下载文档原格式
检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体Cap重组蛋白芯片技术的研究的开题报告一、研究背景猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种病原微生物，最早在20世纪50年代被报道。
PCV主要致病于猪，常导致猪出现猪肉质软化（PMWS）、猪体重滞增、疣病、肺炎、肝硬化及胚胎死亡等。
尽管PCV能够自然传染，但其病原特异性较高，不会感染人类和其他动物。
因此，PCV的检测和研究对于保护猪的健康和粮食的安全至关重要。
PCV有两种类型，即PCV-1型和PCV-2型，其中后者是猪圆环病毒最常见的毒株。
PCV-2型感染猪的发病率较高，在全球范围内广泛存在，并严重危害猪的健康和生存。
因此，快速、准确、敏感的PCV-2型检测技术在临床应用上具有重要的意义。
抗体芯片技术是一种高通量的方法，能够同时检测数千种蛋白质或抗体，有效提高了检测效率和准确性。
以往的研究表明，抗体芯片技术在各种检测领域有着广泛的应用，包括细胞因子的检测、蛋白质鉴定、病毒感染的检测等。
然而，关于利用该技术检测PCV-2型抗体的研究较少，并且目前尚未见有PCV-2型抗体芯片技术的研究报道。
因此，本研究旨在开发一种利用抗体芯片技术检测PCV-2型抗体的方法，并对其敏感性和特异性进行评估。
二、研究方法1.制备PCV-2型Cap重组蛋白PCV-2型Cap重组蛋白的序列信息将通过基因克隆技术插入到大肠杆菌中，然后用工程菌的表达条件来表达该蛋白质，并用蛋白质纯化技术纯化该蛋白质。
2.制备抗体芯片使用印刷技术将Cap重组蛋白印制在微阵列芯片上，并进行固定和检测条件的优化。
随后，将PCV-2型阳性和阴性血清标记在芯片上，以检测其对Cap重组蛋白的特异性和敏感性。
3.确定检测条件对经Cap重组蛋白处理的血清样品进行检测，确定最佳检测条件包括抗体芯片的温度、温度、孔径大小等。
4.检测PCV-2型抗体标记血清样品，将其滴在制备的PCV-2型抗体芯片上，以检测PCV-2型抗体的存在。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2014,22(5): 28-34猪圆环病毒2 型Cap 蛋白表达及免疫原性鉴定朱 鹏1,2，张小飞2，徐延伟2，尹秀凤2（1.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；2.南京天邦生物科技有限公司 生物技术研究所，南京211102）摘 要：以猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) WH 株基因组 DNA 为模板，扩增 ORF2 截短基因，经Bam H I /Not I 双酶切处理后与经相同酶切处理的 pET32a (+) 原核表达载体连接，获得重组质粒 pET32a-Cap2。
将重组质粒转化至 BL21（DE3），经IPTG 诱导，对表达产物进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
纯化的重组蛋白免疫小鼠，并对获得的血清进行间接 ELISA 检测和中和活性测定。
SDS-PAGE 分析表明，ORF2 截短基因在大肠杆菌中得到表达，蛋白分子质量大小为40 kDa ，重组 PCV2 Cap 蛋白主要以上清的形式存在。
Western blot 证实重组蛋白能够识别抗 PCV2 阳性血清。
经间接ELISA 检测，鼠抗PCV2 Cap 血清抗体效价能达到1:25 600，间接免疫荧光检测分析表明，鼠抗PCV2 Cap 血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap 蛋白。
病毒血清中和实验证实，抗PCV2 Cap 血清抗体具有中和病毒的活性，中和效价为1:36。
猪圆环病毒2型 Cap 蛋白的表达，为进一步研究该蛋白的功能及Cap 蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。
关键词：猪圆环病毒2型 ；Cap 蛋白；免疫原性；中和活性中图分类号：S852.659.2文献标志码：A文章编号：1674-6422（2014）05-0028-07EXPRESSION AND IMMUNOGENICITY OF RECOMBINANT CAP PROTEINOF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2ZHU Peng 1,2, ZHANG Xiao-fei 2, XU Yan-wei 2, YIN Xiu-feng 2(1. College of Veterinary Medicine, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Biotechnology Research Institute, Nanjing Tech-bank Bio-industry Co. Ltd., Nanjing 211102, China)Abstract: The truncated ORF2 of Porcine circovirus type 2(PCV2) WH strain was ampli fi ed and cloned into expression vector pET32a (+). The expression vector pET32a-Cap2 was then transformed into BL2 (DE3) for expression with induction of IPTG. The expressed pET32a-Cap products were analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The recombinant Cap protein was a soluble protein with molecular weight of 40 kDa. The puri fi ed Cap protein was used to immunize mice to prepare antiserum. The resulting murine antiserum had ELISA titer at over 1:25 600 and reacted with PCV2 in infected PK-15 cells in indirect immuno fl uorescence assay (IFA). The murine antiserum also showed neutralizing titer at 1:36. The availability of the recombinant PCV2 Cap protein provides the basis for development of vaccine and diagnostic reagents.Key words: Porcine circovirus type 2; Cap protein; immunogenicity; neutralization收稿日期：2014-03-07作者简介：朱鹏，男，硕士，主要从事动物疾病研究通信作者：张小飞，E-mail：xiaofei0804@猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员，由 Tischer 于1974年首先在 PK-15细胞中发现，并于1982年命名为猪圆环病毒。
猪圆环病毒2型REP蛋白的原核表达及免疫原性鉴定徐萍;范娟;叶正琴;魏荣荣;宋庆庆;丁国伟【摘要】[目的]开发和研制鉴别猪圆环病毒疫苗免疫和野毒感染的ELISA检测试剂盒.[方法]根据NCBI数据库录入的2型猪圆环病毒(porcine circovirus 2,PCV-2)REP蛋白序列(GenBank登录号为KX828581)设计引物,利用PCR扩增REP蛋白全长基,构建原核表达载体pET-28a-rep,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达.[结果]经过SDS-PAGE分析,获得了大小约40 ku的目的蛋白,与理论大小相一致.重组蛋白经镍柱纯化后重组蛋白浓度为40μg/mL,纯度约95％.Western Blot及ELISA鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性.[结论]鉴于该重组蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该重组蛋白可为开发区分猪圆环病毒2型疫苗免疫和野毒感染的检测试剂盒奠定基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)028【总页数】4页(P84-87)【关键词】PCV-2;REP蛋白;原核表达;免疫原性【作者】徐萍;范娟;叶正琴;魏荣荣;宋庆庆;丁国伟【作者单位】扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV-2)是近年来危害养猪业的重要病原之一，可以引发猪圆环病毒病(PCVD)，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道病以及繁殖障碍等[1-2]。
猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达李海花;覃尧;张全红;李秀丽【摘要】Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据.本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应.本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)002【总页数】5页(P337-341)【关键词】猪圆环病毒2型;Cap基因;克隆;原核表达【作者】李海花;覃尧;张全红;李秀丽【作者单位】天津市畜牧兽医研究所,天津300384;中国农业大学动物医学院,北京100193;国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心,北京100190;天津市畜牧兽医研究所,天津300384【正文语种】中文【中图分类】Q786猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体[1]。
PMWS以断奶仔猪的进行性消瘦、贫血、淋巴结肿大、肝炎、肾炎和肺炎为特征。
除PMWS外，PCV2还与许多相关疾病的发生有关，如猪皮炎与肾炎综合征、增生性坏死性肺炎、仔猪先天性颤抖、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、肠炎等疾病也与PCV2有重要关联[1-4]。
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【摘要】为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap (PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化.通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布.结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53％.Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VILPs含量为92.67％.本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2019(046)006【总页数】9页(P1792-1800)【关键词】猪圆环病毒2型(PCV2);病毒样颗粒(VLPs);纯化;鉴定;凝胶过滤层析;离子交换层析【作者】WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒2型(PCV2)属于单股负链环状DNA病毒，无囊膜[1]，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体，对不同阶段的猪均可造成感染[2]，给全球养猪业造成了极大的经济损失[3]。
猪圆环病毒2型CAP蛋白在flashBAC杆状病毒表达系统中的表达与鉴定郭慧娟;樊翠;张英;吕茂杰;梁武;杨保收【摘要】试验旨在通过真核表达系统表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)CAP 蛋白。
以 PCV2 TZ0601株为模板,将PCV2 CAP全基因及CAP去除信号肽的基因编码序列克隆至pOET3载体上,酶切与测序鉴定正确后,将重组质粒 pOET3-CAP及 pOET3-CAP-X转染 sf9昆虫细胞。
采用 flashBAC杆状病毒表达系统表达PCV2 CAP及去除信号肽的CAP蛋白,通过间接免疫荧光法、SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定目的蛋白的表达。
结果表明,真核表达质粒pOET3-CAP 及 pOET3-CAP-X构建成功,目的基因在 sf9昆虫细胞中高效表达,得到的蛋白经 SDS-PAGE和 Western blotting鉴定,在25~35 ku处有蛋白条带,表达的蛋白质可被 PCV2阳性血清识别。
试验结果为进一步制备PCV2亚单位疫苗及诊断抗原试剂盒的研发奠定了基础。
%The study was aimed to express CAP protein of porcine circovirus type 2 (PCV2 )by eukaryotic expression system.The PCV2 TZ0601 strain was the template,the CAP protein with or without the signal peptide of PCV2 coding sequence were cloned into pOET3 vector.The con-structed plasmid were confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing,then sf9 in-sect cells were transfected with recombinant plasmid pOET3-CAP and pOET3-CAP-X.The test was designed to express the CAP protein with or without the signal peptide of PCV2 by flashBAC baculovirus expression system.Expression of PCV2 gene were confirmed by indirect immunofluo-rescent assay (IFA),SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that theeukaryotic expression plasmids of pOET3-CAP and pOET3-CAP-X were constructed successfully and the gene was highly expressed in sf9 insect cells.After expression,we could see our target band about 25 to 35 ku with SDS-PAGE and Western blotting.The immuno-reactivity of the protein was con-firmed by antisera against PCV2.This would lay a foundation for a further study of PCV2 subunit vaccine and diagnostic antigen kit.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)007【总页数】8页(P1876-1883)【关键词】猪圆环病毒 2 型;flashBAC杆状病毒表达系统;CAP蛋白【作者】郭慧娟;樊翠;张英;吕茂杰;梁武;杨保收【作者单位】天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308; 中国农业大学动物医学院，北京 100193;天津瑞普生物技术股份有限公司，瑞普生物研究院，天津 300308【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)首次发现于1974年，是由Tischer等[1]从污染的猪肾细胞系PK-15(ATTC-CCL33)中分离到一种类似圆环病毒的新病毒[2]。
重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究李天增;潘晓梅;张伟;师小潇;徐龙飞;贺笋【摘要】为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five 细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测.结果显示:2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体.研究表明纯化PCV2-rCap 蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2019(053)008【总页数】6页(P30-35)【关键词】PCV2-rCap蛋白;表达;纯化;免疫原性【作者】李天增;潘晓梅;张伟;师小潇;徐龙飞;贺笋【作者单位】天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒病 (Porcine circovirus disease，PCVD) 是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)引起的猪传染性疾病，自1997年Clark等首次分离PCV2以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。
猪圆环病毒2型山西流行株Cap蛋白可溶性表达与免疫原性分析薛翼鹏;赵岳;程景;孟帆;樊振华;米瑞娟;吴忻【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2023(59)1【摘要】为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号:MH922991.1)的ORF 2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。
分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c 雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。
结果显示:重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显著高于勃林格疫苗组(P<0.05),但极显著低于普莱柯疫苗组(P<0.01),首免后第42天3个免疫组的抗体水平差异不显著(P>0.05),表明重组蛋白在小鼠体内免疫原性良好。
本试验成功构建了PCV2e Cap蛋白原核可溶性表达体系,其重组蛋白具有较好的免疫原性,为PCV2的诊断检测和亚单位基因工程疫苗的研制提供了候选抗原,并为该蛋白功能的深入研究提供了科学依据。
【总页数】8页(P28-35)【作者】薛翼鹏;赵岳;程景;孟帆;樊振华;米瑞娟;吴忻【作者单位】山西农业大学动物医学学院【正文语种】中文【中图分类】S834【相关文献】1.猪圆环病毒2型Cap蛋白原核可溶性表达及分析2.稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析3.重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究4.猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达及其免疫原性分析5.表达猪圆环病毒3型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2014,22(5): 28-34猪圆环病毒2 型Cap 蛋白表达及免疫原性鉴定朱 鹏1,2，张小飞2，徐延伟2，尹秀凤2（1.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；2.南京天邦生物科技有限公司 生物技术研究所，南京211102）摘 要：以猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) WH 株基因组 DNA 为模板，扩增 ORF2 截短基因，经Bam H I /Not I 双酶切处理后与经相同酶切处理的 pET32a (+) 原核表达载体连接，获得重组质粒 pET32a-Cap2。
将重组质粒转化至 BL21（DE3），经IPTG 诱导，对表达产物进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
纯化的重组蛋白免疫小鼠，并对获得的血清进行间接 ELISA 检测和中和活性测定。
SDS-PAGE 分析表明，ORF2 截短基因在大肠杆菌中得到表达，蛋白分子质量大小为40 kDa ，重组 PCV2 Cap 蛋白主要以上清的形式存在。
Western blot 证实重组蛋白能够识别抗 PCV2 阳性血清。
经间接ELISA 检测，鼠抗PCV2 Cap 血清抗体效价能达到1:25 600，间接免疫荧光检测分析表明，鼠抗PCV2 Cap 血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap 蛋白。
病毒血清中和实验证实，抗PCV2 Cap 血清抗体具有中和病毒的活性，中和效价为1:36。
猪圆环病毒2型 Cap 蛋白的表达，为进一步研究该蛋白的功能及Cap 蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。
关键词：猪圆环病毒2型 ；Cap 蛋白；免疫原性；中和活性中图分类号：S852.659.2文献标志码：A文章编号：1674-6422（2014）05-0028-07EXPRESSION AND IMMUNOGENICITY OF RECOMBINANT CAP PROTEINOF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2ZHU Peng 1,2, ZHANG Xiao-fei 2, XU Yan-wei 2, YIN Xiu-feng 2(1. College of Veterinary Medicine, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Biotechnology Research Institute, Nanjing Tech-bank Bio-industry Co. Ltd., Nanjing 211102, China)Abstract: The truncated ORF2 of Porcine circovirus type 2(PCV2) WH strain was ampli fi ed and cloned into expression vector pET32a (+). The expression vector pET32a-Cap2 was then transformed into BL2 (DE3) for expression with induction of IPTG. The expressed pET32a-Cap products were analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The recombinant Cap protein was a soluble protein with molecular weight of 40 kDa. The puri fi ed Cap protein was used to immunize mice to prepare antiserum. The resulting murine antiserum had ELISA titer at over 1:25 600 and reacted with PCV2 in infected PK-15 cells in indirect immuno fl uorescence assay (IFA). The murine antiserum also showed neutralizing titer at 1:36. The availability of the recombinant PCV2 Cap protein provides the basis for development of vaccine and diagnostic reagents.Key words: Porcine circovirus type 2; Cap protein; immunogenicity; neutralization收稿日期：2014-03-07作者简介：朱鹏，男，硕士，主要从事动物疾病研究通信作者：张小飞，E-mail：xiaofei0804@猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员，由 Tischer 于1974年首先在 PK-15细胞中发现，并于1982年命名为猪圆环病毒。
PCV 有2种血清型，即 PCV1和 PCV2[1]。
PCV1 无或对猪的致病性低，广泛存在猪体内和猪肾传代细胞系中；PCV2 有致病性，是引发猪断奶后多系· 29 ·第22卷第5期朱鹏等：猪圆环病毒2 型Cap 蛋白表达及免疫原性鉴定剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；FITC 标记的葡萄球菌A蛋白购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 引物的设计与合成 应用 Primer premier5.0 软H I 、Not I 酶切位点。
引GC-3'，下游引物5'-AGAGCGGCCGCTTAGGGGT TAAGTGGGGGGTCTTT-3'，下划线部分为酶切位点。
1.3 ORF2 基因的扩增 取-70℃ 保存的 PCV2 WH 株，接种于已长满单层的 PK-15 细胞培养48~72 h，收获全部培养物，用DNA提取试剂盒提取总DNA。
建立25 μL 扩增体系: r Taq 0.3 μL、上下游引物各 1 μL、dNTP 1 μL、模板 DNA 2 μL、10×buffer（Mg 2+）2.5 μL 、ddH 2O 17.2 μL。
按如下程序扩增：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物电泳检测后，剩余PCR产物用胶回收试剂盒回收。
1.4 重组表达质粒 pET32a-Cap2 的构建及鉴定 分别用Bam H I、Not I 双酶切上述胶回收产物和载体 pET32a (+) ，酶切产物经胶回收后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化DH5α 感受态细胞。
挑取单个菌落培养，提取质粒，分别做PCR 及酶切鉴定，选取阳性质粒，送至上海生工生物工程技术有限公司进一步测序确证，将阳性重组表达质粒命名为pET32a-Cap2。
1.5 重组蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 凝胶电泳分析 分别将空载体 pET32a(+) 和重组阳性质粒转化至 BL21（DE3）感受态细胞中，涂板37℃过夜。
挑取单菌落接种于 LB 液体培养基中（氨苄霉素终浓度100 μg/mL），37℃过夜后，按1:100 的比例接种于氨苄抗性的 LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养2~4 h，至OD 600值为0.4~0.6 时加入终浓度为1mmol/L的 IPTG 进行诱导，37℃继续培养。
在诱导 1、2、3、4、5、6 h时收集1 mL菌液，4℃、13 000×g统衰弱综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[2]，主要侵害机体的免疫系统，造成机体的免疫抑制[3]。
PCV2 与其他细菌病和病毒病混合感染后，大大加剧猪的死亡，业发展的重要病原之一苗和药物来防止 PMWS PCV2 含有2个主要的开放阅读框( open reading frame, ORF)，其中 ORF2 基因编码病毒的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，且 PCV1 和 PCV2 之间不发生血清学交叉反应，是检测病毒抗体水平的良好抗原[6]，也是发展新型疫苗的良好靶基因[7]。
利用杆状病毒表达系统在体外表达的重组 Cap 蛋白（30 kDa）能够自我组装为病毒核衣壳样粒子，并表现出了良好的免疫原性[8]，但因蛋白的表达量较低，限制了进一步的应用。
赵玲等[9]构建了pET32a-ORF2 原核表达质粒，但表达的蛋白主要以包涵体的形式存在。
本研究对 PCV2 ORF2 截短基因进行了原核表达，通过对蛋白表达条件的优化，获得了可溶性的重组蛋白，并且对蛋白的免疫原性进行分析，为进一步研究 Cap 蛋白的功能，研发更为安全、高效、廉价的 PCV2 Cap 蛋白亚单位疫苗和特异、方便、快速检测试剂盒奠定了基础。
1 材料与方法1.1 质粒、菌种及试剂 PCV2 WH 株、PCV2 阳性血清、pET-32a(+) 载体系统、受体菌DH5a及BL21（DE3）感受态细胞均由南京天邦生物科技有限公司生物技术研究所制备并保存；Bam H I、Not I、T4 DNA 连接酶、DNA 提取试剂盒、DNA Marker （DL2000）均购自 TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒均购自 Axygen 生物技术有限公司；蛋白纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司；弗氏佐剂及弗氏不完全佐剂、HRP 标记的羊抗猪 IgG 二抗购自 Sigma 公司；DAB 显色试· 30 ·2014年10月中国动物传染病学报r/min 离心1 min，收集菌体，重悬于适量5×SDS 上样缓冲液中，沸水浴10 min，取10 μL 13 000×g 进行SDS-PAGE 电泳分析。
1.6 重组蛋白的可溶性分析 将诱导表达的菌体，4℃、13 000×g1.7 重组蛋白的纯化用SDA-PAGE检测蛋白纯度，目的蛋白浓缩后用蛋白定量试剂盒定量。
1.8 融合蛋白的 Western blot 鉴定 将纯化后的样品经处理后进行SDS-PAGE，电泳结束后电转移到硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂乳37℃封闭2 h，PBST洗涤5次；用1:100 稀释的抗PCV2阳性血清作为一抗37℃孵育1 h，PBST洗涤5次；放入1:8000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪的二抗中，37℃作用40 min，PBST 洗涤5次后，DAB进行显色。
