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猪圆环病毒2型PCR检测方法操作程序廖荣斌，何启盖（华中农业大学动物医学院）一、原理猪圆环病毒2型感染引发的仔猪断奶衰竭综合症、肾炎与皮炎、增生性肠炎以及母猪繁殖障碍。
通过病原检测和病毒分离是确证本病的重要手段。
猪圆环病毒分为2种，即圆环病毒1型和圆环病毒2型。
前者不致病，后者可致病。
猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组大小为1768 bp或1767bp。
其中，PCV2ORF2基因与免疫保护和毒力等重要特性有关，同时，此基因与PCV1的同源性较低，通过合理设计引物，扩增ORF2，从而可检测并区分PCV2与PCV1。
PCR技术具有快速、敏感的优点，已经用于许多动物疾病病原的检测。
本试验是利用我们设计的引物，通过反应条件的优化，以感染猪组织或血液为模板，扩增PCV2的ORF2基因，从而作出感染的结论。
二、材料准备1、手术器械：采样用。
根据样品数量来确定。
2、微量移液器（规格：2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl）3、反应引物上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分离DNA4、PCR仪：东胜创新5、电泳仪：北京六一电子设备6、紫外检测仪：Bi0-RAD凝胶成像系统7．相关溶液及配方：1╳TAE buffer（电泳缓冲液）配方：（1）称量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：37.2g，置于1L的烧杯中；（2）向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；（3）加入57.1ml的醋酸，充分搅拌；（4）加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；（5）使用时将室温保存的该溶液稀释50倍即可使用。
扩增产物的样品缓冲液：全式金生物6╳Loading buffer。
三．样品采集感染猪或流产的胎儿的肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏；发热期猪的抗凝血或血清；每个样品用单独的剪刀或刀片，避免交叉污染。
农村猪场猪圆环病毒病的血清学调查近年来，农村猪场猪圆环病毒病在中国引起了广泛关注，其对猪场的生产和经济造成了严重影响。
猪圆环病毒病是一种由猪圆环病毒引起的急性传染病，主要表现为发热、呼吸困难、腹泻和脱水等症状，严重时可导致猪的死亡。
血清学调查是对该病毒病进行研究和监测的重要手段之一，本文将对农村猪场猪圆环病毒病的血清学调查进行详细介绍。
一、研究目的本次研究的主要目的是了解农村猪场猪圆环病毒病的流行程度和感染情况，为制定防控策略和保障猪场生产安全提供依据。
具体包括以下几个方面的内容：1.调查不同地区、不同规模的猪场中猪圆环病毒病的感染率；2.了解猪群中不同年龄、不同品种猪的感染情况；3.探讨不同季节对猪圆环病毒病感染率的影响。
二、调查方法1.样本采集本次调查选择了多个地区的不同规模的猪场作为研究对象，从每个猪场中随机选取一定数量的猪只进行血清学调查。
按照猪的年龄和品种进行分类采样。
2.血清学检测采集到的猪血样本将被送往实验室进行猪圆环病毒特异性抗体检测。
常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和血凝抑制试验（VNT）等。
3.数据统计与分析对血清学检测结果进行统计和分析，计算猪圆环病毒病的感染率，并对感染率进行比较，分析不同因素对感染率的影响。
三、调查结果根据调查结果显示，农村猪场中猪圆环病毒病的感染情况较为普遍，部分猪场的感染率甚至超过了50%，且呈现逐年增加的趋势。
生长猪和仔猪的感染率较高，而种猪的感染率相对较低。
在不同季节中，夏季的感染率明显高于其他季节。
四、分析与讨论1.病毒传播途径农村猪场猪圆环病毒病的高感染率主要与疫控不严和管理不善有关。
病毒通过饮水、粪便和密切接触等途径传播，尤其是在高温多湿的夏季容易造成病毒传播加剧。
2.防控策略针对以上调查结果，应采取以下措施加强猪圆环病毒病的防控工作：（1）加强猪舍的卫生管理，定期清洁消毒，保持猪舍内空气流通；（2）加强饲养管理，确保饮水卫生，控制饲料来源，避免猪群感染；（3）定期对猪群进行血清学检测，及时发现感染病例并隔离治疗；（4）采取有效的防疫措施，注重疫苗接种，提高猪的免疫力。
猪圆环病毒2型基因组DNA的结构与功能研究进展赵燕;喻正军【摘要】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒病相关疾病的主要致病原,可损伤宿主的免疫系统,加剧一些细菌病和病毒病感染的临床症状,在全球养猪业中造成巨大损失.PCV2的基因组DNA含有11个开放阅读框(ORFs),其中至少有7个ORFs编码的蛋白质分子质量大于5 ku,但目前只有5种编码的蛋白(Rep、Rep’、Cap、ORF3和ORF4)发现于PCV2复制过程中.作者概述了当前PCV2基因组DNA的结构与功能,阐明PCV2的病原学,为防控PCV2感染提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)005【总页数】6页(P1176-1181)【关键词】猪圆环病毒2型;基因组DNA;开放阅读框;病毒编码蛋白【作者】赵燕;喻正军【作者单位】湖南中岸生物药业有限公司,长沙410199;湖南中岸生物药业有限公司,长沙410199【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的一系列疾病的总称[1]，主要包括猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)及繁殖障碍等疾病。
PCV2感染可严重破坏易感动物的免疫系统，产生严重的免疫抑制，且易诱发多种细菌及病毒的协同或继发感染，给该病的防控带来巨大困难[2]。
1991年，猪圆环病毒病首次发现于加拿大，之后迅速在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和非洲流行，严重威胁生猪养殖业的可持续发展。
中国自2001年首次分离到PCV2以来，山东、浙江、山西、广东、河南等省先后报道该病发生，近年来由PCV2引起的PMWS在中国相关养猪地区呈现暴发流行趋势，对中国的生猪产业造成巨大经济损失[3]。
PCV2是圆环病毒科的一种无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，直径平均为17 nm，是目前发现最小的动物病毒[4]。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：猪圆环病毒（PCV ）包括猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）。
近些年来，PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染，因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 鉴别检测方法显得尤为必要。
本试验通过特异性引物筛选，各项反应条件优化，建立了实时荧光定量PCR 鉴别方法。
结果表明：PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL 。
与猪瘟病毒（CSFV ）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、猪细小病毒（PPV ）均无交叉反应。
批内及批间变异系数均小于1%。
对98份PCV 疑似阳性病料检测结果表明，PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%，共感染率为7.1%。
该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。
关键词：猪圆环病毒；特异性；敏感性；SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0085-07D evelopment and Application of a SYBR Green Real-Time Quantitative PCR Method for Differentiation of Porcine Circoviruses 1, 2 and 3收稿日期：2021-05-24基金项目：山东省重大科技创新工程项目（2023CXGC010705）；山东省现代农业产业技术体系项目（SDAIT-08-06）；山东省自然基金（ZR2022MC011）；济南市“新高校20条”资助项目（202228112）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程（2023TSGC0734）；山东省农业科学院创新工程（CXGC2018E10, CXGC2023G03, CXGC2023E02, CXGC2023A21）作者简介：田瑶，女，硕士，主要从事动物病毒学与免疫学研究通信作者：李俊，E-mail：***************；韩先杰，E-mail：**********************猪圆环病毒1型、2型、3型 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 鉴别方法的建立及应用田 瑶1,2，时建立2，彭 喆2，李 琛2，徐绍建2，吴晓燕2,3，李佳昕1,2，杨 莹2,3，王 硕2，刘 畅2，韩 红2，李 俊1,2,3，韩先杰1（1.青岛农业大学动物医学院，青岛266109；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南250100；3.山东师范大学生命科学院，济南250100）2023,31(6):85-93Abstract: Porcine circovirus (PCV) includes three genotypes: Porcine circovirus 1 (PCV1), Porcine circovirus 2 (PCV2) and Porcine circovirus 3 (PCV3). In recent years, there have been co-infections among these 3 genotypes. Therefore, it is particularly necessary to develop a fast, specifi c and sensitive SYBR Green I real-time quantitative PCR method for differentiation of PCV1, PCV2 and PCV3. In this experiment, a real-time fl uorescent quantitative PCR method was developed by using specifi c primers and optimizing various reaction conditions. The results showed that the lower limits of detection were 40.3 copies/μL for PCV1, 25.2 copies/μL for PCV2 andTIAN Yao 1,2, SHI Jianli 2, PENG Zhe 2, LI Chen 2, XU Shaojian 2, WU Xiaoyan 2,3, LI Jiaxin 1,2,YANG Ying 2,3, WANG Shuo 2, LIU Chang 2, HAN Hong 2, LI Jun 1,2,3, HAN Xianjie 1(1. College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine , Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 3. College of Life Sciences, Shandong Normal University,Jinan 250100, China)· 86 ·中国动物传染病学报2023年12月猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的一种无囊膜环状单链 DNA 病毒，也是迄今为止发现的具有自主复制能力的最小的动物病毒[1-2]。
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展1. 引言1.1 猪圆环病毒2型概述猪圆环病毒2型（PCV2）是一种引起猪瘦弱综合征和猪圆环病毒病的病毒，属于环状病毒科。
PCV2是一种小型非包膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径约17-25nm。
PCV2主要感染猪，特别是生长发育中的猪，并可引起多种免疫抑制相关疾病，严重影响了猪的生长发育和生产性能。
PCV2感染广泛分布于全球范围内，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。
PCV2感染的临床症状主要包括疲劳、厌食、呼吸困难等，重症时还可导致猪的死亡。
随着猪养殖业的快速发展和养猪密度的增加，PCV2感染的发病率也在逐渐上升。
加强PCV2的检测和研究对于控制和预防猪瘦弱综合征和猪圆环病毒病具有重要意义。
通过对PCV2的检测技术和研究进展的深入探讨，可以为疫苗研制和防疫工作提供重要的参考和支持。
【字数：276】1.2 研究意义猪圆环病毒2型是一种广泛存在于猪群中的病原体，能够引起猪圆环病毒病，严重危害猪的生产业。
猪圆环病毒2型检测技术的研究意义在于及早发现并控制病毒传播，保障猪群的健康和生产安全。
通过对猪圆环病毒2型检测技术的研究和应用，可以提高疾病的早期诊断率和治疗效果，降低疫情的传播风险，减少养猪业的经济损失。
研究猪圆环病毒2型的检测技术还可以为相关病毒的检测提供借鉴和参考，推动病毒学领域的发展。
加强对猪圆环病毒2型检测技术的研究具有重要的意义，有助于提高我国养猪业的竞争力和可持续发展能力。
【研究意义】2. 正文2.1 猪圆环病毒2型检测方法猪圆环病毒2型（PCV2）是一种严重危害猪只健康的病毒，因其高度变异性和传染性而备受关注。
为了及时发现和控制PCV2感染，研究人员开发了多种检测方法。
1. 病毒核酸检测：PCR技术是目前应用最广泛的检测方法之一。
通过设计特异性引物，可以实现对PCV2基因组的扩增和检测，具有高灵敏度和特异性。
2. 免疫学检测：病毒抗原检测通过检测病毒在体内产生的蛋白质来确认感染情况。
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【摘要】为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap (PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化.通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布.结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53％.Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VILPs含量为92.67％.本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2019(046)006【总页数】9页(P1792-1800)【关键词】猪圆环病毒2型(PCV2);病毒样颗粒(VLPs);纯化;鉴定;凝胶过滤层析;离子交换层析【作者】WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒2型(PCV2)属于单股负链环状DNA病毒，无囊膜[1]，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体，对不同阶段的猪均可造成感染[2]，给全球养猪业造成了极大的经济损失[3]。
２０２３年第１２期（总第４１５期）畜禽业疫病防治猪圆环病毒２型引发母猪繁殖障碍的诊治林谋运福建省浦城县动物卫生监督所，福建浦城３５３４００摘 要 猪圆环病毒病可发生于不同品种、性别和年龄的猪，猪圆环病毒２型可引发母猪严重的生殖障碍，给养殖户造成较为严重的经济损失。
受猪圆环病毒２型危害严重的猪场可在后备母猪配种前进行疫苗免疫，同时，重视猪群猪圆环病毒的抗原监测，加强生物安全措施，必要时使用抗生素进行药物预防，疾病暴发后采取隔离病猪、紧急接种、药物治疗及环境消毒等措施，可有效防止病情进一步发展，降低养殖损失。
关键词 猪圆环病毒２型；母猪；繁殖障碍；生物安全ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８ ０４１４．２０２３．１２．０２１ 引言猪圆环病毒病是由猪圆环病毒引起猪的多种疾病的总称，根据感染日龄及疾病表现不同，临床分为断乳仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、猪呼吸道病综合征、相关性繁殖障碍以及相关性肉芽肿性肠炎等多种类型疾病，以母猪繁殖障碍、仔猪多系统衰竭和呼吸障碍最为常见［１ ２］。
临床以猪圆环病毒２型为主要流行血清型，我国猪群中猪圆环病毒２型感染较普遍，给养猪业造成较为严重的经济损失。
猪圆环病毒２型引发母猪繁殖障碍的临床治愈率较低，只有做到科学防控才能降低该病的发生率和经济损失。
猪圆环病毒 型简介目前，猪圆环病毒有１型、２型、３型和４型共４种血清型，猪圆环病毒２型为世界性流行和存在的病毒，具有致病性，主要侵害机体的免疫系统，单核细胞和巨噬细胞为本病毒的作用靶细胞，从而造成机体的免疫抑制。
病毒基因组长度为１７６６～１７６９ｂｐ，含１１个重叠的开放阅读框，可细分为ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ共８个基因亚型［３］，但抗原性没有明显差异，在疾病流行前期，毒力较强的猪圆环病毒２ｂ基因亚型为主要流行亚群，自２０１２年后，猪圆环病毒２ｄ基因亚型已逐渐替代２ｂ基因亚型，成为主流的基因亚型［４］。
