普通PCR及测序PCR原理分解

• 非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大
或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
• 非特异性扩增
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 Mg2+浓度偏高 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3.
4.
5. 6.
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
一个典型PCR体系
反应体系（50 ul）： Taq酶 2.5 U 10x Buffer 5 ul dNTP(2.5mM) 4 ul DNA模板 0.1～2ug 上游引物(10P) 2 ul 下游引物(10P) 2 ul H2O 补足至50 ul 总计 50 ul
原 因
1. 模板:含有抑制物，含量低 2. Buffer对样品不合适 3. 引物设计不当或者发生降 对 解 策 4. 反应条件：退火温度太高，延
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量 2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 管新引物 4. 降低退火温度、延长延伸时间
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下 降。 引物设计： （1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。 （4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接
近，不能相差太大。
（5）引物内部避免形成二级结构。
4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测
PCR常见问题
•
假阴性，无扩增产物
非特异性扩增 拖尾 假阳性
• • •
• 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
已知序列
未知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
多重PCR
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－PCR） 是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作 为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段， 在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段 来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞 中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA 等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）缓冲液（Buffer）
10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用 环境维持在扁碱性（pH8.3,室温） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会 抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活
（6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现 3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限 制。 3’ 5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列
定点突变 探针标记
（4）dNTP
dNTP： dATP， dTTP， dGTP， dCTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
LP（Labelled primers)检测
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
PCR的不同类型
重组PCR 反向PCR 原位PCR 巢式PCR 热启动PCR 实时定量PCR 不对称PCR 多重PCR 连接酶链反应 递减PCR RT－PCR
重组PCR（基因克隆）
质粒DNA
基因片段
重组DNA
Bam H I 5’
5’ Bam H I Bam H I
重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
• 拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
M 1 2
• 拖尾
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20 ～26个，以保证引物与靶序列的特异性结合，其特异 性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热 连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链 温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR 的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个 温度循环，94℃min变性和65℃复性并连接，循环30 次左右. 目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物 病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病 多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴 定，癌基因的点突变研究等.
特点：1.良好的耐热性 在70～80℃具有最高聚合活性 在95 ℃仍然可以有50%活性 2. Mg2+依赖性 3. 扩增时3‘末端凸出一个A 碱基 3. 无校正功能 一般PCR中酶的用量为0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。
（3）引物
引物浓度：0.1-0.5 mol/L
制备杂交探针
基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 , 如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA 的 克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文 库。
原位PCR的作用
既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）， 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方 法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单 拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相 结合。
ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭 新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内 基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定 作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。
反应流程（以扩增片段大小为
800bp为例）：
95℃ 95℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃ 5 min 30 s 30 s 1 min 5 min ------
30个 循环
PCR的特点
1. 特异性强 2. 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能 将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增 到微克(g=10 -6)水平 3. 简便、快速 PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩 增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素， 无放射性污染、易推广
PCR反应的几个要素
• • • • • • DNA聚合酶 模板（要扩增的DNA） 引物 dNTPs Buffer（缓冲液） Mg 2+ 等 生产机器 模具 原料 稳定的环境 润滑剂
PCR反应步骤
95℃（变性）
50℃（退火） 72℃（延伸）
PCR循环（25-35个）
变性(denaturaion)
第5轮扩增（32=25）
PCR的基本原理
第3轮扩增（8）
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 上下游引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR反应条件
1）PCR反应成分 （1）模板
模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR）， 既可以是双链，也可以是单链。
1.
2.
对 策
3. 4. 5.
6.
纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的 浓度 减少循环次数
•
假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染
对策：
1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。
操作步骤
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯 包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内 源性过氧化物酶.
②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的 组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶 K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加 液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环 扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原 位杂交
Bam H I
质粒DNA
目的基因 限制性核酸内切酶
GGAC
CCTG
GTCC
CAGG
GGAC
GTCC CAGG GGAC CCTG GTCC
CAGG
CCTG
不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引 物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM, 关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板
2）循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
退火温度由引物Tm值决定，一般为
Tm – 5~10℃
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC(温度取决于聚合酶的活性） 延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。
Taq酶来自水生嗜热菌
Thermus aquaticus
一
PCR技术
PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型
什么是PCR?
• 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称 ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外 扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简 便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮ Ａ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明， 引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广 泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
95℃
模板DNA
退火(annealing)
50℃
引物1
DNA引物
引物2
延伸(extension)
Taq酶
72℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
95℃
第1轮结束 第2轮开始
模板DNA（1） 第1轮扩增（2）
轮扩增（4） •第2 PCR 反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
第4Biblioteka Baidu扩增（16）
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
注意的事项：
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照
阳性对照： 阴性对照： 试剂对照： 阳性模板 阴性模板 除模板外的所有组分
PCR的类型及应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
LCR连接酶链反应
LCR （Ligase chain reaction）基本原理 为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接， 经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶 基因序列大量扩增. 若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序 列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生 变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接 产物.