第三章草菇纤维素酶活性测定3.1 草菇菌丝培养3.1.1 培养基类型：A: 固体平板培养基：PDAB: 液体培养基：基础培养基+2%葡萄糖C: 种子培养基：基础培养基+1%甘油D: 诱导产酶培养基：基础培养基+1%诱导物基础培养基basal medium（g/L）：KH2PO4 1.0、K2HPO40.4、MgSO4·7H2O 0.5、CaCl2·2 H2O 0.013、Yeast extract 0.1、L-asparagine 1.5、NH4NO30.5、thiamine·HCl 0.0025 (sterilized by filtration and added after autoclaving of other medium components)、Tween 80 0.2% ( vol/vol )、Mineral solution 0.1%；终pH用2 M KOH调至6.2，高压灭菌15-20min。
配置：0.25g溶于100 ml水中，配成2.5 mg／ml的Thiamine·HCI溶液，过滤除菌。
每个液体诱导培养三角瓶加0.1ml。
配置：Mineral solution (g/L)：柠檬酸铁FeC6H5O7 4.8、ZnSO4·7H2O 2.64、MnCl2·4H2O 2.0、氯化钴CoCl2·6H2O 0.4、and CuSO4·5H2O 0.4。
配置100 ml。
3.1.2 诱导物类型：诱导物：a: 羧甲基纤维素钠(cabroxymethylcellulose) CMC 1%b: 纤维二糖cellobiose C.bi 2%c: α-乳糖α-lactose α-L 0.5%d: 微晶纤维素Microcrystalline cellulose M.C 1%e: 定量滤纸Filter paper F.P 1%3.1.3 草菇诱导产酶培养将PYD15、PYD21、H1521用薄的PDA固体平板培养。
32℃下培养7d。
接种到加葡萄糖的基础培养基中，32℃，150 rpm振荡培养7d。
取相同体积的菌丝接种到甘油培养基中，32℃，150 rpm振荡饥饿培养48h。
将相同容积的菌丝体接种到D诱导产酶培养基中。
32℃，150 rpm液体振荡培养48 h。
同时收集三个样品菌液和菌丝。
并将菌丝放入液氮中保存备用。
技术路线如下：药品配置：DNS试剂(GB)：称取3,5-二硝基水杨酸(10.0) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸) 2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
DNS试剂（Y.H.Percival Zhang）：称取DNS 10.6 g，NaOH 19.8 g完全溶于1,416 mL水中。
再依次加入酒石酸甲钠360 g、7.6 ml融化的苯酚(50℃)和8.3 g焦亚硫酸钠。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
磷酸缓冲液(GB)：0.1 mol/L pH6.0 (适用于中性纤维素酶)分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89 g，将其溶解在10 L去离子水中。
调节溶液的pH到6.0备用。
溶液在室温下可保存一个月。
磷酸缓冲液(实际配制)：A：0.2 mol/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠-十二水71.64g，定容至1000ml。
B：0.2 mol/L磷酸二氢钠：称取磷酸二氢钠-二水31.21g，定容至1000ml。
A液：12.3；B液：87.7。
配成0.2M的母液，加1倍水即为0.1M缓冲液。
葡萄糖标准贮备溶液制备（10 mg/ml）：称取于(103±2)℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g ,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL。
标准曲线的制备：分光光度计、恒温水浴、计时器、沸水浴、试管架、20 ml具塞试管、擦镜纸、1 ml移液枪、枪头葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1. 50、2. 00、2. 50、3. 00、3. 50、4. 00 mL于50 ml离心管中，定容至10 mL，摇匀。
将标准管同时置于沸水浴中，反应5 min。
取出，迅速冷却至室温，用水定容至20mL。
盖塞，混匀。
波长520 nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
3.2 酶活测定仪器：纱布、烧杯（过滤用）、液氮、研钵、研磨棒、离心管、滤纸透析袋的预处理：在200mL的2%碳酸氢钠和1mM的EDTA溶液中煮沸10min。
再用蒸馏水彻底洗涤后再放在1mM的EDTA溶液中煮沸10min。
最后蒸馏水煮沸冲洗后4℃蒸馏水中存放。
使用前用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。
透析到氯化钡溶液滴入烧杯中不形成白色浑浊。
将透析袋埋入聚乙二醇-10000 中浓缩酶液。
3.2.1 样品酶液制备3.2.1.1 胞外酶液的制备将草菇的液体诱导培养液，用纱布过滤。
分别保留滤液和菌丝体。
将滤液加入20%的硫酸铵在4℃下静置几小时，然后4℃10000 rpm离心20 min后收集上清（50ml离心管）。
再缓慢加入60%的硫酸铵（*0.6g硫酸铵）4℃盐析12 h，然后4℃、12000 rpm离心20 min。
将沉淀溶于7ml的缓冲液，透析袋4℃透析20h，到BlCl2检验无沉淀后，用PEG20000吸水后，得浓缩酶液，作为胞外酶液，用于测定胞外纤维素酶活。
3.2.1.2 胞内酶液的制备将过滤所得的菌丝体，用预冷的缓冲液冲洗几次后，滤纸吸干，称重，并记录。
准确称取1 g菌丝，液氮研磨后，转移至洁净离心管中，加5ml缓冲液，10,000 rpm离心2～3min，再将上清转移至新离心管，加PMSF至终浓度1～2mmol/L，所得溶液作为胞内酶液，用于测定胞内纤维素酶活。
3.2.2 草菇纤维素酶总活力测定3.2.2.1 滤纸酶活力法（FPU Assay）底物：Whatman No. 1 号滤纸（日本用东洋1号），1.0×6.0 cm (≌50 mg)。
方法：样品管：酶+ 底物+ DNS空白管：缓冲液+ DNS酶对照管：酶+ DNS底物对照管：底物+ DNS1．取4支20 ml 刻度具塞试管，标号。
2. 按对应加入卷滚的FP和1 ml缓冲液。
50℃水浴预热30min。
3. 准确加入待测酶液2 ml，混匀，盖塞。
4. 置于50℃水浴中，不时振荡，反应120 min，取出。
5. 立即加DNS试剂2 mL。
摇匀。
6. 同时放入沸水浴中，准确沸腾5 min，取出，冰水浴冷却。
7. 用去离子水定容至20 mL。
以空白管调零，520 nm 下测量吸光度值。
FA酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X= A×l/2×n×1/2式中：X —酶活力(CMCA-DNS)，u/g(或u/mL )；A —根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2 —换算成酶液1 mL；n —酶样的稀释倍数；1/2 —时间换算系数。
3.2.3 草菇纤维素酶家族的各组分酶活力测定3.2.3.1 内切葡聚糖酶endocellulase (EC 3.2.1.4)（EG或CX）活力测定底物：1%羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液方法：样品管：酶+ 底物+ DNS空白管：缓冲液+ DNS酶对照管：酶+ DNS底物对照管：底物+ DNS1．取4支20 ml 刻度具塞试管，标号。
2. 按对应加入1 ml底物CMC-Na溶液。
50℃水浴预热30min。
3. 准确加入待测酶液2 ml，混匀，盖塞。
4. 置于50℃水浴中，不时振荡，反应120 min，取出。
5. 立即加DNS试剂2 mL。
摇匀。
6. 同时放入沸水浴中，准确沸腾5 min，取出，冰水浴冷却。
7. 用去离子水定容至20 mL。
以空白管调零，520 nm 下测量吸光度值。
CMC酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X= A×l/2×n×1/2式中：X —酶活力(CMCA-DNS)，u/g(或u/mL )；A —根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2 —换算成酶液1 mL；n —酶样的稀释倍数；1/2 —时间换算系数。
3.2.3.2 外切葡聚糖酶exocellulase (EC 3.2.1.91)（CBH，EC或C1）活力测定底物：0.5%微晶纤维素(MC)溶液。
方法：样品管：酶+ 底物+ DNS空白管：缓冲液+ DNS酶对照管：酶+ DNS底物对照管：底物+ DNS1．取4支20 ml 刻度具塞试管，标号。
2. 按对应加入1 ml底物MC溶液。
50℃水浴预热30min。
3. 准确加入待测酶液2 ml，混匀，盖塞。
4. 置于50℃水浴中，不时振荡，反应120 min，取出。
5. 立即加DNS试剂2 mL。
摇匀。
6. 同时放入沸水浴中，准确沸腾5 min，取出，冰水浴冷却。
7. 用去离子水定容至20 mL。
以空白管调零，520 nm 下测量吸光度值。
EC酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X= A×l/2×n×1/2式中：X —酶活力(CBH)，u/g(或u/mL )；A —根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2 —换算成酶液1 mL；n —酶样的稀释倍数；1/2 —时间换算系数。
3.2.3.3 β-葡糖苷酶beta-glucosidase (EC 3.2.1.21)（CB，或纤维二糖酶Cellobiase）活力测定底物：纤维二糖（cellobiose）15 mM 。
pNPG (p-Nitrophenyl-β-D-Glucoside) 5 mM 。
方法：样品管：酶+ 底物+ DNS空白管：缓冲液+ DNS酶对照管：酶+ DNS底物对照管：底物+ DNS1．取4支20 ml 刻度具塞试管，标号。
2. 按对应加入1 ml底物CB溶液。
50℃水浴预热30min。
3. 准确加入待测酶液2 ml，混匀，盖塞。
4. 置于50℃水浴中，不时振荡，反应120 min，取出。
5. 立即加DNS试剂2 mL。
摇匀。
6. 同时放入沸水浴中，准确沸腾5 min，取出，冰水浴冷却。
7. 用去离子水定容至20 mL。
以空白管调零，520 nm 下测量吸光度值。
CB酶活力按下式计算：吸光度=样品管-酶对照管-底物对照管X= A×l/2×n×1/2式中：X —酶活力(CB)，u/g(或u/mL )；A —根据吸光度在标准曲线上计算出的还原糖量，mg；1/2 —换算成酶液1 mL；n —酶样的稀释倍数；1/2 —时间换算系数。
