下载文档原格式
质粒DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1. 学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA 的方法；2. 学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3. 学习并掌握紫外吸收检测DNA 浓度和纯度的原理和方法；4. 学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1. PCR（多聚酶链式反应）在DNA 聚合酶催化下，可以DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCF一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95C，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35-70C, —般低于模板Tm值的5C 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2. 质粒DNA 的提取与制备（1）. 碱裂解法：染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）.离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B. 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C. 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3. 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A280V1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
