当前位置：文档之家 › 酶分子修饰

酶分子修饰

  • 格式：ppt
  • 大小：1.62 MB
  • 文档页数：90

下载文档原格式

  / 90

合集下载

酶分子修饰

酶分子修饰

Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。金属离子置
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
22
2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6
min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
第五章 酶分子的修饰

第五章 酶分子的修饰

3、加入置换离子 加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的 金属离子结合后，除去多余的置换离子。
三、金属离子置换修饰酶的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响： 了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而
有利于阐明酶的催化作用机制。
2、提高酶活力： 一般α—淀粉酶是杂离子型，即分子中大多数含
有Ca2+，有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子， 如果将其他杂离子都换成Ca2+，则可以提高酶活力， 并显著提高酶的稳定性。
来源：Cys
修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试 剂）
•E－SH ＋

四、咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
一、氨基修饰
来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰
胺、 2，4，6－三硝基苯磺酸、亚硝酸等
①乙酸酐修饰 ② 2，4，6—三硝基苯磺酸修饰
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应)
二、选择酶分子修饰剂 特性： (1)能选择性地与一个aa残基反应 。 (2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。 (3) 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来并鉴定。 (4)反应程度能用简单的技术测定
修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好； 表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；
《酶分子的修饰》课件

《酶分子的修饰》课件

糖基化修饰通常发生在酶的特定氨基酸残基上，形成N-连 接或O-连接的糖链。糖基化修饰在多种生物学过程中发挥 重要作用，如蛋白质分选和分泌。
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
酶分子的化学修饰

酶分子的化学修饰


2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
第四章：酶分子修饰

第四章：酶分子修饰


（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。
酶分子修饰

酶分子修饰


3. 巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的残基侧链，巯基的亲核性强， 往往是酶分子中最容易反应的侧链基团之一，在维持蛋白亚基之间 的相互作用和酶催化过程中起重要作用。 巯基容易被氧化成 —S—S—
常用的巯基修饰剂： 烷基化试剂；马来酰亚胺；有机汞试剂； 5-5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂）
三氯均三嗪 法
第三节
侧链基团修饰的作用
Hale Waihona Puke 侧链基团修饰采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而 改变酶催化特性的修饰方法。
用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和 功能的影响。 1. 荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象； 2. 各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成； 3. 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底 物的束缚能力； 4. 利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量； 5. 改变酶的结构和催化性能。
侧链基团修饰
1. 氨基（—NH2）修饰
氨基修饰剂作用于侧链上的氨基，产生脱氨基作用或与氨基共价结 合，将氨基屏蔽。
氨基修饰剂：2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯 （DNFB）、丹磺酰氯（DNS） 1.1氨基的烷基化
2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）
准确测定酶蛋白中赖氨酸的数量
1.修饰剂的选择 根据酶的分子结构和修饰剂的特性，选择水溶性大分子。 生物相容性好、抗原性弱、无毒。 右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物等 2.修饰剂的活化 使大分子中所含的基团在用前需活化后，活化后的基团才能在一 定条件下与酶分子某侧链基团反应。
3.修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以 一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间， 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶 分子进行修饰。 4.分离 不不同酶分子的修饰效果往往不同，需要通过凝胶层析等方 法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较 好修饰效果的修饰酶。
酶的分子修饰

酶的分子修饰


DENATURATION 93°C - 95°C
EXTENSION 72°C
酶的分子修饰
优点： ✓抗体制备简单
任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简 单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。
酶的分子修饰
缺点： ✓制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最 近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能 的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋 白又生产其抗体的可能性。 ✓在医学上要解决酶—抗体复合物在体内的抗原性。目前 采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体
酶的分子修饰
2.1.酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能
发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称 为离子置换法。
主要是二价离子的置换修饰
酶的分子修饰
置换修饰过程 酶液中加入Eபைடு நூலகம்TA
置换修饰酶
透析或超滤 加入金属离子
酶的分子修饰
置换修饰的要点 等价同荷置换
酶的分子修饰
酶的分子修饰
生物体中存在的酶分子修饰
❖酶原激活 ❖共价修饰
酶的分子修饰
酶原激活
Proteolytic Zymogen Activation.
酶的分子修饰
共价修饰
酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去， 引起酶分子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰调 节酶。
酶的分子修饰
酶的共价修饰方式
能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外 部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是 由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。
酶分子修饰精选

酶分子修饰精选


突变方法 易错PCR DNA改组 盒式诱变 易错PCR/DNA改组 盒式诱变 DNA改组 DNA改组 易错PCR/DNA改组 随机/定位诱变 DNA改组
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） ➢ 在酶学研究方面的应用 ➢ 在医药方面的应用 ➢ 在工业方面的应用 ➢ 在抗体酶研究开发方面的应用 ➢ 在核酸类酶人工改造方面的应用 ➢ 在有机介质酶催化反应中的应用
修饰中的应用。 6、酶分子的物理修饰有何特点？ 7、何谓酶定向进化？有何特点？ 8、简述突变基因定向选择的基本过程。 9、举例说明酶定向进化技术的应用。
•44
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 1、在酶学研究方面的应用 酶活性中心的研究 酶的空间结构研究 酶的作用机制研究
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 2、在医药方面的应用 降低或者消除酶的抗原性 增强医药用酶的稳定性（半衰期）
4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 3、在工业方面的应用 提高工业用酶的催化效率 提高工业用酶的稳定性 改变酶的动力学特性
苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
Cys（半胱） 巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺
二硫键 巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）
His（组） 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸
Tyr（酪） 酚羟基 碘、四硝基甲烷
Trp（色） 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺
4. 酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） ➢ 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学
4.6 酶的定向进化
➢ 定向进化：模拟自然进化的过程，进行人工随 机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使 进化朝着人们所需方向发展的技术过程。
分子定向进化 定向进化
细胞定向进化
酶分子的修饰

酶分子的修饰

• 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以 使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；
• 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力 达到原有酶活力的5.1倍
15
• 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水 溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并 可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产 生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
• 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作 用力，其稳定性也就增加了。
14
共价修饰
• 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
• 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。
21
金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除 去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金属 螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金 属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛 层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时酶 往往成为无活性状态。
Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的稳定性和抑 制作用发生显著改变：Mn-SOD对H2O2稳定性显 著增加．而对NaN3的抑制作用显著降低。
24
第二节 酶侧链基团的修饰
酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定 性和消除作为外源物质在体内的抗原性。 要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和 反应条件的选择以及对酶学性质的了解等 方面，都必须有足够的了解。
3
酶分子修饰

酶分子修饰


3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上 敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂 后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
同理，其他有机溶媒，去垢剂等也由于会 破坏维持酶天然构象的平衡力和改变微环 境而导致酶失活。
4、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡力 被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还由于大分 子修饰剂本身就是多聚电荷体，所以有可能在酶 分子表面形成一层“缓冲外壳”。在一定程度上 抵御外界环境的电荷、极性变化，维持酶活性部 位的微环境相对稳定，使酶能在更广泛的条件下 发挥作用。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
根据蛋白水解酶是一大分子物质，并只是在充分接近多肽 链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，酶化学修 饰期望交联于酶上的大分子修饰剂能产生空间障碍来阻挡 蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭 破坏。 另外，酶分子上许多敏感基团（如赖氨酸的ε-氨基等）参 与修饰反应，交联上修饰剂后，也减少了酶分子遭受蛋白 水解酶攻击破坏的可能性。
化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种 化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子 上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化 学反应，对酶分子结构进行改造。
化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。 只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保 持酶活性的基础上，能够在较大范围内改 变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。
酶分子的基本结构是蛋白质，这一特性就决定了 当某种酶在作用于底物使之转变为产物的同时， 其本身也可能成为另一种酶（如蛋白水解酶）的 底物。对于蛋白水解酶来讲，一般是作用于某些 特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。
酶分子修饰PPT课件

酶分子修饰PPT课件

方案。
进行修饰实验
根据修饰方案进行实验 操作，实现酶分子的修
饰。
性能评估
对修饰后的酶进行性能 评估，包括稳定性、选 择性、催化效率等方面
的评估。
03
酶分子修饰的应用
酶分子修饰在医药领域的应用
药物设计和改造
疾病诊断和治疗
通过酶分子修饰技术，对药物分子进 行化学结构的改造和优化，提高药物 的疗效、稳定性和选择性。
为了克服现有酶分子修饰技术的局限性，需要不断探索新的修饰方法和策略，提高修饰效 果和特异性。
深入研究酶分子结构和功能关系
深入了解酶分子结构和功能关系，有助于更好地选择修饰位点和设计修饰方案，以实现酶 性能的优化。
开发酶分子修饰的应用实例
加强酶分子修饰在解决实际问题中的应用研究，例如在生物医药、环保、能源等领域的应 用实例开发。
分子，用于解决一些重要的生物学和工业问题。
提高酶的稳定性和催化效率
02
通过酶分子修饰，可以改善酶的稳定性和催化效率，使其在极
端条件下的应用更加广泛。
扩展酶的应用领域
03
随着酶分子修饰技术的发展，酶的应用领域也在不断扩展，例
如在生物医药、环保、能源等领域的应用。
酶分子修饰的未来研究方向
探索新的修饰方法和策略
酶分子修饰的类型
化学修饰
利用化学试剂对酶分子进行修饰 ，改变酶的活性、稳定性等性质 。常见的化学修饰方法包括磷酸 化、糖基化、甲基化等。
生物修饰
利用生物酶对酶分子进行修饰， 改变酶的性质。常见的生物修饰 方法包括蛋白质工程、基因敲除 和突变等。
酶分子修饰的重要性
提高酶的稳定性
通过酶分子修饰可以增加酶的稳 定性，使其在极端环境条件下仍 能保持活性，拓宽了酶的应用范

第6章酶的分子修饰课件

❖ 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具 有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好 修饰效果的修饰酶
（1）三氯均嗪法
❖三氯均嗪环上的氯原子很活泼，容易产生 亲核取代反应。
❖当环上的一个氯原子被取代后，能够稳定 其他的碳-氯键（第一个氯原子在4℃就能 反应，第二个氯原子在25 ℃反应，第三个 氯原子在80℃反应）。
3、糖肽
❖糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶 降解人纤维蛋白或γ-球蛋白而得。
❖糖肽结构上有氨基，经活化后能与酶分子 上氨基反应而产生共价结合。
（1）异氰酸法 （2）戊二醛法
4、具有生物活性的大分子物质
肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄 糖和两种糖醛酸组成，平均分子量2000左 右。肝素共价交联酶后可增加酶的稳定性， 同时由于肝素在生物体内还具有抗凝血、 抗血栓、降血脂等活性。 ❖羧二亚胺法 ❖溴化氢法 ❖三均嗪法
②酰基化 乙酸酐
丹磺酰氯（DNS）
③还原烷基化
一个常用的特异性修饰赖氨酸氨基的试剂 磷酸吡哆醛
（3）羧基的化学修饰
修饰羧基的反应专一性差，一般选用合适的 R和R’的水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸 和谷氨酸，属烷基化反应。
①水溶性碳化二亚胺
②酯化 氟硼化三甲基金羊盐（CH3)3OBF4
（4）咪唑基的化学修饰
什么是酶分子修饰？
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改 变，从而改变酶的某些特性和功能的技 术过程称为酶分子修饰。
第一节 酶的化学修饰
❖广义：凡涉及共价部分或部分共价的形成 或破坏的转变。
❖狭义：较温和的条件下，以可控的方式是 一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应， 从而引起单个氨基酸或其功能基团发生共 价的化学改变。
2、特定氨基酸残基侧链基团的化学修 饰

第06章 酶分子修饰


2.定点突变法氨基酸置换

现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技 术。定点突变（site directed mutagenesis）是 20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是 指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变 从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程 （Protein Engineering）和酶分子组成单位置换 修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或 核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效 的手段。
非共价修饰
使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护 酶的一些添加物，它们既能通过氢键固定在酶分子 表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保 护酶的活力。

如多元醇、多糖、多聚性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。



应用最广的修饰剂
聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良 好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、 无抗原性，分子末端有可活化的羟基，活 化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛 用于酶的修饰。 可用多种不同试剂活化，修饰不同基团 聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺 聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺


一、化学修饰分类

（一）酶分子主链修饰 （二）酶分子侧链基团修饰 （三）大分子结合修饰 （四）氨基酸置换修饰 （五）金属离子置换修饰 （六）亲和修饰
（一）酶分子主链修饰

利用酶分子主链的切断和连接，使 酶分子的化学结构及其空间结构发 生某些改变，从而改变酶的特性和 功能的方法。
什么是酶分子修饰？

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从 而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分 子修饰。

第六章_酶分子修饰

（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为 原来的2.25倍。
一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活 提高原来的 5.1倍。
一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高 0.30倍
（2）增加酶的稳定性
酶的保存或使用一段时间后，由于各种因素影响，原 来完整的空间结构受到破坏，酶活力降低，甚至完全 丧失催化能力。
聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
是MPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应。在pH7-10时， 对酶的氨基进行修饰。
聚乙二醇胺类衍生物：
是MPEG的羟基与胺类化合物反应生成的。可以对酶的羰 基进行修饰。
聚乙二醇马来酸酐衍生物：
MPEG的羟基与马来酸酐反应生成共聚物（PM），其中 马来酸酐通过酰胺键对酶分子的氨基进行修饰。
3）修饰：
活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反 应，使两者以共价键结合。 4）分离：
通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度 的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰 酶。
右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷
三、大分子修饰的作用
酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后 会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进 入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使 酶失去催化能力。
抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引 起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗 原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。
利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原 性。
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB）和4－硝基苯硫 绿可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以 与巯基反应。

《酶的分子修饰》课件

酶的分子修饰
汇报人：
单击输入目录标题 酶的分子修饰概述 酶的磷酸化修饰 酶的乙酰化修饰 酶的糖基化修饰 酶的甲基化修饰
添加章节标题
酶的分子修饰概述
酶的分子修饰的定义
酶的分子修饰是指酶在生物体内通过化学修饰改变其结构和功能
常见的酶分子修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等
酶分子修饰可以调节酶的活性、稳定性和定位 酶分子修饰在生物体内具有重要的生理功能，如信号传导、细胞周期调 控等
酶的分子修饰的类型
磷酸化修饰：通过磷酸化酶催化，使酶分子上增加或去除磷酸基团 乙酰化修饰：通过乙酰化酶催化，使酶分子上增加或去除乙酰基团 甲基化修饰：通过甲基化酶催化，使酶分子上增加或去除甲基基团 泛素化修饰：通过泛素化酶催化，使酶分子上增加泛素分子
酶的分子修饰的意义
调节酶的活性：通过修饰改变酶的活性，以适应生理和病理条件下的变 化 参与信号传导：酶的修饰可以参与信号传导，影响细胞功能
影响代谢途径：酶的修饰可以影响代谢途径，影响细胞代谢和功能
参与疾病发生：酶的修饰异常可能导致疾病发生，如癌症、糖尿病等
酶的磷酸化修饰
磷酸化修饰的种类
磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰
磷酸化修饰的酶
磷酸化酶：催化磷酸化反应的酶 磷酸酶：催化去磷酸化反应的酶 磷酸化修饰的酶：在酶分子上引入或去除磷酸基团的酶 磷酸化修饰的作用：调节酶的活性、定位和稳定性
磷酸化修饰的作用
调节酶的活性：磷 酸化修饰可以改变 酶的活性，从而影 响生物体的代谢过 程

酶分子修饰


（三）肽链有限水解修饰

1、概念

2、修饰后酶性质的变化
3、修饰剂

1、概念

利用肽链有限水解，使酶的空间结构发 生精细的改变，从而改变酶的特性与功 能的方法。
2、修饰后酶性质的变化

（1）提高酶活力 （2）降低或无抗原性

3、修饰剂
专一性较强的蛋白酶或肽酶
（四）酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨 基酸残基上的功能团。 包括：氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、 咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、 甲硫基等。
第三节 蛋白质工程
（基因水平上进行蛋白质改造）


以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分析技术、蛋 白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的 一种定点定位修饰技术体系，也是在基因水平进 行蛋白质改造的技术科学。 常用：化学全合成法、限制酶酶切片断取代法等。 蛋白质工程在酶的改造方面目前研究比较系统的 例子是组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂（TpA）

第一节 酶的化学修饰
（一级结构水平的改造） （原理 、方法、应用） 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要 选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基 础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然 酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。 化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所 具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活 化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶 活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进 行改造。

1、特定的氨基酸残基侧链 基团的反应类型
（1）酰化及其相关反应 （2）烷基化反应 （3）氧化还原反应 （4）芳香环取代

酶分子修饰

第四章 酶分子修饰
第二节
酶分子的修饰方法
• 金属离子置换修饰
• 大分子结合修饰(共价/非共价)
• 侧链基团修饰
• 肽链有限水解修饰
• 氨基酸置换修饰 • 酶分子的物理修饰
1. 酶的金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使
酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离
子置换修饰。
• 但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差， 而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难 以工业化生产。
• 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技 术。 • 定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80 年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获 得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用 的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置 换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。
(1)对巯基的化学修饰：
常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 E-SH + ICHCOOH ----- E-S-CHCOOH + HI
(2)氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯 （PITC)等。
大分子修饰(共价)的过程
• 修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚 糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
• 修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某一种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。
酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有： 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、 吲哚基、硫醚基及二硫键等。
2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性
（1）对巯基的化学修饰 巯基是蛋白质的一类 重要的亲核基团，因此常被用来修饰。修饰方法 大体上有如下几种：
（2）大分子共价修饰
利用水溶性大分子与酶结合使酶的空间结构发生 某些精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法 称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄 糖、环状糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纤维 素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表 面、形成一层覆盖层。 这些大分子修饰剂在使用前一般需经过活化，然 后在一定条件下与酶分子中的侧链基团以共价键 结合对酶分子进行修饰。
酶的大分子修饰总结
非共价修饰
• 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护 酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既 能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地 与外部水相连，从而保护酶的活力。
• 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等 能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 • 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作 用力，其稳定性也就增加了。
金属离子置换修饰的注意事项
金属离子置换修饰只适用于那些在分子 结构中本来含有金属离子的酶。

用于金属离子置换修饰的金属离子，一
般都是二价金属离子。
金属酶的金属取代举例
如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被Co2+取 代后的酶，其最适pH和底物专一性都有改变：Zn 酶对乙酰Ala的最适pH8.5．而Co酶为7.0；钴酶 对N—氯乙酰Ala等6种底物的水解活力增加，而 对N—氯乙酰Met等三种底物的活力降低。在使用 时对不同底物可以选用不同的酶——Zn/Co酶。
Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的稳定性和抑 制作用发生显著改变：Mn-SOD对H2O2稳定性显 著增加．而对NaN3的抑制作用显著降低。
第二节 酶侧链基团的修饰
酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定 性和消除作为外源物质在体内的抗原性。 要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和 反应条件的选择以及对酶学性质的了解等 方面，都必须有足够的了解。
此外，还有脂质体包裹、反相胶团微囊化 修饰方法1.2 酶分子内部的修饰
1.2.1非催化活性基团的修饰
用化学试剂与酶蛋白上的非催化活性基团部位的一 些氨基酸残基进行共价连接进行修饰的方法。
被修饰的残基可以是亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、 His)，也可以是亲电的(Tyr、Trp)．还可以是可氧化的(Tyr、 Trp、Met)。 对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。
1.2 酶分子内部的修饰
1.2.3 酶蛋白主链修饰
酶蛋白主链修饰主要是靠酶法对酶蛋白的主链进 行相关修饰。
如用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后， 酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位 分子量变化不大。这说明天然酶平时处于非最佳的催 化构象状态。
1.3.2 酶的金属离子置换修饰
(2)氨基的化学修饰
①乙酸酐修饰
②2，4，6—三硝基苯磺酸修饰。
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应) Sanger反应的作用？
④氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、 芳香卤和芳香磺酸等。
脂质体是天然脂类和或类固醇组成的微球体。 酶分子可包埋在其内部。它可通过与细胞的膜融合 或内吞作用而进入细胞内。 脂质体无毒、易制作，亦被用作基因载体。把 经过表面修饰的SOD包埋在脂质体中便可进入细 胞。Michelsonn发现，被包装的SOD进入细胞的 能力比非脂质体大得多，但包装后的SOD进入胞 内能力与脂质体成分及电荷特性有关。
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使
酶的特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属
离子置换修饰。 酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、 稳定性及其抑制作用。
• α -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子 (Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸 酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、 锌离子(Cu2+,Zn2+)
1.2.2 催化活性基团的修饰
通过有目的、选择性修饰侧链成分来实现催化活 性基团部位内的氨基酸的取代，这种将氨基酸侧 链转化为另一种新的氨基酸侧链的方法，叫化学 突变法。
如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys 残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力， 但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方 法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没 有蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基 酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。
右旋糖酐的活化：
右旋糖酐经高碘酸活化后，酶上氨基共价结合形成 修饰酶。
大分子结合修饰后的酶，呈现出来的催化特性： （1）通过修饰提高酶活力 （2）通过修饰增加酶的稳定性 （3）通过修饰降低或消除抗原性
1.1.5 脂质体包裹
酶脂质体包埋，能使一些被包埋的大分子的酶进入 细胞内。 许多医药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大， 不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免疫原 性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决， 如SOD用聚乙二醇(PEG)修饰，修饰后其在体内的 稳定件及免疫原性都大大改善。但如何让修饰后的 SOD进入细胞内？可以采用脂质体包裹的方法。
酶分子修饰的意义
• 提高酶的活力 activity • 增强酶的稳定性 stability
• 降低或消除酶的抗原性 immunological property • 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的 影响 structure
回本章目录
第一节
酶分子的修饰方法
什么是酶分子修饰？
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行 改造，以达到改构和改性的目的. 即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基 团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行 共价连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被 称为修饰试剂。
为什么要进行酶分子修饰？
酶具有稳定性差，活力不够高，以及 可能具有抗原性等弱点使酶的应用受限制。 因此人们希望通过酶分子修饰来改善这些弱 点，来提高酶的使用范围和应用价值。
共价修饰
• 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 • 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 • 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以 使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； • 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力 达到原有酶活力的5.1倍
1.1.2 酶的小分子修饰作用
用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提 高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰 酶表面的一些基团：—COOH、一NH3+、— SH、—OH、咪唑基等。 如将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更 强的基团，酶的热稳定性在60℃时提高了1000倍， 温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经 受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶 马肝醇脱氢酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和 甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加 最大，同时酶的稳定性也提高了。
1.1.3 酶的大分子修饰
分为大分子非共价修饰和大分子共价修饰两类
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相 互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、 右旋糖苷等．它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能 通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等 能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌 的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如 肽和聚胺)发挥作用的结果。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，因而 增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体 或酶聚合体的活力和稳定性比单体高
2.1被修饰酶的性质 在开展酶的修饰工作前．对被修饰酶的酶学性质必 须有一个较为全面的了解。
2.1.1 酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及PH范 围以及最适温度、最适PH的情况等应有所了解。 2.1.2 酶活性中心的状况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此对酶活 性中心的组成，如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其 侧链基团参与了酶活性中心．是否需要辅因子，此 外还需了解酶分子形状、寡聚酶的亚基组成等。
大分子共价修饰后的这种可溶性酶有许多有用的 性质：如用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)， 不仅降低或消除酶的抗原性，且提高了稳定性， 抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从 而提高了酶药效。
日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶 上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能 够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常 催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催 化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成， 已用于制造合成甜味剂。
1.3.2 酶的金属离子置换修饰
• 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会
丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子， 酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 • 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出
不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，