PCR引物设计及测序结果分析

PCR技术的基本过程 PCR引物设计及测序结果分析
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
变性
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
94˚C
退火
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。
Tm
延伸
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
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引物（primers)
❖ 引物是人工合成的两段寡 核苷酸序列，一个引物与 感兴趣区域一端的一条 DNA模板链互补，另一个 引物与感兴趣区域另一端 的另一条DNA模板链互补 。(上游引物与DNA序列一 致,下游引物要反相互补.)
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
引物设计原则
❖ 引物长度 ❖ 碱基分布的均衡性 ❖ Tm值 ❖ 引物二级结构 ❖ 引物3’端 ❖ 引物5’端 ❖ 引物的内部稳定性 ❖ 引物的保守性与特异性 ❖ 扩增区域的二级结构
PCR引物设计及测序结果分析
基本原则：
➢ 引物与模板的序列要紧密互补 ➢ 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 ➢ 引物不能在模板的非目的位点引发DNA
PCR引物设计及测序结果分析
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低 ，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中， 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测 需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.
正义链
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反义链
基本分子生物学研究手段
PCR PCR反应液体的成分: PCR循环的程序: PCR原理：
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基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR
PCR引物设计及测序结果分析
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
72˚C
PCR引物设计及测序结果分析
PCR引物设计及测序结果分析
ห้องสมุดไป่ตู้
PCR出现的问题：
引物是否合 适?
➢ PCR扩增未得到目的条带？
➢ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性） ？
➢ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环
PCR引物设计及测序结果分析
PCR结果分析
PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR引物设计及测序结果分析
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
Antisense primer
PCR引物设计及测序结果分析
引物的重要性
❖ 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
PCR引物设计及测序结果分析
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3. 拖尾
➢ 模板不纯或降解 ➢ Buffer不合适 ➢ 退火温度偏低 ➢ 酶量过多 ➢ dNTP、Mg2+浓度偏高 ➢ 循环次数过多
M12
产物在凝胶上呈Smear状态
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4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策
➢ 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外；
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PCR常见问题
1. 无扩增产物
➢ 模板:含有抑制物，含量低 ➢ Buffer对样品不合适 ➢ 引物设计不当或者发生降解 ➢ 退火温度太高
PCR引物设计及测序结果分析
2. 非特异性扩增
➢ 引物特异性差 ➢ 模板或引物浓度过高 ➢ 酶量过多 ➢ 退火温度偏低 ➢ 循环次数过多
PCR引物设计及测序结 果分析
PCR引物设计及测序结果分析
Content
聚合酶链式反应（PCR） 的技术 原理及结果分析
PCR引物设计原理及相关软件的使 用（ Primer Premier 5.0 ）
测序结果分析
PCR引物设计及测序结果分析
一 . PCR的技术原理及结果分析
❖ 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 ，故又称为基因的体外扩增法。
聚合反应(即错配)。
PCR引物设计及测序结果分析
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突 变检测的敏感性。
PCR引物设计及测序结果分析
二. PCR引物设计原理及相关软件的使用 （ Primer Premier 5.0 ）
❖ 引物 ❖ 引物的重要性 ❖ 引物设计的原则 ❖ 引物同源性分析 ❖ 引物设计软件 ❖ 如何使用Primer Premier 5.0 ❖ 酶切位点及保护碱基的添加
PCR引物设计及测序结果分析
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
PCR引物设计及测序结果分析
基本分子生物学研究手段
Northern Blot
PCR引物设计及测序结果分析
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
预变性
94oC 5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
➢ 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。
➢ 各种试剂先进行分装，低温贮存。 ➢ 设置阳性和阴性对照，重复实验
PCR引物设计及测序结果分析
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。