实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
- 格式:doc
- 大小:20.50 KB
- 文档页数:2
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA,十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4~8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同,分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶(切割位置在识别序列内部)。
对质粒进行酶切,通过跑胶观察片段大小,从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒,操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL),12000rpm离心1min ,弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中,12,000rpm离心1min,弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ(P1),vortex。
4. 加250 solution Ⅱ(P2),上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注:此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ(P3),立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中,尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ,弃收集管中的液体。
注:此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液(PW)于离心吸附柱中,12000rpm离心1min ,倒掉废液。
8. 重复上一步,9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中,在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中,12,000 rpm离心30 sec,弃滤液。
实验二重组质粒的提取和鉴定一.提前一天扩增细菌(教师准备) 1.接种环;酒精棉球;火柴;酒精灯;记号笔;15 mL试管架;废物桶;2.15mL 离心管,内装5mL已加有100μg/mL 氨苄青霉素的LB液(共需40管)*请提前消毒45管内装5mL LB液的试管二.实验当天(一)每组(共40组):1.饭盒内装: 1.5 mL Epp管×5纸巾×52.装冰的小盆;记号笔;镊子;废物桶;废液杯;3.1000、100、20 μL加样枪及枪头4.50 mL试管架和1.5 mL Ep管架5.一次性手套6.混匀板7.ddH2O×0.1 mL8.10×buffer 3uL(二)两组公用(共20套):1.250 mL三角烧瓶(内装0.6g琼脂糖) 2.GelRed×6 μL3.1×TAE×500 mL 4.剪刀;电泳槽;梳子;量筒(三)全班公用(讲台上)*2份:1.AXYGEN 质粒小量制备试剂盒2.EcoR I酶3.Cla I 酶4.10×buffer5.λDNA Hind III Markers6.卷纸×4;保鲜膜(四)另外需:1.37℃水浴(内装1.5mL水漂)2.-20℃冰箱3.振荡器4.室温台式离心机5.低温15 mL离心机6.低温1.5 mL离心机7.电泳仪(两组共用)8.紫外检测仪(全班共用,在实验室讲台侧)(五)讲台上托盘中:1.电泳槽;胶布;混匀板;三角烧瓶2.公用试剂(冰浴)3.10 μL加样枪及枪头。
重组质粒进行鉴定时,可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定:以重组质粒为模板,pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定:双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮,而目的条带暗的现象,其实很正常。
因为一般情况下,质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多(一般质粒碱基都有好几千bp,而目的条带通常就几百到一千多bp)。
当我们用EB进行染色时,EB是掺入到到dna链中,碱基数越多则掺入的eb就越多,在紫外光下显示的条带就越亮,也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后,如果两种方法都鉴定正确了,你就可以送到公司进行测序,做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话,也可以采取如下方法:
1.电泳时吸取的产物量加大,加入到大孔梳子的胶当中,如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时,可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚,就把你的酶切产物浓缩一下。
实验二质粒DNA的提取及酶切(8学时,6小时)一、实验目的:通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理:碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA,内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器:1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料:1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂:1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤(一)质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL),然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落,37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中,4000r/min,倒出培养液,将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中,旋涡震荡将细菌沉淀悬浮,室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置),轻轻混匀内容物,溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器,裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷),盖紧管口,轻轻混匀数次。
绿色荧光蛋白的克隆摘要:目的:研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法:分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒,将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP,将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化,用抗生素抗性筛选后,通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词:绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract:Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用,重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
实验二重组质粒的构建一、实验步骤1.提取质粒DNA2.酶切(EcoRI+SpeI)注意事项:①酶量,反应时间及体积: One unit of enzyme is defined asthe quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in onehour。
反应时间的选择。
一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少,可延长反应时间(16h);反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。
酶的体积不要超过总体积的10%(甘油应在5%以下)。
②酶的使用:酶应永远放冰上,应是最后一个被加入到反应体系中,用完后及时放回冰箱③DNA的制备:待切割的DNA应当已去除酚,氯仿,乙醇,EDTA, 去污剂或过多盐离子等④缓冲液:不同酶需不同离子强度缓冲液,使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。
⑤混匀:很重要,注意不可振荡⑥反应温度:通常37 ℃⑦终止反应:终止液,热失活,酚/ 氯仿抽提⑧星号活性:在非理想条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
3.: 酶切产物纯化4.连接二、实验结果与分析1.酶切结果检测图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图注:M:DL5000DNAmarker;1号泳道;未酶切proB 质粒DNA;10、11号泳道:EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果;16、17泳道:EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果分析:①由图1可知,1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带,其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低,条带亮度过低难以识别。
②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体,但有轻微拖尾现象,条带呈圆弧型,应该是因为点样量较大。
经EcoRI和SpeI双酶切后,环状的质粒DNA被分成两个部分,分别为约5000bp和40bp的片段,其中40bp的小片段因分子量小,迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶,在图中无法看到。
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定实验目的:练习质粒的抽提及双酶切的实验过程,熟悉相关操作。
实验材料及设备pMD-T重组质粒;内切酶Xba I 及Pst I;10×M Buffe r;琼脂糖;电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提挑取筛选平板上的白色菌落,接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期↓取培养液倒入2 ml eppendorf管中,4℃下12000 rpm离心2分钟,去上清↓沉淀中加入150 μl溶液I(50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)),剧烈振荡使菌体悬浮,室温下放置5分钟↓加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1%SDS, 临用前配制)盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),室温下放置5分钟↓加入180 μl预冷的溶液III(5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌)盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀↓冰浴10分钟,4℃下12000rpm离心10分钟↓上清液移入干净eppendorf管中,计算体积↓加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24:1),混匀20℃下12000 rpm离心10分钟,取上清, 计算体积↓加等体积的氯仿/异戊醇(24:1),12000 rpm离心10分钟↓将上清移入干净eppendorf管中,计算体积↓加入2倍体积的无水乙醇↓混匀后置于-20℃冰箱中30分钟↓然后4℃下12000 rpm离心10分钟↓弃上清,将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出,用70%乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次↓将管倒置于纸巾上使液体流尽,室温干燥↓将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0,(含20μg /ml RNaseA )中,储于-20℃冰箱中备用B 双酶切反应1、在PCR管中配制下列酶切体系(1×M Buffer):重组质粒10 ul(未稀释的原液)ddH2O 6 ul10×M Buffer 2ulXba I 1ul (15 U )Pst I 1ul (15 U )总体积20ul2、反应管置37℃下,酶切反应3~4小时。
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验目的:练习质粒的抽提及双酶切的实验过程,熟悉相关操作。
实验材料及设备
pMD-T重组质粒;内切酶Xba I 及Pst I;10×M Buffe r;琼脂糖;电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤
A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提
挑取筛选平板上的白色菌落,
接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中,
37℃振荡培养约12小时至对数生长后期
↓
取培养液倒入2 ml eppendorf管中,4℃下12000 rpm离心2分钟,去上清
↓
沉淀中加入150 μl溶液I(50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)),
剧烈振荡使菌体悬浮,室温下放置5分钟
↓
加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1%SDS, 临用前配制)
盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,
以混匀内容物(千万不要振荡),室温下放置5分钟
↓
加入180 μl预冷的溶液III
(5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌)
盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀
↓
冰浴10分钟,4℃下12000rpm离心10分钟
↓
上清液移入干净eppendorf管中,计算体积
↓
加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24:1),混匀
20℃下12000 rpm离心10分钟,取上清, 计算体积
↓
加等体积的氯仿/异戊醇(24:1),12000 rpm离心10分钟
↓
将上清移入干净eppendorf管中,计算体积
↓
加入2倍体积的无水乙醇
↓
混匀后置于-20℃冰箱中30分钟
↓
然后4℃下12000 rpm离心10分钟
↓
弃上清,将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出,
用70%乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次
↓
将管倒置于纸巾上使液体流尽,室温干燥
↓
将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0,(含20μg /ml RNaseA )中,储于-20℃冰箱中备用
B 双酶切反应
1、在PCR管中配制下列酶切体系(1×M Buffer):
重组质粒10 ul(未稀释的原液)
ddH2O 6 ul
10×M Buffer 2ul
Xba I 1ul (15 U )
Pst I 1ul (15 U )
总体积20ul
2、反应管置37℃下,酶切反应3~4小时。
.
3、酶切反应产物的检测:反应管中加入6×溴酚兰载样缓冲液4 µl,混匀后于1.0%琼脂糖凝胶中电泳,同时取8 µl DNA分子量标准DL2000于样品相邻孔中电泳,紫外光观察仪观察或凝胶成像仪照相。
根据分子量标准判断扩增产物大小和大致浓度。
本实验中预计酶切产物为844 bp。
C DNA琼脂糖凝胶电泳观察(同实验一)。