蛋白及其相关蛋白结构域的研究缘起于上世纪80年代末。当时发现了一种干扰素诱导的、分子量为15KDa的蛋白产物——ISG15。该蛋白在序列上与泛素蛋白有高度的相似性——可以通过共价结合的方式修饰其它蛋白。后来发现ISG15蛋白是表1中所列举的一系列UBL蛋白中第一个被发现的UBL蛋白。尽管如此，直到目前为止我们对它的功能还是知之甚少，至今才发现了ISG15蛋白的E1酶（即ISG15活化酶）和E2酶（即ISG15连接酶）（背景知识框1）。这些酶与ISG15蛋白一样，也都是被I型干扰素诱导表达的。我们用小鼠模型研究发现，蛋白经ISG15蛋白修饰之后，可以表现出抗病毒作用，这也符合ISG15蛋白通过I型干扰素诱导表达的特性。I
型干扰素是机体先天免疫系统对病毒作出反应而产生的活性蛋白。
与泛素蛋白一样，9种UBL蛋白都是通过共价连接的方式连接到靶生物大分子（大部分是蛋白）上从而对其进行修饰的。表1列出了UBL修饰系统常见的靶蛋白（不过该表并不完整）。泛素系统可以对酵母细胞中超过1000多种的不同蛋白质进行修饰，有一些UBL修饰途径，比如SUMO（小类泛素修饰因子）修饰途径的靶蛋白非常多，而且靶蛋白之间差异非常大。而另一些UBL修饰途径的靶蛋白范围则非常有限，比如UBL蛋白酵母蛋白Atg12似乎只有一个靶蛋白Atg5，Atg8蛋白只与一种特殊的磷脂——磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine）相结合。
本表中列举的UBL蛋白都来自酿酒酵母（如果酿酒酵母中有这些蛋白）和脊椎动物（如果酿酒酵母中没有这些蛋白）。如果在酿酒酵母中和脊椎动物中皆存在，则在酿酒酵母UBL蛋白后的括号中显示脊椎动物UBL蛋白。对于E1酶和E2酶，如果酿酒酵母中有这些蛋
白则显示酿酒酵母中酶。UBA6蛋白要比Uba1蛋白的种系分布范围窄的多。
ND：经由标准的BLAST程序没能发现相似性；NI：没有发现；?表示两个结构域各自的相似度。
正如前面提及的那样，大部分的UBL修饰途径使用的酶都是类似的。UBL蛋白连接的主要途径似乎源自一个古老的生物合成途径（我们将会在下文中对该途径进行介绍）。该途径中的酶和蛋白质修饰因子经过了好几轮扩增和多样化改变才变成了今天丰富多彩的UBL 修饰途径。不过在几条特殊的UBL修饰途径中还是存在几种例外的UBL连接机制。比如有一种泛素蛋白水解酶，它不仅能够将泛素蛋白从底物蛋白上裂解下来，也能起到完全相反的作用，将泛素蛋白连接到靶蛋白上。还有一些UBL连接酶来自纤毛虫（ciliates）。我们通过序列分析在纤毛虫中发现了一类具有自我剪接功能的多聚蛋白，它们形成了一系列种类各不相同的UBL结构域以及具有自我剪接功能的细菌内蛋白样（BIL）结构域。这些多聚蛋白的编码基因可能起源于一个编码多聚蛋白的基因，然后在进化过程中又获得了编码BIL结构域的基因。
BIL结构域的N末端具有一个丝氨酸或半胱氨酸残基，这些氨基酸残基可以激活肽键重排机制（peptide-bond rearrangement），通过该机制将BIL结构域上游末端氨基酸肽酰基链（peptide acyl chain）的N转变成O（在N末端是丝氨酸时）或转变成S（在N末端是半胱氨酸时）。这种重排机制起始于裂解和自我间接反应。在BIL-泛素蛋白样蛋白（BUBL）中的BIL结构域内开始N→S酰基转换，该转换过程可能促进了自身催化进程中对底物硫酯（thioester）的亲核攻击（nucleophilic attack）作用，从而将上游UBL蛋白连接到被修饰靶分子上。如果攻击基团是靶蛋白质的赖氨酸侧链，就会得到按照背景知识框1中介绍的那种标准方式进行连接的修饰产物，不过反应过程中没有E1、E2或ATP的参与。值得注意的是，在BUBL前体蛋白BIL结构域上游的序列不是UBL蛋白必需的。因此，可能会有很多蛋白修饰因子，它们并不与泛素蛋白相关，但是可能在结构域的上游起到与BIL结构域相类似的作用。
还有很多其它相关的泛素蛋白，这些蛋白中的泛素样结构域（ubiquitin-like domain, ULD）属于多肽的一部分，但通常它们既不参与任何反应，也不会与靶蛋白发生共价结合。这种ULD结构域赋予所属蛋白（与可转移UBL类似的蛋白）与某些特殊靶蛋白相结合的能力。有一些ULD结构域可以在特定条件下从所属蛋白中被裂解下来，裂解之后甚至还可以与其它蛋白相连接。比如在细胞经历紫外线伤害后发生的去泛素化酶（deubiquitylating enzyme）USP1内部ULD结构域的自我裂解作用（autocleavage）。这种裂解作用发生后酶就会被灭活，导致细胞内单泛素化修饰的PCNA蛋白大量积聚，而这些PCNA蛋白正是细胞进行DNA修复所需要的。
在所有UBL蛋白和ULD结构域中广泛存在的β-grasp fold结构非常古老，可见于各个种系生物，它可能来自某个早期蛋白质翻译系统里的RNA结合结构。该β-grasp fold结构参与了多种细胞功能，从为各种酶活性，比如铁硫簇结合活性（iron–sulphur-cluster binding）搭起骨架结构到蛋白质间的相互作用无所不包。
2. 泛素样蛋白连接后的结果
早期对泛素蛋白开展的研究工作将注意力都放在了泛素蛋白在蛋白质水解过程中的作用上了。26S蛋白酶体负责将被泛素蛋白修饰的靶蛋白水解。多泛素蛋白侧链与蛋白酶体之间的直接结合可能是多泛素修饰靶蛋白与蛋白酶体复合物结合的机制。即多泛素蛋白侧链为靶蛋白提供了一个亲和标签，使其能够与蛋白酶体紧密结合（图2）。在蛋白酶体中具有多种多泛素蛋白侧链受体，此外还在移动穿梭因子（mobile shuttling factor）这种介导多泛素化修饰靶蛋白与蛋白酶体相结合的因子中发现了多泛素蛋白结合结构域（polyubiquitin-binding domain）。
在泛素蛋白与泛素蛋白结合结构域（UBD）之间发生的特异性相互作用不仅仅限于泛素化修饰蛋白与蛋白酶体之间的结合作用。我们在近十年的研究发现，泛素蛋白和UBL蛋白有很多功能都是通过UBD结构域介导的。比如Vps23/TSG101膜蛋白分类因子中的UBD结构域能介导细胞对单泛素化蛋白修饰膜蛋白的识别，而去泛素化酶Ubp14/USP5蛋白中的UBD结构域则能够帮助Ubp14/USP5蛋白特异性识别尚未结合的多泛素蛋白侧链。到目前为止，我们至少发现了16种UBD结构域，这些结构域之间在三级结构和多肽大小（从30个氨基酸残基至150个氨基酸残基不等）之间都各不相同。这些不同的UBD结构域让真核生物能够借助泛素蛋白系统完成多种功能。
UBD结构域与泛素蛋白之间的亲和力通常都比较弱，不过虽然如此，但突变研究还是发现了它们之间的相互作用。将多个泛素蛋白连接到一起可以明显增强它们与UBD结构域之间的亲和力，或者与靶蛋白之间的亲和力。其中最突出的例子就是多泛素蛋白与蛋白酶体之间的结合。Cecile Pickart等人研究了各种长度泛素蛋白对试验底物降解作用的不同抑制程度。结果发现四聚体泛素蛋白的抑制作用最强，三聚体的抑制很弱，而二聚体泛素蛋白则完全检测不到抑制作用。这说明四聚体泛素蛋白形成了一个在泛素蛋白单体或低聚体中都不存在的结合决定簇（binding determinant）。
在UBL修饰途径中研究得最充分的莫过于SUMO途径了。我们通过对SUMO途径中各个酶之间的相互作用以及它们与其它蛋白质间相互作用的研究又发现了很多有关泛素蛋白与靶蛋白间相互作用的详细机制。而且我们还利用遗传、生化以及生物物理学等多个学科的研究最终发现了一个非共价结合的SUMO结合单位——SUMO相互作用基序（SUMO-interaction motif, SIM）。SIM基序是一个由9个氨基酸残基组成的多肽（这要比与泛素蛋白结合的结构域小得多），它的解离常数介于5 μM至10 μM之间，这也就是说它的亲和力要比常见的UBD高很多。在SIM基序中间是由3个或4个疏水氨基酸残基组成的结构，该结构的一侧通常是一组酸性氨基酸残基。SIM 基序在SUMO分子疏表面的β2折叠与α1螺旋之间形成β折叠结构，同时SIM基序末端的酸性氨基酸残基也能与SUMO分子表面的碱性氨基酸残基之间发生相互作用。这种结构与被大部分UBD结构域识别的泛素蛋白中的β-grasp fold结构完全不同。在β-grasp fold 结构中被识别的区域是泛素蛋白第44位异亮氨酸为中心的一块疏水区域。因此，不同的UBL蛋白都可以作为接头分子来发挥相似的功能，但它们与靶蛋白相连接的机制却可以各不相同。
很明显，UBL蛋白与靶蛋白之间的连接通常都会促进靶蛋白与其它蛋白之间发生相互作用。这种泛素化修饰是通过直接参与形成蛋白复合物来发挥作用的（图3a）。蛋白间相互作用也可以通过UBL导致的靶蛋白结合位点构象改变来实现（图3b）。大部分已知的UBL 调节途径都属于前面所述的图3a类别，只有极少数属于图3b类型。即使只有一小部分细胞蛋白经UBL蛋白修饰，它们的活性也足以影响细胞的生理功能。正如前文所述，这种非共价结合的UBL蛋白与靶蛋白之间的相互作用比较弱。不过可以通过多聚泛素蛋白或者
UBL蛋白的方式，又或者泛素蛋白或UBL蛋白与靶蛋白上的多个位点相结合的方式（如图3a、c所示）来增强它们之间的结合力。经SUMO分子修饰的RanGAP1蛋白与核膜孔复合物（nuclear-pore complex）之间的连接就是通过这种多价结合的方式完成的。单独的SUMO 分子或RanGAP1蛋白都无法与核膜孔复合物形成紧密连接。
UBL蛋白发挥作用的另一条途径借助了空间位阻（steric hindrance）机制。靶蛋白上的UBL蛋白可以阻碍靶蛋白与某些蛋白质间相互结合（图3d）。不过目前这种蛋白间阻碍作用的例子还比较少。其中的原因可能是UBL蛋白要能很好地发挥空间位阻效应，需要对细胞内的大多数蛋白都经过修饰才能表现出来。但对于很多蛋白质来说，只有很少一部分得到了修饰。从原理上来说，只要UBL修饰蛋白还连接在靶蛋白上或者改变了靶蛋白的构象，那么这种空间位阻效应就还应该存在。
3. 泛素样蛋白修饰途径的起源
我们最早获悉的有关UBL连接酶起源的信息来自酵母泛素蛋白活化酶E1的氨基酸序列。研究发现E1蛋白与MoeB这种负责合成钼辅因子（Moco）的大肠杆菌蛋白具有少许序列相似性。但是在1991年，E1蛋白的序列刚刚被弄清楚时，我们还不知道MoeB蛋白的生化功能。直到上世纪90年代末，我们才逐渐了解这种钼辅因子合成酶以及硫胺素合成酶的氨基酸序列和生化功能信息。令人吃惊的是，该途径与泛素蛋白活化途径具有相似之处。这是由于硫胺素合成途径几乎存在于所有的细菌当中，而钼辅因子合成途径也存在于大部分的细菌当中，我们认为这些酶系统在进化等级上要比泛素蛋白连接酶高出很多。
3.1 UBL相关硫载体蛋白
要合成钼辅因子和硫胺素分子，就必须在它们的前体物质中加入硫元素，这就需要一种小分子硫载体蛋白的帮助。在钼辅因子合成途径中发挥作用的是MoaD蛋白，而在硫胺素合成途径中发挥作用的却是ThiS蛋白。如图4所示，硫元素是从这些硫载体蛋白C末端的硫代羧酸基团（thiocarboxylate group）上释放出来的。MoaD蛋白和ThiS蛋白都与泛素蛋白一样，在序列的C末端携带一对甘氨酸残基。这些蛋白的C末端在E1样酶（在MoaD蛋白途径中发挥作用的是MoeB蛋白；在ThiS蛋白途径中发挥作用的是ThiF蛋白）的腺苷酰化作用之后，就可以将这些蛋白C末端的甘氨酸羧酸基团转变成硫代羧酸基团。与泛素蛋白一样，MoaD蛋白和ThiS蛋白也都有一个β-grasp fold结构，不过这两种蛋白在氨基酸序列上与泛素蛋白的相似性都不高。因此，泛素蛋白、MoaD蛋白和ThiS蛋白都只是结构相似，它们的C末端都可以经E1样酶的腺苷酰化作用而被激活。早在2000年左右，我们就根据新发现的泛素蛋白相关修饰因子1（ubiquitin-related modifier 1, Urm1）的相关信息，对硫输送系统（sulphur-transfer system）与UBL活化系统之间的进化学亲缘关系进行了深入研究。Urm1蛋白最初是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被发现的，它与MoaD蛋白和ThiS蛋白有关（图4右侧部分）。虽然酿酒酵母缺乏与钼相关的酶系统，而且它还采用了一种与细菌完全不同的途径来合成硫胺素，但它还是表达了E1样酶——Uba4蛋白。该蛋白在序列上与ThiF蛋白和MoeB蛋白具有相似性。Uba4蛋白能与Urm1蛋白相结合，促使Urm1蛋白与其它细胞蛋白发生共价结合。这些研究成果表明Urm1蛋白与Uba4蛋白可能都是UBL蛋白连接系统的一部分（如果从序列相似程度考虑，它们与细菌的硫输送系统会更为相近）。不过正如我们下面将要讨论到的那样，Uba4蛋白也在硫输送系统中发挥了作用，因此，它可能是一种双功酶。鉴于此，Urm1-Uba4系统有可能是一种“分子化石”，它保留了远古硫输送系统的特征，同时又具有UBL
连接酶的活性。
3.2 另一种可能的双功酶——Urm1蛋白
E1样酶在ATP的帮助下活化UBL蛋白C末端的过程与其它腺苷酰化作用过程，比如氨酰tRNA连接酶（aminoacyl-tRNA synthetases）
活化氨基酸的过程非常类似。对UBL蛋白来说，ATP水解提供的能量被转移到E1-UBL硫酯键（thioester linkage）中去了。不过在被化学活化之后，表1中所列举的所有已知的UBL蛋白（除了Urm1蛋白之外）同时也都会继续发生酯基转移作用（transesterification），将能量再转移到E2酶的硫酯键上。唯一例外的是，Urm1蛋白途径没有使用E1-E2酶系统，而是使用了细菌硫输送系统。Uba4蛋白（即Urm1蛋白途径中的E1酶）含有一个硫氰酸生成酶同源结构域（rhodanese-homology domain，RHD）。这一点与其它UBL系统中的E1酶不同（图4）。硫氰酸生成酶和其它几个含有RHD结构域的蛋白都是硫转移酶，它们通过S-S-H中间体的形式将其活性半胱氨酸位点上的硫转移到靶蛋白上。很多MoeB家族蛋白都含有与Uba4蛋白类似的结构，即有一个E1样结构域及与之相应的C末端，还有一个RHD结构域。根据上述以及其它研究结果，我们认为在MoaD蛋白形成的硫代羧酸产物会在MoeB蛋白相关酶（MoeB-related enzyme）的RHD结构域作用下继续形成酰基二硫化物中间体（acyl disulphide intermediate）。由此类推，Urm1-Uba4系统也会用到Uba4蛋白的RHD结构域。Uba4蛋白的RHD结构域会与Urm1蛋白形成暂时的硫酯中间产物，然后再将硫酯键转移至底物，因此在反应过程中并不需要E2酶的参与（图4）。在酿酒酵母中，该Urm1蛋白与靶蛋白的连接过程需要RHD结构域中的半胱氨酸残基参与。
2008年，Jennifer Schmitz等人开展的一项工作发现，Uba4蛋白的RHD结构域也能形成过硫化物，并在体外反应中将其末端的硫转移至Urm1蛋白的C末端，形成Urm1蛋白硫代羧酸产物。E1结构域中的半胱氨酸残基并不是该反应所必需的，Jennifer Schmitz等人
也没有发现Urm1-Uba4硫酯产物。Jennifer Schmitz等人认为，经腺苷酰化作用的Urm1蛋白受到RHD结构域中过硫化物的攻击，会形成酰基二硫化物中间产物，然后再释放出硫代羧酸产物。他们认为这就是Urm1蛋白与靶蛋白连接的作用机制。
最近我们还发现了Urm1蛋白途径的一种新功能，即在某些反义tRNA分子的摆动尿嘧啶（wobble uridine）2号位的O被替换成了S。该途径能控制译码的特异性。Urm1蛋白参与了该反应，可能起到了硫转运的功能。tRNA分子被Urm1途径修饰的程度是否决定了Urm1途径的功能还需要我们进一步研究。Urm1蛋白对靶蛋白的修饰作用也能够让tRNA分子被硫醇化，可能的途径是通过形成能够释放出Urm1硫代羧酸产物的Urm1-Uba4酰基二硫化物，然后将硫转移到tRNA。
虽然Uba4蛋白保守的E1结构域中的半胱氨酸残基在体外Urm1硫代羧酸产物形成的过程中不是必需的，但在体内Urm1蛋白连接的过程中却是必不可少的。该半胱氨酸残基在Urm1-RHD连接产物（该产物是Urm1蛋白C末端硫代羧酸产物而不是Urm1蛋白与靶蛋白之间的连接产物）的还原裂解反应中发挥作用。可能是E1样酶的半胱氨酸残基与RHD结构域间进行过硫化物交换，释放出RHD巯基，攻击Urm1蛋白-腺嘌呤核苷酸（Urm1-adenylate）；又或者是Urm1蛋白-腺嘌呤核苷酸直接被底物的赖氨酸残基攻击，不过该机制无法解释为什么需要两个Uba4蛋白活性位点中的半胱氨酸残基。Urm1-RHD二硫化物的还原裂解反应是被E1结构域活性位点的巯基基团催化完成的，该反应能使RHD巯基再生，能够再次参与形成Urm1硫酯化合物。我们还不清楚这种Urm1蛋白与靶蛋白间的连接机制是否能真实地反映早期前体物质及其它UBL蛋白的连接机制。不过我们相信，在UBL蛋白连接酶系统的进化历程中，出现了一种独特的E2样因子，逐渐使得E1酶丢失了RHD结构域，因此，也去除了过硫化物-硫代羧酸产物（persulphide–thiocarboxylate）形成的这一副反应。或者，真核生物UBL修饰系统可能来自另一种独特的原核β-grasp蛋白修饰系统。
3.3 E2酶的缘起与UBL特异性蛋白酶体
E2样酶源自何时，它又是在何时第一次与E1酶形成E1–E2系统用于UBL修饰途径的？早期的序列比对工作没有在细菌中发现任何与E2酶相关的蛋白，但是最近的研究工作却在同一DNA“邻居”（即在假定的操纵子中，结构域融合区域或共调控基因中）中发现了大量的E2相关序列，这些序列包括UBL相关序列、E1样序列或JAMM（JAB1/MPN/Mov34）金属蛋白酶编码序列等。在真核生物中，有特殊的JAMM蛋白酶来作为去泛素化酶或UBL特异性蛋白酶。
因此，E2蛋白似乎来自细菌，伴随着UBL蛋白和E1样酶一起发展而来。与经典的UBL系统E2酶最接近的亚群蛋白可能就是真核生物UBL系统中E2酶的祖先。虽然到目前为止还没有报道有一个这种原核生物的E2样酶能够与E1酶一起催化UBL与底物间的反应，不过根据其它研究成果，我们相信肯定会有一些原核生物的E2样酶能够催化这种反应。
DUB蛋白或ULP蛋白通常都是UBL蛋白前体物质C末端反应所必需的蛋白，它们可以将UBL蛋白从靶蛋白上裂解下来。虽然经序列分析发现有多种JAMM酶与原核细胞里的UBL修饰系统有关，不过还是有一些JAMM酶只是参与硫转运途径，而不参与UBL修饰途径。比如结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有一种特殊的半胱氨酸合成途径。该途径由E1相关的MoeZ蛋白催化。途径中含有包含β-grasp结构的CysO硫代羧酸衍生物。JAMM酶编码基因与CysO编码基因成簇存在，它也许能在半胱氨酸生物合成的最后一步中将CysO中的半胱氨酸水解出来。萤光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）中合成含硫的thioquinolobactin菌属转铁蛋白（siderophore）需要一名为QbsE的硫转运蛋白参与，该蛋白与MoaD蛋白和ThiS蛋白相关。不过QbsE蛋白以在双甘氨酸基序（diglycine motif）后添加了两个氨基酸残基的前体物质形式存在。JAMM蛋白酶可以将QbsE前体蛋白中的这两个氨基酸残基水解掉。因此，真核生物用来去除UBL蛋白的蛋白酶可能就来自细菌中以β-grasp结构蛋白为基础的生物合成途径，比如UBL蛋白和E1样酶，可能E2样酶也是如此。
3.4 E1样酶对非UBL底物的活化作用
腺苷化酶（adenylating enzyme）里的E1样酶超家族蛋白除了能活化β-grasp蛋白的C末端之外，还能催化一系列的生化反应。最好的例子来自能合成并分泌小分子抗菌素C7（small antibiotic microcin C7, MccC7）的肠道细菌。MccC7是一种由大肠杆菌质粒编码的小分子7肽。MccC7多肽C末端的天冬酰胺酰类似物（isoasparaginyl）与经修饰的腺嘌呤核苷酸之间形成了氨基磷酸酯键（phosphoramidate）。该连接反应需要同一质粒编码的mccB蛋白的参与，而mccB蛋白属于E1样酶超家族。因此，这种E1样酶蛋白的底物不是β-grasp蛋白，该酶所修饰的C末端也与前面介绍的硫转运系统不同，只不过最开始与由E1样酶催化的C末端α羧化物（α-carboxylate）的腺苷酰化作用比较类似。
4. 前景展望
将来还会发现多少种UBL蛋白修饰途径或者相似的途径？很多UBL修饰途径无法通过序列比对的方法被发现，因此可能还有很多
β-grasp蛋白或者UBL修饰因子没有被我们发现。令人兴奋的是，我们在原核生物中发现了大量UBL相关蛋白修饰系统，虽然这些系统中还没有一个系统经过试验验证。对这些系统进行序列分析发现，有大量的细菌调节子都将所有编码β-grasp蛋白、E1样蛋白、E2样蛋白以及相关水解蛋白的基因全部集中到一起。此外还发现，不是所有的E1样蛋白都能与β-grasp蛋白或UBL蛋白发生反应，因此还需要对这些酶的作用进行更深入的研究。
动植物蛋白源替代鱼粉的研究进展 1 鱼粉 1.1 鱼粉的特点 由于鱼粉具有必需氨基酸和脂肪酸含量高,碳水化合物含量低,适口性好,抗营养因子少以及能够被养殖动物很好的消化吸收等特点，一直以来是水产饲料中不可或缺的优质蛋白源。鱼粉在饲料中的营养作用主要是提高氨基酸平衡性和利用效率,与其它蛋白原料相比，有比较显著的优势。但鱼粉的作用不仅在于其蛋白、氨基酸的作用优势, 还在“未知生长因子”、维生素、微量元素等方面具有营养作用优势。 1.2 无鱼粉或低鱼粉饲料技术对策 在所有的饲料原料中，鱼粉在促进养殖动物生长、提高饲料利用效率方面的效果是最为明显的。在配合饲料中，是否使用鱼粉及使用量不同所获得的养殖效果会有很大的差异，即饲料中鱼粉的使用量与养殖鱼产品的生长速度、饲料效率具有显著的正相关关系, 鱼粉在配合饲料中的使用对配合饲料的质量有非常直接的关系。如在草鱼、武昌鱼饲料中基本不用鱼粉，但是使用1% ~2%的鱼粉后,鱼生长速度可以提高10%以上,同时鱼体的生理机能也会得到改善。因此，在不使用鱼粉或低鱼粉饲料中考虑的技术处理主要包括以下几方面的内容。 1.2.1 配合饲料中氨基酸的平衡性和有效性 蛋白质的营养实际上是通过氨基酸的营养作用来实现的，因此,在无鱼粉或低鱼粉饲料中优先考虑的技术处理是氨基酸的平衡性。由于鱼类对单体氨基酸的利用效果很差, 在部分种类鱼中使用单体赖氨酸、蛋氨酸是没有效果的。对于饲料氨基酸的平衡就只能依赖于饲料原料中氨基酸的互补作用来实现, 在设计无鱼粉或低鱼粉饲料配方时可以选择肉粉、肉骨粉、豆粕、菜粕、棉粕等通过比例调整来实现必需氨基酸的平衡。氨基酸平衡效果的评判可以采用必需氨基酸模式相关系数的大小来判定,即以养殖对象鱼肌肉必需氨基酸模式作为标准模式, 将配方中必需氨基酸模式与此进行比较, 计算两组模式的相关系数, 相关系数越大, 表明配方中必需氨基酸的平衡效果越好。但要考虑氨基酸的利用率问题, 即必需氨基酸的有效性问题。有些原料虽然蛋白含量很高, 但消化利用率很低, 如羽毛粉、皮革粉蛋白含量可以达到80% 以上, 但消化率只有30%左右, 无论是单独使用或是加人鱼粉(掺假鱼粉)中, 均会使配方中必需氨基酸的有效性显著降低。因此,在计算必需氨基酸平衡效果时, 尽可能选择消化率高的饲料原料组成配方来进行必需氨基酸的平衡。
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密 泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。 鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。 一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望 二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是 如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游
蛋白质工程的主要研究方法和进展 李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐 (福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108) 摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化 中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02 Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na) Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on 20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1 理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。 2 非理性进化 非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。 易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。 D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase?酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重 47 安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5) 作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15
泛素化蛋白检测方法[精华] 泛素化蛋白检测方法 , 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链(polyubiquitin chain)。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解;如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶(DUB)将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域(UBD)所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域(比如U-box或PHD结构域)的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 , 蛋白质泛素化的检测方法
研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点:哪些蛋白发生了泛素化;发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化;进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么,或者说这一过程中的E3酶是什么, 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应,对下游的信号通路有什么影响, 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一:western blot and strip 通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二:western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三:in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白 B(引起蛋白A泛素化的蛋白)，共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。 方法四:in vitro ubiquitin-binding assay
精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1， A泛 。 SDS电
蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的研究与进展 蛋白质工程的研究与进展摘要: 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。它所取得的进展向人们展示出诱人的前景。 关键词:蛋白质工程；研究；进展；蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。 1、蛋白质工程 1.1蛋白质工程的定义所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 1.2蛋白质工程的由来蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。这就是蛋白质工程的由来。它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。这种新型蛋白质必须是更符合
人类的需要。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的ＤＮＡ重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。 1.3蛋白质工程的原理由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在实施基因操作时，必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响着蛋白质的性状。就现代生物技术发展水平看，大量新蛋白质通过检测，来确定改变的蛋白质是否具有预期的性状，技术上已是可行的。 1.4蛋白质工程的基本途径目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。蛋白质工程发展至当代，利用专一改
《蛋白质工程》 （课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用 所在学院：生命科学与技术学院 专业（班级）：生技131班 学生姓名：梁健 授课教师：韩晓菲
蛋白质组学技术的研究进展及应用 生技131班梁健13772025 摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用 蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以 细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速 发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。 1 蛋白质组学的概念及研究内容 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚 的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理 或病理状态中，发生的相应的变化。 1.2 研究内容 根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质 组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学 研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白
泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？
蛋白质工程的研究进展和展望 农业与生物工程学院07级3班向文宝 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的
蛋白质组学研究进展与趋势 蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。1 994 年澳大利亚Macquaie 大学的Wilkins 和Williams 等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（Proteome）这个概念。2001 年的Science 杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。蛋白质组学的受关注程度如今已令人刮目相看。本文就蛋白质组学研究相关技术与趋势等方面进行简要综述。 1．蛋白质组学研究的研究意义和背景 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysisof gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA 的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA 的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Posttranslationalcontrol )。从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA 丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA 水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90 年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994 年，但相关研究可以追溯到上世纪90 年代中期甚至更早，尤其是80 年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index 计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90 年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一
基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中, 已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥（T. Arabidopsis）等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析。线虫(C.elegans)的基因组DNA测序工作已基本完成。规模更为庞大的人类基因组计划预期在本世纪初(2003～2005年)也将完成全部基因组DNA的序列分析。这些进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此, 蛋白质作为生物功能的主要载体，拥有自身特有的活动规律，在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质间、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等，也就是说, 一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。因为基因组学有这样的局限性，促使人们从整体水平上探讨细胞蛋白质的组成及其活动规律。 为了充分了解和全面认识生命活动的奥秘，90年代中期，在人类基因组研究计划的基础上，萌发了一门新兴的学科¾蛋白质组学(proteomics)，即从蛋白质组的水平进一步认识生命活动的机理和疾病发生的分子机制。科学家们预测，随着人类基因组全部测序工作的完成，21世纪生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质且学，生命科学领域内一个崭新的时代¾蛋白质组时代即将开始。
1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上, 它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。早期定义为：微生物基因组表达的整套蛋白质，在多细胞微生物中，整套蛋白质指一种组织或细胞表达的蛋白质，后来定义为：一个基因组所表达的蛋白质。但是，从基因表达的角度来看，蛋白质组的蛋白质数目总是少于基因组的基因数目。从蛋白质修饰的角度来看，蛋白质组的蛋白质数却多于其相应的ORF数目，因为mRNA的剪切和编辑可使一个ORF产生数种蛋白质，蛋白质翻译后的修饰，如糖基化、磷酸化同样增加蛋白质的种类，氨基酸序列一致的一级结构在一定条件下可以形成功能完全不一样的具有不同空间结构的蛋白质，如朊病毒。故"蛋白质组内蛋白质数目要多于基因组内的基因数目"。 蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化、翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。
饲料博览2018年第10期Research Advances on the Optimal Dietary Protein-energy Ratio of Fish GAO Liuling,PAN Qing * （School of Marine Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China ） Abstract:The appropriate protein to energy ratio in fish feed is an important content of nutrition and feed,which is helpful for utilizing energy and protein,improving feed efficiency,saving feed cost as well as enhancing immune function,and meat quality in fish.In this paper,the research methods of dietary protein-energy ratio,its effects on physiology and growth of fish and the influence factors on protien to energy ratio were reviewed,and the development of suitable dietary protein to energy ratio was prospected.Key words:fish;dietary;protein-energy ratio;influence factors 鱼类饲料适宜蛋白能量比研究进展 高柳玲，潘庆* （华南农业大学海洋学院，广州510642） 收稿日期：2018-08-09 作者简介：高柳玲（1990-），女，广西梧州人，硕士研究生，研究方向为水产经济动物营养与饲料。*通讯作者 摘要：鱼类饲料中适宜的蛋白能量比是营养与饲料研究的重要内容，适宜的蛋白能量比既有利于鱼类对 饲料中能量与蛋白质的利用，提高饲料的效率，节约饲料成本，又利于增强免疫机能和抗病力，提高肉质品质。文章综述了饲料蛋白能量比的研究方法、对鱼类生理生长的影响及影响饲料蛋能比的因素等，并对鱼类饲料蛋能比发展作以展望。 关键词：鱼类；饲料；蛋白能量比；影响因素 中图分类号：S963；S963.3文献标志码：A 文章编号：1001-0084（2018）10-0016-06 饲料中蛋白质和能量的比例影响鱼类的摄食、 生长性能、体成分组成、饲料效率、成活率及肉品 质等。蛋白质因其在饲料成本中占比最大，常作为 第一重要的营养素被关注。能量是鱼类生长、发 育、繁殖、活动的第一需要，也是鱼类饲料定量的 基础。饲料蛋白能量水平不适宜，会抑制鱼类生 长，降低生存和繁殖能力，还会增加养殖成本，污 染养殖水体环境。当饲料能量相对蛋白含量不足 时，饲料蛋白质会被转化为能量维持鱼的生存而不是用于生长，浪费了宝贵的饲料蛋白质；反之，饲料能量过高会降低鱼的摄食量，减少最佳生长所必需的蛋白质和其他营养物质的摄入，影响生长或造成体脂大量积累，导致过度肥胖，影响食用价值[1]。当能量需求满足时，过高的蛋白质会抑制鱼类生长，限制其他营养素的消化吸收，增加氨氮排放，加剧养殖水环境污染[2]。保持平衡的饲料蛋白能量比，常需要配合适量的脂肪和糖类，以提高蛋白质的利用率，起到蛋白质节约效应[3-5]。饲料中蛋白能量比的优化，是开发环保、高效配合饲料的重要考量因素。本文综述了鱼类 动物营养Animal Nutrition 16
仅作参考，如有抄袭，依法追究目录： 1.研究背景 2.泛素化降解途径 2.1泛素的基本结构 2.2泛素化的过程 2.3 E3酶对蛋白底物的识别 2.4 蛋白底物在26S蛋白酶体中的降解 3.研究的意义以及应用 4.研究展望
真核生物细胞中的蛋白质泛素化降解 摘要： 蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径,主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径。泛素系统广泛存在于真核生物中，是精细的特异性的蛋白质降解体系。泛素是一种序列保守的小分子蛋白质，蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体通过消耗ATP的方式降解。泛素系统由泛素、26S 蛋白酶体、多种酶（E1、E2、E3去泛素酶等）组成。其中E1和E2被称为泛素活化酶和泛素载体酶。泛素连接酶E3负责连接泛素与特异性底物，这样泛素化底物可以被26S蛋白酶体降解为若干肽段。泛素系统在真核生物中有非常重要的作用，通过降解蛋白质，调节细胞的分化、免疫，参与转录、分泌调控和细胞形成等，与人类的某些疾病有关。本文就泛素系统的组成、调控机制和研究进展做一介绍。 关键字：泛素系统；E3；26S蛋白酶体 正文： 1.研究背景 蛋白质在细胞内的降解是一个复杂的过程，但是又是一个高度有序的过程。真核生物中蛋白质的降解绝大多数都是由泛素系统完成。蛋白质首先是由泛素分子所特异性识别结合，在泛素分子的介导下，由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用，与26S蛋白酶体作用，被切割成多肽。多聚泛素链可以还原成单体，循环使用。泛素与细胞的多种生命活动有关，例如细胞生长发育过程中组织抑制因子的选择性降解；细胞周期中，周期蛋白选择性降解等。许多疾病和泛素化的过程有关，利用泛素系统治疗疾病也成为了热点。 2.泛素蛋白酶系统 2.1泛素的基本结构 泛素是一种热稳定性蛋白，含有76个氨基酸，相对分子质量8.6kDa。结构保守，如图一是人和酵母细胞中泛素分子序列比对，我们可以看到，只有三个氨基酸的差别。 图一人和酵母的泛素分子序列比对