去内毒素实验方法介绍
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高效去内毒素亲和填料FF
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持和服务，欢迎业内朋友交流合作。
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高效去内毒素亲和填料 FF
一、 简介
内毒素在生物样品中用常规的方法很难去除，而且有的时候它还会和生物制品结合，
这样去除就变得非常复杂，尤其是用原核表达的产品，内毒素含量有时候高达上万 EU/mg，
这样更增加去除的困难。
国际公认最好的方法就是把某些物质偶联到琼脂糖凝胶上做成特异吸附内毒素的亲和
填料，这样它可以特异吸附内毒素，而样品本身不损失，我们就是把这类物质偶联到高度交
结果：
浓度（mg/ml） 内毒素 (Eu/mg)
处理前的样品 2.90
5000-7000
处理后的样品 2.90 <5
四、 亲和填料应用的注意事项： 1、 该亲和填料每次使用前都需用 Buffer 1 处理，包括第一次使用时。 2、 配制缓冲液要用无内毒素的注射级用水，配制过程要防止引入内毒素。 3、 适当延长填料与样品溶液的处理时间可以加大内毒素的吸附量。 4、 如果用磁力搅拌要注意转速别太快，避免搅碎填料。 5、 样品如果本身是带负性电荷，为增加样品回收率，样品中可以加<0.2M NaCl。 6、 样品 pH 可以在 7-9 范围内。 7、 样品内毒素太高，超过填料处理量，需要稀释样品找到内毒素的范围，和经去除后内毒
去内毒素质粒提取原理
去内毒素质粒提取原理内毒素质粒提取原理。
内毒素质粒提取是一种常用的生物实验技术，用于从细菌中提取内毒素质粒，以便进行后续的实验操作。
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的有毒物质，其存在会对实验结果产生干扰甚至影响实验结果的准确性，因此需要将其从细菌中去除。
下面将介绍内毒素质粒提取的原理及操作步骤。
1. 原理。
内毒素质粒提取的原理主要是利用离心技术和化学试剂的作用，将细菌细胞壁破裂并去除，从而得到内毒素质粒的提取物。
首先，通过离心将细菌培养液离心沉淀，得到含有细菌细胞的沉淀物。
然后使用化学试剂（如SDS、蛋白酶K等）对细菌细胞进行破裂和去除内毒素的处理，最终得到内毒素质粒的提取物。
2. 操作步骤。
（1）培养细菌，首先需要在含有适当营养物的培养基中培养目标细菌，使其达到适当的生长状态。
（2）离心沉淀，将培养好的细菌培养液进行离心，得到细菌细胞的沉淀物。
（3）破裂细胞，使用化学试剂（如SDS）对细菌细胞进行破裂，使内部的内毒素质粒暴露出来。
（4）去除内毒素，使用蛋白酶K等化学试剂去除内毒素，得到纯净的内毒素质粒提取物。
3. 注意事项。
在进行内毒素质粒提取实验时，需要注意以下几点：（1）操作环境要保持清洁，避免外源性内毒素的污染。
（2）化学试剂的使用要按照安全操作规范进行，避免对人身和实验物质造成伤害。
（3）离心操作要注意转速和离心时间的控制，以保证细菌细胞的充分沉淀。
（4）内毒素质粒提取物的保存要在低温条件下，避免其降解和污染。
4. 应用领域。
内毒素质粒提取技术主要应用于生物学实验中，如基因工程、蛋白表达等领域。
通过去除内毒素质粒，可以减少实验结果的干扰，提高实验的准确性和可重复性。
总之，内毒素质粒提取是一项重要的生物实验技术，其原理简单而有效，操作步骤清晰明了。
在实际应用中，需要严格按照操作规范进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的内容对您有所帮助，谢谢阅读！。
《内毒素及其去除》课件
利用某些微生物将内毒素作为营养物 质降解，从而降低其毒性，这些微生 物通常被称为“内毒素降解菌”。
05
CATALOGUE
内毒素去除技术的研究进展
新技术的研发与应用
生物膜过滤技术
利用生物膜的吸附作用去 除内毒素，具有高效、低 成本的优势。
免疫亲和技术
利用抗体与内毒素的特异 性结合，实现内毒素的特 异性去除。
纳米材料技术
利用纳米材料对内毒素的 吸附和捕获作用，实现内 毒素的去除。
现有技术的改进与优化
优化活性炭吸附技术
通过改进活性炭的孔径和表面性质，提高其对内毒素的吸附能力 。
强化超滤技术
通过提高超滤膜的孔径和膜材料的亲水性，提高超滤去除内毒素的 效果。
离子交换技术
通过优化离子交换剂的离子配比和粒径，提高其对内毒素的去除效 果。
02
内毒素的致死剂量因人而异，与机体的免疫状态、 健康状况等因素有关。
03
及时诊断和治疗内毒素中毒，可有效降低死亡率， 提高治愈率。
03
CATALOGUE
内毒素的检测与鉴定
内毒素检测的方法
01
02
03
04
鲎试验法
利用鲎变形细胞溶解物与内毒 素反应的原理，通过显色反应 或凝固反应来检测内毒素。
显色基质法
06
CATALOGUE
内毒素去除的实际应用
在医疗领域的应用
医疗设备消毒
通过去除内毒素，可以有效地降 低医疗设备上细菌的数量，从而
降低感染的风险。
药品生产
在药品生产过程中，去除内毒素可 以确保药品的安全性和有效性。
血液透析
在血液透析过程中，去除内毒素可 以降低患者体内的毒素水平，提高 治疗效果。
生物制剂中内毒素去除方法概述
（3）脱氧胆酸盐(DOC)。 DOC 是一种表面活性剂，可以解 离破坏 LPS 因疏水作用而形成的胶束结构，阻碍 LPS 的结合 实现分离。 特别是在较高蛋白浓度的情况下，对蛋白的回收 可以达到 100%。 有研究者考证了在同等条件下的酸性蛋白 溶液中，DOC 比 PMX-B、DEAE、PEI 及 PLL 更 有 效 ， 这 可 能 是因为它作为配基，电荷密度相对较低，与荷负电的蛋白分 子之间的静电作用较弱。
性 能 [D].杭 州 :浙 江 大 学 ，2012 （作者单位：华北制药集团股份有限公司生物技术分公司）
生物制剂中内毒素去除方法概述
作者： 作者单位： 刊名：
英文刊名： 年，卷(期)：
马莹博 华北制药集团股份有限公司生物技术分公司
河北企业 Hebei Qiye 2015(4)
参考文献(4条) 1.焦炳华 分子内毒素学 1995
98
２０15 年第 4 期
LPS 血症中的 LPS。 免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基 制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问 题。
（2）多粘菌素 B(PM 降解革兰氏阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂 A 的磷酸基 团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的 LPS 分子。 采用固定 PMX-B 的纤维素（或琼脂糖）载体 去 除 LPS，有良好的效果和稳定性。但是 PMX-B 的价格昂贵，且有 肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
版社，1995: 2-5 [2]秦 峰.生 物 医 药 制 剂 中 内 毒 素 的 去 除 研 究 进 展 [J]. 药
物 生 物 技 术 ，2003,10(1):53-56 [3]张媛媛.用于内毒 素 去 除 的 新 型 亲 和 吸 附 剂 的 制 备 及
性 能 [D].杭 州 :浙 江 大 学 ，2012 （作者单位：华北制药集团股份有限公司生物技术分公司）
生物制剂中内毒素去除方法概述
作者： 作者单位： 刊名：
英文刊名： 年，卷(期)：
马莹博 华北制药集团股份有限公司生物技术分公司
河北企业 Hebei Qiye 2015(4)
参考文献(4条) 1.焦炳华 分子内毒素学 1995
98
２０15 年第 4 期
LPS 血症中的 LPS。 免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基 制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问 题。
（2）多粘菌素 B(PM 降解革兰氏阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂 A 的磷酸基 团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的 LPS 分子。 采用固定 PMX-B 的纤维素（或琼脂糖）载体 去 除 LPS，有良好的效果和稳定性。但是 PMX-B 的价格昂贵，且有 肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
版社，1995: 2-5 [2]秦 峰.生 物 医 药 制 剂 中 内 毒 素 的 去 除 研 究 进 展 [J]. 药
物 生 物 技 术 ，2003,10(1):53-56 [3]张媛媛.用于内毒 素 去 除 的 新 型 亲 和 吸 附 剂 的 制 备 及
中国药典内毒素检测方法
中国药典内毒素检测方法内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖组分，只有在细菌死亡裂解后才被释放出来。
内毒素对人体细胞产生的危害较小，但可刺激机体产生非特异性炎症反应，如微循环障碍、寒战、发热、血栓形成等。
因此，内毒素的检测对于药品质量控制具有重要意义。
本文将介绍中国药典中规定的内毒素检测方法，包括凝胶法、动态浊度法和终点显色法等。
一、凝胶法凝胶法是一种经典的内毒素检测方法，具有操作简便、快速、经济等优点。
该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生凝集现象。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品同时加入凝胶反应管中，摇匀。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
3.观察反应结果，记录凝集情况。
凝胶法适用于注射剂、滴眼剂等药品的内毒素检测，但不适用于供局部用药的制剂。
该方法的准确性和灵敏度相对较低，但可满足一般药品制剂的质量控制要求。
二、动态浊度法动态浊度法是一种较灵敏的内毒素检测方法，适用于各类注射剂、输液等药品的内毒素检测。
该方法的基本原理是根据内毒素在试管中产生的浊度变化来计算内毒素含量。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入动态浊度反应管中。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
3.观察浊度变化情况，记录反应终点时的时间和吸光度值。
4.根据吸光度值计算内毒素含量。
动态浊度法具有操作简便、快速、准确性和灵敏度高等优点，可满足高精度内毒素检测的需求。
但需要注意的是，该方法易受到杂质、样品颜色等因素的影响，因此需进行空白校正和标准曲线绘制等操作以提高准确性。
三、终点显色法终点显色法是一种高灵敏度的内毒素检测方法，适用于各类药品制剂的内毒素检测。
该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生颜色变化来计算内毒素含量。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入终点显色反应管中。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
去内毒素质粒提取原理
去内毒素质粒提取原理
内毒素质粒提取是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取纯化内毒素质粒。
内毒素质粒是一种含有内毒素基因的质粒，可以通过将其转化到宿主细菌中，利用宿主细菌合成内毒素，从而得到内毒素的高产物。
内毒素质粒提取的原理是基于以下步骤进行的：
1. 提取细菌：首先，从含有内毒素质粒的宿主细菌中提取细菌。
这可以通过培养液基样或者固体培养基上的细菌混悬液得到。
2. 细菌破碎：将提取的细菌进行破碎，使得内毒素质粒释放到溶液中。
破碎细菌的方法有多种，包括超声波破碎法、高压破碎法等。
3. 除去胞外物质：通过高速离心将破碎细菌溶液进行离心，将胞外物质与内毒素质粒分离。
离心后，胞外物质会沉淀在管底，而内毒素质粒则分散在上清中。
4. 滤过纯化：通过滤膜将上清进行滤过，除去残留的固体颗粒和细菌等杂质，得到较为纯净的内毒素质粒溶液。
5. 纯化内毒素质粒：最后，可以采用各种柱层析等方法对内毒素质粒进行纯化。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析等，以获得高纯度的内毒素质粒溶液。
总结而言，内毒素质粒提取的原理利用细菌破碎和纯化方法，
从宿主细菌中提取纯化内毒素质粒。
这种方法可以应用于研究内毒素的性质、制备高纯度内毒素样品等实验需求。
以TritonX114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素
Ｆｕ ｚｈｏｕ ３５的 ２５，Ｃｈｉｎａ
［Ａ玩ｔｒａｃｔ］ 。闰ｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ 二ｍｏｖｅ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｘｉｎ加ｍＰｌａｓ而ｄ脚ｌｕｔｉｏ、 ｂｙ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１１４Ｐｈａｓｅ 阴Ｐａ宝ａｌｉｏｎ俪 ｔｈｅｏａｆｅｔｙ ｏｆ山ｅｅ月邓‘ｍｅｎ回 ａｎｉ盯ｌａ坛ａｎｄｔｈｅ配ｃｕｒａｔｅ ｏｆｔｈｅ祀ｓｕｌｔｅｓ．Ｍｅｔ‘刃５： Ｔｈｅｐｌ州 ｉｄ．ｐＶＡｘｌａｎｄＰＶＡＸＩ一ｈＬＤＨＣｗｅ碑 １即ｌａｔ记 ｂｙａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙ．ｉｓａｎｄ即ｌｙｅｔｈｙｌｅ讹 ｇｌｙｃｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｌｏｎ．Ｅｎ」ｏｔｘ ｉｎｉｎ ＰＩ朋ｍｉｄ阳Ｉｕ“ｏｎ ￣ 祀ｍｏｖｅｄ场 ｔ卜既 刚ｎｄｓ ｏｆＴｒｉ咖 Ｘ一１１４ｐｌｌ毗 此ｐ脚ｔｉ呱，Ｒｅｓｕ】。：Ｔｈｅｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｅｖ ｌｉｎＰｌａｓｍｉｄ刻ｕｔｉｏｎ 礴 代ｄｌｌｃｅｄ 扔 １‘９５ ＥＵ／ｍＬ曲ｅｒｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｅ，Ｉｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅ概ｏｖｅ叮 花ｔｉｏｏｆｐｌａｓｍ 记 ｗ朋 司刃以 ７９名％．Ｎｏｃｈａｒｇ创Ｉｉｎｑｕ耐ｉｔｙｏｆｔｈｅｐｌａｓｍｉｄ￣ ０卜旧ｅｒｖｅｄ． Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ： 几ｅＴｒｉｔｏｎ Ｘ一１１４ｐｈ脱 助ｐａｒａｌｉｏｎｗ朋 ａ耗ｒｙ ｅ瓜ｃｔｉｖｅｍｅｔｈ记 ｆｏｒ 陀姗ｖｉｎｇｅｎｄｏｔｏｘｉｎ加ｍｐｌａｓｍｉｄｓｏｌｕ·
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内毒素除去填料操作流程
内毒素除去填料操作流程内毒素除去填料操作流程内毒素是细菌细胞壁分解产生的一种有害物质，可以导致人体免疫系统失调、炎症反应，甚至休克、多器官功能障碍综合征等危重症状。
在生物技术制药生产过程中，许多制剂和工艺均需要去除内毒素，以保证生产质量和生产安全，其中内毒素除去填料操作是重要的一环。
以下是该流程的详细过程。
一、装备准备1.1 验证设备清洁状态，确认无杂质和残留；1.2 确定用于内毒素除去的填料类型、数量与规格；1.3 检查系统的肝素或其他抗凝剂的添加和有效性；1.4 确定后续操作的条件和参数，如温度、pH值等。
二、填料投入和平衡2.1 将干燥的填料通过口径合适的漏斗、箱、塔等设备中填充到提前清洗并灭菌的内毒素除去设备（如脱色树脂、离子交换树脂、高效蛋白等）中；2.2 使用预定容积的缓冲液洗数组，直到液体流出无色；2.3 使用预定容积的样品处理液洗数组以平衡填料。
二次洗涤、平衡的次数及洗涤液配比必须按照操作手册中的要求执行，以确保填料质量和操作效率。
三、样品处理和内毒素除去3.1 使用灭菌的取样器、管和工具采集待处理样品；3.2 将样品送到内毒素除去装置中，按照操作手册中给定的操作流程，并根据生产要求严格控制洗柿剂、缓冲液的质量和色度；3.3 保持填料床深度，并注意搅拌速度和时间，冷却系统应该及时跟进；3.4 所处理的样品通过滤器或其他装置从除去装置中收集；四、检测与结果分析4.1 将处理后的样品送往实验室，对样品内毒素含量进行检测；4.2 根据检测结果，分析数据；4.3 对于不符合要求的样品通过重复操作，重新进行去除内毒素的操作；4.4 处理效果和操作过程记录在操作手册中。
以上为内毒素除去填料操作流程的详细介绍，有效、规范的操作可以保证产品质量和生产效率，在生物技术制药等生产过程中有着广泛的应用。
如何去除内毒素
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。
将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。
3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。
按内毒素测量方法检测这些溶液。
（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。
（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。
（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。
（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。
（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。
当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。
必要时，重复操作，去除内毒素。
用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。
2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。
（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。
3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。
阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。
3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。
（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。
用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。
（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。
除去细菌内毒素的方法
除去细菌内毒素的方法
除去细菌内毒素的方法有多种，包括以下几种：
1. 加热法：细菌内毒素对热不稳定，加热可以破坏其结构，从而去除内毒素。
例如，通过高压蒸汽灭菌法、干热法等方法进行加热处理。
2. 酸碱处理法：细菌内毒素对酸碱的耐受性较弱，通过酸或碱处理可以破坏其结构，从而去除内毒素。
3. 吸附法：利用活性炭、硅藻土等吸附剂吸附细菌内毒素，从而将其从溶液中去除。
4. 酶解法：利用专一性酶对细菌内毒素进行酶解，从而将其分解为无毒或低毒的物质。
需要注意的是，不同的去除方法适用于不同的场合和具体情况，需要根据实际情况进行选择和应用。
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去内毒素质粒提取Protocol
内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。
细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。
一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。
因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。
图1. 内毒素结构图。
细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。
在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。
内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。
内毒素如何测定？
历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。
鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。
当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。
现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。
LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol
常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。
或者omega、天根等。
在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。
一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。
没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。
如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。
1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。
2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。
3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。
4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。
5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。
6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。
7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。
8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。
9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。
10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。
11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。
12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
13）分装质粒DNA至1.5ml微量离心管中，加入等体积的酚－氯仿，混匀后12000rpm离心5分钟，转移上层水相至另外的微量离心管中。
14）重复步骤13）一次。
15）加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20分钟以上。
16）12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后，37℃干燥至沉淀基本透明。
17）将质粒DNA以干燥的沉淀形式保存于-20℃，使用前按需要溶解DNA。
参考资料丁香园等。