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第五章酶分子修饰和改造

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酶工程 第五章

酶工程 第五章

第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。

第五章 酶分子的修饰

第五章 酶分子的修饰
3、加入置换离子 加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的 金属离子结合后，除去多余的置换离子。
三、金属离子置换修饰酶的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响： 了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而
有利于阐明酶的催化作用机制。
2、提高酶活力： 一般α—淀粉酶是杂离子型，即分子中大多数含
有Ca2+，有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子， 如果将其他杂离子都换成Ca2+，则可以提高酶活力， 并显著提高酶的稳定性。
来源：Cys
修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试 剂）
•E－SH ＋

四、咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
一、氨基修饰
来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰
胺、 2，4，6－三硝基苯磺酸、亚硝酸等
①乙酸酐修饰 ② 2，4，6—三硝基苯磺酸修饰
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应)
二、选择酶分子修饰剂 特性： (1)能选择性地与一个aa残基反应 。 (2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。 (3) 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来并鉴定。 (4)反应程度能用简单的技术测定
修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好； 表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；

酶工程-05-酶分子修饰

酶工程-05-酶分子修饰
2、化学修饰法
2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物：
①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与 活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。
②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形 成稳定的共价键。
Enzyme Engineering
位点专一性修饰
18
Enzyme Engineering
酶的结构
研究酶活性中心的方法
2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作
用。
Problem???
怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结 合？
How to determine ?
Enzyme Engineering
催化特性
研究角度 —— 酶学
环境适应性
研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程
Enzyme Engineering
Enzyme Engineering
酶分子修饰
大分子结合修饰
Macromolecules combine modification
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空
间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大分子
Enzyme Engபைடு நூலகம்neering
酶分子修饰
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团

酶分子的改造

酶分子的改造

酶分子的改造酶应用存在的问题：（1）不稳定、易变性：酶作用的最适PH条件一般在中性，PH值常偏离中性范围，使酶难于发挥作用；（2）具有抗原性：在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注人会引起人体的过敏反应。

解决问题的方法：改变现有酶的特性：（1）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构；（2）通过生物工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。

一、酶分子的修饰。

1、概念：酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。

2、酶分子修饰常见的方法。

◆部分水解酶蛋白的非活性主链。

◆利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰。

◆酶辅因子的置换。

3、酶进行化学修饰时的注意事项。

(1)修饰剂的要求：较大的分子质量，良好的生物相容性及水溶性，有较多的反应基团。

(2)酶性质的了解：酶的活性部位，侧链基团的化学性质，最适反应条件。

(3)反应条件的选择：在酶稳定的条件下进行。

二、酶的蛋白质工程。

1、概念：酶的蛋白质工程是指通过基因工程或随机诱变的方式改变编码酶蛋白分子的DNA 序列，从而达到改变酶的生理、生化特性的技术。

2、酶的蛋白质工程常用的方法。

（1）对于一些功能和特性仅仅有蛋白质一级结构中某些氨基酸残基的化学性质决定的酶，可通过基因工程技术直接改变或消除这些侧链来改变原有酶的有关功能或特性；（2）随机诱变编码酶蛋白的基因，然后进行定向的筛选和选择。

3、举例。

◆枯草杆菌蛋白酶：功能：分解蛋白质，可用于去掉衣服上的血渍缺点：在漂白剂的作用下失活（222位的甲硫氨酸易被氧化）。

改造：用丝氨酸或丙氨酸代替其222位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。

◆杂交酶：杂交酶是指由来自两种或两种以上酶的不同片段构建成的新型的酶。

利用高度同源的酶进行杂交，可以将它们各自的优势进行互补，使新获得的杂交酶的特性介于其亲本酶的特性之间。

酶分子修饰和改造

酶分子修饰和改造
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等
三、酶化学修饰的基本原理
1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性
• 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易 伸展打开，从而增强酶的热稳定性。
2．保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电 斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护 酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑 制剂能力增强。
三、举例
3.1 ①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学 发生改变。
（一）叠氮法
七、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟 乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
一、概念
• 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发 生某些精细的改变，从而改变酶的特性

酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生

酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生
01
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。

4.8第五章酶分子修饰

4.8第五章酶分子修饰
4. 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 5. 酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用
等次级键结合。
单选题 1分
下列关于酶活性部位的描述错误的一项是 。
活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催 A 化功能的部位
活性部位的基团按功能可分为两大类：一类是结 B 合基团，一类是催化基团
酶活性部位的基团可以是同一条肽链但在一级结 C 构上相距很远的基团 D 不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位
▪ 超氧化物歧化酶（SOD）：生物体内重要的自由 基清除剂，催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应， 能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织 缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。
▪ 应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局 部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发 性关节炎及辐射防护。
缺陷：半衰期短（6min）、稳定性差、免疫原 性强！
单选题 1分
利用物理吸附法对酶进行固定化主要通过 载体上。
结合于
A 氢键、疏水作用和π-电子亲和力 B 氢键、离子键和π-电子亲和力 C 氢键、离子键和共价键 D 离子键、疏水作用和共价键
提交
单选题 1分
酶固定化后，受载体带电性和产物性质的影响，其最适pH和 酶活力-pH曲线常发生偏移。一般来说，用带负电荷载体制 备的固定化酶，其最适pH较游离酶 ；当催化反应的产物 为碱性时，固定化后酶的最适pH值较游离酶 。
消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、 过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。
（2）侧链基团修饰（小分子修饰 ）
（side residues modification）
通过小分子化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变， 从而改变酶的催化特性的修饰方法。

酶工程 第五章酶分子修饰 第五节氨基酸置换修饰

酶工程 第五章酶分子修饰 第五节氨基酸置换修饰

第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用 来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：β-干扰素原 来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2 个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的 半肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当β-干扰素分子的 游离巯基与另—个β-干扰素的游离巯基相结合形成二硫 键时，β-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys17)用丝氨酸置换，就使β-干扰素不会生成二聚干扰素， 从而大大提高其稳定性。经修饰后的β-干扰素在低温条 件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为β-干扰素 的临床使用创造了条件。
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender 和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心 的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽 的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的 活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸 多限制。
80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换 修饰提供了行之有效的可靠手段。
蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造 与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新 的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具 有新的特性的蛋白质的技术过程。
第五节 氨基酸置换修饰
蛋白质工程主要步骤如下： 1.新蛋白质结构的设计 根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特 性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定 欲置换的氨基酸及位置。 2.突变基因的核苷酸序列的确定 根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序 列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换 的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。

第五章 酶分子修饰

第五章 酶分子修饰
Ag+ 、Al3+、Fe2+、Zn2+、 Cu2+、Hg2+对酶 具有抑制作用, 其中的 Zn2+、Cu2+、 Hg2+对 该酶具有较强的抑制作用。
技术路线图
尼罗罗非鱼
→ → →→
脱氯水暂养2d
取出全部肝脏
肝脏淀粉酶 酶活力研究
一价金属离子对酶活力的影响
钠、钾、锂对酶活力基本没有影响，酶活力相对稳定。
二价金属离子对酶活力的影响
铜对酶活力具有抑制作用, 锌对酶活力没明显影响。
三价金属离子对酶活力的影响
铝对酶活力具有抑制作用,但效果不是很强烈； 铁有促进作用,但促进的趋势则表现为先上升后下降, 最高
值达到130%。
重金属离子对淀粉酶活力的影响
镉、铅对淀粉酶的活力具有显著的抑制作用。 离子浓度分别达到4 mmol /L和5 mmol /L时酶 已全部失活。
来源于超嗜热微生物的酶：具有极高的热稳定性, 通常 能抵抗化学变性剂, 如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱 环境, 其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。
因此, 超嗜热微生物酶已作为研究在极端条件下酶的进 化、稳定性和活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生 物催化性的模型。
α-淀粉酶为重要的工业酶制剂之一, 已被广泛应用在食 品、发酵、纺织、 造纸和制药等诸多行业。
吲哚基修饰
通过改变酶分子上的（色氨酸残基）吲哚基而使酶分子的构象和特性发
α-淀粉酶
1. 合适的钙离子存在，提高酶的稳定性； 93~95℃仍能保持足够高的活性。
2. 各金属离子对不同来源的α-淀粉酶的 活性影响不同。
研究背景
超嗜热微生物：最适生长温度为 80—110℃范围的古菌 和细菌。

酶工程 第五章酶分子修饰 第六节物理修饰

酶工程 第五章酶分子修饰 第六节物理修饰

酶工程
第五章 酶分子修饰
第六节 物理修饰
通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改 变，而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。
物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基因，酶分子 中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键 发生某些变化和重排。例如：羧肽酶γ经高压处理后，底 物特异性发生改变，有利于催化肽的合成反应，而水解反 应的能力降低；用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最 适温度有所降低，在30～40℃的条件下，高压修饰酶比天 然酶的活力提高10％。
第六节 物理修饰
酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下， 先使酶原有空间构象破坏，然后在不同的条件下，使酶分 子重新构建新的构象。例如：先用盐酸胍等变性剂使胰Байду номын сангаас 白酶的原有构象破坏，通过透析除去变性剂后，在不同温 度下，使酶重新折叠形成新的构象。结果表明，50℃条件 下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性比在20℃下重建构象 的酶提高5倍。天然胰蛋白酶的稳定性与20℃条件下重建 构象的酶的稳定性基本相同。

05第五章 酶分子的修饰

05第五章 酶分子的修饰

氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基和吲哚基。
O H2N CH CH2 OH O
C O C O OH O CH CH2 C H2N OH CH CH2 CH2 CH2 OH C OH NH2 O O
C
OH
OH
H2N
CH
C
OH CH CH2
O C OH COOH
CH2 H2N CH2
H2N
CH CH2
Henan University of Science and Technology
第五章 酶的分子修饰
食品与生物工程学院
Henan University of Science and Technology
Go Go Go
1、什么是酶分子修饰 2、酶分子的修饰方法 3、酶修饰后的性质变化
Go
4、酶分子修饰应用
HCl 胃蛋白酶原 pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
食品与生物工程学院
Henan University of Science and Technology
食品与生物工程学院
Henan University of Science and Technology
⑵ 胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
食品与生物工程学院
Henan University of Science and Technology
⑷ 大分子修饰的作用
①提高酶的催化效率 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力 提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原 有酶活力的5.1倍 ②增强酶的稳定性 ③降低或消除酶蛋白的抗原性 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的 抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而

酶分子修饰

酶分子修饰

金属离子置换修饰的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶活力
锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，酶活力可提高20%-30%；结晶的 钙型α -淀粉酶催化效率比杂离子型α -淀粉酶催化效率高3倍以上， 且稳定性增加。 3、增强酶稳定性
含铁的超氧化物歧化酶中铁原子被锰取代后,酶的稳定性和抑制 作用发生显著改变,重组的含锰的酶对H2O2的稳定性显著增强,对 NaH3的抑制作用的敏感性显著降低。 4、改变酶动力学特性
3.酶分子修饰的依据
依据酶的结构特点与酶催化特性的关系即构效关系，找出关 键结构，有目的进行改造，或者以基因的随机重组为手段，参考 酶的构效关系进行关键位点的改造
4. 酶分子修饰的意义
提高酶的催化效率，改变底物专一性； 增强酶的稳定性； 降低或消除酶的抗原性； 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种 物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性 之间的关系。
7. 酶分子修饰的方法
金属离子置换修饰 大分子结合修饰 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 核苷酸链剪切修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 物理修饰 酶分子修饰的应用
第一节 金属离子置换修饰
把酶分子中所含的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催 化特性发生改变的修饰方法。
适用对象：金属ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 1. 酶分子中含有一种或几种金属离子，作为辅因子，往往是酶活 性中心的组成部分； 2. 参与酶的催化作用，或者对保持酶的活性和构象起稳定作用； 3.不同的金属离子可使酶呈现不同特性。
构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。
大分子结合修饰的作用
1、提高酶的催化效率 酶的催化功能是由其空间结构决定的，特别是其活性中心的特定

酶分子修饰和改造

酶分子修饰和改造

7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
三、小分子修饰剂的作用
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
2．氨基的化学修饰
• Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。 • 常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸 （TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中 Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯 (DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
4．芳香环取代反应
• 修饰剂：四硝基甲烷 • 修饰残基：Tyr，Phe。
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰
• • • • 巯基是许多酶活性中心的催化基团 形成二硫键稳定酶的结构 最容易反应的侧键基团之一 通过修饰可提高酶的稳定性
• 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和 碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲 酸（ＤＴＮＢ）。 • DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性 2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间

酶分子修饰

酶分子修饰
7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
O H2N CH CH2 OH O
C
谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应

试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团
（如－NH2，-SH等）发生烷基化。


可作用基团：
氨基（ Lys ， Arg ），巯基（ Cys ），羧基（ Asp 、 Glu ）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
1）提高酶的生物活性（酶活力）。
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。
3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。
4）产生新的催化能力。
第三节 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性” 结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间 障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶 的活性部位。
氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（
Trp）、咪唑基，酚基等。

还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
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定向进化不是定点突变
• 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
三、小分子修饰剂的作用
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
2．提高酶分子的稳定性
• T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.81.4℃. • 8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了 0.7-4.2℃
3．提高底物的专一性和增加对新底物的催化活力
• Beuve和Danchin展示腺苷酸环化酶突变后，鸟苷 酸环化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸环化酶活力 仅残留4% • Zhang等利用定向进化把β-半乳糖苷酶改进成以果 糖为底物的酶
三 氨基酸置换修饰
• 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨 基酸，引起酶蛋白空间构象的某些改变， 从而改变酶的性质和功能。 提高酶活力或增加酶稳定性。
例：对β-干扰素修饰，将17位半胱氨酸 → 组氨酸，提 高稳定性 mRNA UGU,UGC → AUG,AGC DNA ACA,ACG → TCA,TCG 将A突变成T，定点突变
（四）羰二亚胺法
• 修饰酶分子上的羧基。
3.2 糖类的修饰反应
（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应 1.溴化氰法 右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶 的游离氨基共价连接，生成修饰酶。
2.高碘酸氧化法
高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶 分子上的氨基结合而生成修饰酶。
（二）糖肽的修饰反应
七、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟 乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应
（三）聚氨基酸修饰酶
聚赖氨酸修饰酶 Lys上的氨基与含羧基较多的酶的羧基通过羰二亚胺产生交联。
3.4 天然大分子对酶的修饰作用
• 肝素修饰酶 肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成。
• 羰二亚胺法
• 用羰二亚胺活化肝素分子上的羧基后，与酶上的氨 基共价连接。
• 人血清白蛋白修饰酶
• 戊二醛法
• 利用戊二醛双功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基 相互交联。
• 医药
解除医用酶免疫源性和抗原性
提高医用酶稳定性
延长医用酶体内半衰期
• 生物技术领域
改变酶最适pH 改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或 mRNA 进行改造或修饰 2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的 一级结构进行改造
三、酶化学修饰的基本原理
3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分 子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 • 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭 受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。 4. 消除酶的抗原性 • 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了 酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 • 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
• 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、 苯甲酰卤代物等。 • 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。
3．氧化和还原反应
• 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原 剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等） • 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二 硫键（还原）。
三、举例
3.1 聚乙二醇及其修饰反应
• 聚乙二醇的特点：
①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学 发生改变。
（一）叠氮法
2．氨基的化学修饰
• L基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸 （TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中 Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯 (DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性 2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间
糖肽分子上有游离氨基，活化后能与酶分子上氨基反应。 ① 2,3-异氰酸甲苯活化法
②戊二醛法
3.3 合成大分子多聚物修饰酶
（一）聚N-乙烯吡咯烷酮 N-乙烯吡咯烷酮修饰酶时，首先要开环水解，经活化反应，才 能与酶联结。
（二）聚乙烯醇修饰酶
聚乙烯醇与硝基苯酰氯反应后，其产物的硝基用连二亚 硫酸钠还原成氨基，与酶分子中羧基共价连接。
三．定向进化的选择策略
– 突变 – 蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片 消化分析
定向进化的基本方法
• 高突变菌株
Stratagene 公司构建了缺失DNA修复3个途径的大肠 杆菌菌株，基因突变率高5000倍
• 易错PCR
DNA shuffling
体 外 定 向 进 化
Increasing the ee-value of the lipasecatalyed hydrolysis of the chiral ester
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
随机突变+定向选择＝目标突变体
最适生长温度提高了！
诱发突变的 因素
细菌
50 C培养
0
最适生长温度为 37 C
0
突变体库
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
定向进化
– 属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的 空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化 条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重 组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向 选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
3. 羧基的化学修饰
• 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 • 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。
• 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测 定羧基含量。 • ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 • ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修 饰剂。 • ．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行 修饰。
一、概念
• 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发 生某些精细的改变，从而改变酶的特性
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
• 糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、Sephadex G25） • 聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、 丙烯酸等的单聚或共聚物） • 具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质 等。 • 修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二 醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
第五章
酶的分子修饰和改造
第一节 酶化学修饰的原理和方法
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。
酶化学修饰的应用
• 理论研究
酶中特定基团之间的距离 氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定
75%
81%
%ee
57% 31% 2%
0% 0 1 2 3 4 mutant generations
四
定向进化的应用
1．提高酶分子的催化活力
• L—天冬氨酸酶定向进化研究 – 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。 – 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热 稳定性均优于天然酶
第四节 其它修饰方法及修饰酶的性质
一、金属离子置换修饰
1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶 的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换 修饰。 2．常用离子 常用二价金属离子。 3．修饰方法
二、肽链有限水解修饰
• 用专一性较强的蛋白酶或肽链为修饰剂，使肽链 部分水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的性质和功能。 • 增加某些酶的活性 • 减少或消除某些酶的抗原性。
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等