下载文档原格式
重组质粒的酶切和PCR验证1、学习和利用限制性内切酶酶切检验重组质粒插入片段的方法；2、复习限制性内切酶酶切原理和方法；3、学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术；4、学习利用PCR方法检验重组质粒插入片段的方法；5、了解引物设计的基本要求；【实验原理】1、重组质粒是外源基因通过单酶切与用相同的限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。
2、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），即PCR技术是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。
PCR的反应组分包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+、4中脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适合的缓冲体系等。
反应包括DNA变性，引物复性和引物延伸三个基本过程。
①DNA变性，即在90-95℃高温下，加热使模板DNA双链解离，形成两条单链DNA；②引物复性，又称为引物退火。
将反应温度降低，使两个引物分别与变性的单链靶DNA特定部位结合形成部分双链DNA；③引物延伸，即在60-72℃以及四种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，由DNA 聚合酶催化，以单链靶DNA为模板，根据碱基配对原色，在引物3’端掺入dNTP合成新的DNA互补链，产生新的双链DNA。
3、PCR反应有两个重要特征：一是经PCR扩增后，扩增产物片段在大小由两个引物与模板的结合位点决定；二是经过PCR扩增，产物以指数级数增加，可达到目的片段的大量扩增。
在此实验中PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
4、寡核苷酸引物或称PCR引物，是指两段与待扩增的目的DNA序列两侧翼片段互补的一段单链寡核苷酸序列。
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
重组质粒的酶切和PCR验证⼭东⼤学实验报告 2013年 11 ⽉26⽇⾄12⽉10⽇姓名系年级 2011级⽣物技术组别四科⽬分⼦实验同组者学号题⽬重组质粒的酶切和PCR验证⼀、【实验题⽬】重组质粒的酶切和PCR验证⼆、【实验⽬的】1.学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。
2.了解引物设计的基本要求。
3.复习凝胶电泳进⾏DNA分离纯化的⽅法。
4.复习DNA的酶切操作技术。
三、【实验试剂及器材】试剂：Hin d III 、酶切Buffer、Hin d Ⅲ、ddH2O、琼脂糖，TAE缓冲液、Loading Buffer、EB 染液、PCR buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物器材：枪和枪尖、1.5 ml的Ep管、电泳仪、PCR反应⼩管四、【实验原理】1.PCR技术原理PCR (po lymerase chain react ion) 中⽂译为聚合酶链式反应或体外扩增技术, 是1985 年美国Cetus 公司⼈类遗传部、加利福尼亚⼤学洛杉机分校和How ghes 医院等联合建⽴的⼀项⽣物技术. 其原理类似于天然DNA 的复制, 在模板DNA、引物和4 种dN TP 等存在的条件下,依赖于DNA 聚合酶(Taq 酶) 的酶促合成反应. 其具体反应分三步: 变性、退⽕、聚合. 以上三步为⼀个循环, 如图1. 每⼀循环的产物DNA ⼜可以作为下⼀个循环的模板, 数⼩时后, 介于两个引物之间的⽬的DNA 得到⼤量的复制, 经过25～ 30 次循环, DNA 数量可达2×106-7拷贝数。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，⽤酶进⾏互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极⼤程度的扩增。
在微量离⼼管中，加⼊与待扩增的DNA⽚段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
重组质粒的酶切鉴定与PCR实验一、【实验目的】1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；2、学习和掌握PCR反响的根本原理和操作技术，了解引物设计的根本要求。
二、【实验原理】1、PCR反响根本原理PCR技术的根本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；②模板DNA与引物的退火〔复性〕：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保存复制链〞，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反响原理图2、PCR反响体系与反响条件(1) 标准的PCR反响体系①PCR反响的缓冲液提供适宜的酸碱度与某些离子③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul〕⑥反响温度和循环次数变性温度和时间 95℃，30s退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内〕Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数：一般为25 ～ 30次。
循环数决定PCR扩增的产量。
模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。
但循环数并不是可以无限增加的。
一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期〞。
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。
在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。
筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。
本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。
一、抗生素平板筛选【实验原理】目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。
【操作步骤】1．制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板2．将100μl转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养12-16h 。
3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。
并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。
4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。
二、α互补筛选【实验原理】适用于含有半乳糖苷酶基因〔LacZ〕的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ 的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点。
当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端局部序列的宿主细胞后〔质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性〕，它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。
由α互补而产生的 Lac+细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷〔X-gal〕和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷〔IPTG〕存在下形成蓝色菌落。
当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。
因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
通过呈色反响即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。
通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。
【试剂】1．X-gal〔20mg／m l〕：将20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
