毛霉的产蛋白酶发酵条件优化

实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）培养基组成：100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。

高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。

灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。

接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。

在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。

孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。

从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。

2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基）2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方：（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。

（第一组）（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。

（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。

2.2培养基灭菌高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。

冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。

2.3接种冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。

2.4蛋白酶活力测定根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。

（1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。

（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

一株产角蛋白酶菌株诱变筛选及发酵条件优化刘文龙∗㊀王兴吉㊀张志来㊀王克芬(山东隆科特酶制剂有限公司ꎬ山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室ꎬ山东临沂㊀２７６４００)㊀㊀摘㊀要:对实验室保藏产角蛋白酶菌Ａ２进行ＮＴＧ(亚硝基胍)诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高１４４％的突变菌株Ａ２－４５３ꎬ对该突变株的发酵条件进行优化ꎮ从产酶时间㊁添加外源碳㊁氮源来研究其酶活变化ꎬ经优化后得到最佳的发酵条件是:发酵６０ｈ时酶活单位最高ꎻ最佳外源碳源是葡萄糖ꎬ最佳外源氮源是豆饼粉ꎮ经最优条件进行发酵ꎬ酶活单位提高４２％ꎮ关键词:角蛋白酶ꎻ亚硝基胍ꎻ诱变ꎻ酶活ꎻ碳源ꎻ氮源ＭｕｔａｔｉｏｎＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＣｏｎｄｉｔｉｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆａＫｅｒａｔｉｎａｓｅ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒａｉｎＬｉｕＷｅｎｌｏｎｇ∗㊀ＷａｎｇＸｉｎｇｊｉ㊀ＺｈａｎｇＺｈｉｌａｉ㊀ＷａｎｇＫｅｆｅｎ(ＳｈａｎｄｏｎｇＬｏｎｇＫｅｔｅＥｎｚｙｍｅＣｏ.ＬｔｄꎬＬｉｎｙｉꎬ２７６４００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＡｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎＡ２－４５３ｗｉｔｈ１４４％ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｂｙＮＴＧｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡ２ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ.ＴｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｆｒｏｍｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅꎬｅｘｏｇｅｎｏｕｓｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒＡ２－４５３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｆｏｕｎｄａｔ６０ｈꎬｔｈｅｂｅｓｔｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉ￣ｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙｗｅｒｅｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｕｎｉｔｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ４２％ｂｙｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ.ＫｅｙＷｏｒｄｓ:ＫｅｒａｔｉｎａｓｅꎻＮＴＧꎬＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓꎻＥｎｚｙｍｅＡｃｔｉｖｉｔｙꎻＣａｒｂｏｎＳｏｕｒｃｅꎻＮｉｔｒｏｇｅｎＳｏｕｒｃｅ基金项目:国家重点研发计划(２０１７ＹＦＢ０３０８４００－０１－０５)作者简介:刘文龙(１９８２－㊀)ꎬ男ꎬ工程师ꎬ硕士ꎬ研究方向为酶制剂生产与开发ꎮ㊀㊀羽毛废弃物是养殖业中一种重要副产物ꎬ其富含高浓度的蛋白质ꎮ近年来ꎬ我国养殖业和屠宰业蓬勃发展ꎬ期间产生了大量的副产物ꎬ而这些废弃物不仅造成资源的巨大浪费ꎬ而且污染环境ꎮ羽毛废弃物中各类氨基酸齐全ꎬ含必需氨基酸ꎬ特别是含硫氨基酸含量特别高ꎬ因此对这类资源加以充分利用将是蛋白饲料非常重要的补充[１]ꎮ角蛋白被定义为是纤维蛋白ꎬ又被称作硬皮蛋白ꎬ是脊椎动物表皮或表皮附属物的主要成分ꎬ如表皮残留物㊁鬃毛㊁羽毛㊁毛发㊁指甲㊁喙㊁角㊁蹄㊁羊毛等ꎮ这种蛋白对于一些常见的蛋白酶如木瓜蛋白酶㊁胰蛋白酶和胃蛋白酶等㊁以及化学试剂㊁机械压力等都具有较高的抗性[２－４]ꎮ蛋白质中的二硫键是决定角蛋白抗性和稳定性的关键因素[５]ꎮ角蛋白酶是唯一可以降解这些复杂结构蛋白的蛋白酶ꎬ因此角蛋白酶以环保友好方式进行生物转化的优势ꎬ在家禽㊁皮革工业㊁氨基酸㊁多肽以及可溶性蛋白等含角蛋白废物利用中具有重要的应用价值ꎮ角蛋白的降解已经广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[６]ꎮ目前已经商业化生产的角蛋白酶有Ｖｅｒ￣ｓａｚｙｍｅ㊁Ｖａｌｋｅｒａｓｅ㊁Ｐｒｉｏｎｚｙｍｅ和ＰＵＲＥ１００ꎬ这４种商品酶都是基于ＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＰＷＤ－１(ＫｅｒＡ)菌种来源蛋白基础上发展而来的[７]ꎮ另外ꎬ在其他菌种ꎬ如假单胞菌属㊁金黄杆菌㊁溶杆菌㊁涅斯捷连科氏菌㊁考克氏菌㊁微杆菌㊁寡养单胞菌㊁沙雷氏菌㊁热菌中也有发现产角蛋白酶[４ꎬ８]ꎮ也有报道称在嗜热菌和极端菌种如ꎬ闪烁杆菌属[９]㊁梭菌属[１０]㊁嗜热菌属[１１]ꎬ也有角蛋白酶产生ꎮ一些较有潜力的产角蛋白酶菌种有来源于链霉菌的放线菌和嗜热链球菌也已经被发现并报道[１２－１６]ꎮ尽管角蛋白酶具有巨大的生物技术应用潜力ꎬ但是产量低一直是限制角蛋白酶商业化的一大障碍ꎮ提高角蛋白酶的催化效率㊁表达量以及热稳定性对于其应用于工业化生产具有相当重要的影响[１７]ꎮ本文以一株实验室保存的高产角蛋白酶菌种为出发菌株进行ＮＴＧ诱变ꎬ然后从中筛选出酶活单位提高的菌株突变体ꎬ并对其进行发酵条件优化以最大程度的激发其产角蛋白酶的能力ꎬ从而为其应用于工业化大规模生产提供基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀菌㊀种Ａ２菌是作者所在实验室从沂水某养殖场处采取土样获得的一株产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌种ꎮ１.１.２㊀试㊀剂自制羽毛粉:新鲜的鸡羽毛充分洗干净ꎬ然后沸水煮２－３ｈꎬ然后用太阳晒干ꎮ晒干的羽毛粉碎得到的粉末用于做培养基成分ꎻ天蓝角蛋白㊁Ｔｒｉｓ㊁蛋白胨㊁酵母粉均购自上海生工生物工程有限公司ꎻ亚硝基胍(ＮＴＧ)ꎻ其他试剂均为分析纯ꎮ１.１.３㊀培养基种子培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠１０ꎬ酵母粉５ꎬ蛋白胨１０ꎬｐＨ７.０ꎮ平板筛选培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠１０ꎬ酵母粉５ꎬ蛋白胨１０ꎬ羽毛粉１０ꎬ琼脂粉２０ꎬｐＨ７.０ꎮ发酵基础培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠０.５ꎬ六水氯化镁０.１ꎬ氯化钙０.０６ꎬ磷酸氢二钾１.４㊁磷酸二氢钾０.７㊁羽毛粉１０ꎬｐＨ７.０ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀菌种ＮＴＧ诱变将产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌株划线活化ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ挑取单克隆接种到种子培养基中ꎬ３７ħ培养至对数期ꎬ然后收集菌体ꎬ８０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎꎬ用生理盐水洗涤菌体沉淀２次ꎬ最后用生理盐水重悬菌体至浓度为１０６－１０８ＣＦＵ/ｍＬꎬ并加入ＮＴＧ母液ꎬ使得最终浓度为２５０μｇ/ｍＬꎮ然后于３７ħ分别培养１０－６０ｍｉｎꎬ每隔１０ｍｉｎ取样一次ꎬ经适当稀释之后ꎬ取１００μＬ涂布于筛选平板上ꎬ计算致死率ꎮ致死率计算公式如下:致死率＝(Ａ－Ｂ)/Ｂˑ１００％式中Ａ代表经ＮＴＧ处理过平板上生长菌落数平均值ꎻＢ代表未经ＮＴＧ处理过菌涂布平板生长的菌落数平均值ꎮ１.２.２㊀诱变菌筛选初筛:对致死率在７０％－８０％的诱变菌种库进行筛选ꎮ采用平板筛选与９６孔板筛选结合的方式进行ꎮ将诱变好的菌种经特定稀释涂布在筛选平板上ꎬ３７ħ培养２４ｈꎮ根据透明圈大小及菌落形态变化挑取单克隆于装有ＬＢ液体培养基的９６孔板中进行活化培养ꎬ３７ħ培养２４ｈꎮ按照２％接种量将长好的种子液转接到含有发酵培养基的９６孔板中ꎬ３７ħ发酵培养７２ｈꎮ将发酵培养液进行离心处理ꎬ取上清ꎬ采用酶标仪进行酶活测定ꎬ９６孔板酶活测定方法参照文献[１８]ꎮ复筛:将９６孔板中筛选的酶活提高幅度比较明显的突变株ꎬ转接到摇瓶进行摇瓶扩大复筛验证ꎬ摇瓶发酵条件:装液量５０ｍＬ/５００ｍＬꎬ３７ħꎬ２４０ｒｐｍꎬ培养７２ｈ后进行酶活测定ꎮ将筛选出来的高产菌传代５次ꎬ并测定角蛋白酶活力ꎬ以验证该菌种的传代稳定性ꎮ１.２.３㊀酶活测定酶活测定方法及酶活单位计算参考文献[１９]１.２.４㊀发酵条件优化１.２.４.１㊀发酵时间对产酶影响发酵条件为初始发酵条件ꎬ培养基采用发酵基础培养基ꎬ３７ħ分别培养１２ｈ㊁２４ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁６０ｈ㊁７２ｈꎬ特定时间点取发酵液进行酶活检测ꎬ研究发酵时间对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ１.２.４.２㊀外加碳源发酵条件采用１.２.４.１最佳条件ꎬ外源添加１％的葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁淀粉㊁糊精ꎬ研究外源添加不同碳源对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ１.２.４.３㊀外加氮源发酵条件采用１.２.４.２最优条件ꎬ外源添加１％的蛋白胨㊁酵母粉㊁豆饼粉㊁牛肉膏㊁硫酸铵ꎬ研究不同氮源对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ２㊀结果与讨论２.１㊀Ａ２菌种ＮＴＧ诱变及筛选根据ＮＴＧ作用时间与致死率关系ꎬ选择致死率在７０％－８０％之间的诱变菌体库进行筛选ꎬ致死率满足７０％－８０％之间范围内其向正突变的几率较大[２０]ꎬ因此将诱变条件定为ＮＴＧ浓度为２５０μｇ/ｍＬꎬ诱变时间１０ｍｉｎꎮ将诱变后菌种经适当稀释后涂布在筛选平板上ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ根据透明圈的大小及菌落形态变化选择突变体进行筛选ꎮ通过９６孔板筛选ꎬ共筛选３５８７株突变体ꎬ酶活提高幅度大于５０％以上的突变株占３ɢꎬ其中酶活提高幅度最高的突变株为Ａ２－４５３酶活单位为３２４Ｕ/ｍＬꎬ比对照提高了１４４％ꎮ图１㊀ＮＴＧ处理时间与菌种致死率关系表１㊀Ａ２－４５３传代稳定性验证传代数角蛋白酶活力１(Ｕ/ｍＬ)角蛋白酶活力２(Ｕ/ｍＬ)角蛋白酶活力３(Ｕ/ｍＬ)平均值(Ｕ/ｍＬ)１３１７３２８３０９３１８２３１１３３８３０４３１８３３０１３３２３２７３２０４３２５３３７３１４３２５５３２８３０５３１３３１５从表中可以看出ꎬ高产菌Ａ２－４５３产角蛋白酶活力稳定ꎬ传代５次后ꎬ酶活与对照相比相差不大ꎮ２.２㊀发酵时间对Ａ２－４５３菌种产酶的影响图２㊀发酵周期对产酶的影响分别将Ａ２和Ａ２－４５３两个菌株活化后转接到发酵培养基中ꎬ每隔１２ｈ取样检测酶活单位数变化ꎮ摇瓶发酵液酶活检测发现ꎬＡ２－４５３菌种当发酵到６０ｈ时ꎬ酶活单位为３１６Ｕ/ｍＬꎬ发酵至７２ｈ时ꎬ酶活单位仅为３２０Ｕ/ｍＬꎬ与发酵６０ｈ相比酶活相差不大ꎮ怀疑是培养基中营养成分耗尽ꎬ代谢产物积累过多对细胞产酶造成负面影响ꎬ亦或是因为代谢产物对细胞产生反馈抑制对细胞产酶进行负调控ꎬ从而不再产酶ꎮ因此将最优发酵时间定为６０ｈꎮ２.３㊀外加不同碳源对Ａ２－４５３产酶的影响以发酵周期为６０ｈ作为发酵终点ꎬ研究外源添加不同碳源对Ａ２－４５３菌种产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ外源添加１％的葡萄糖对Ａ２－４５３产酶具有促进作用ꎬ比基础培养基提高了３２％左右ꎮ而其他碳源对其效果影响不明显ꎬ甚至有降低产酶的现象ꎮ葡萄糖作为速效碳源ꎬ可以促进菌体细胞的大量繁殖ꎬ从而提高整体产酶水平ꎮ而其他碳源需要先进行分解才能再被利用ꎬ大大降低了产酶的速率ꎮ图３㊀不同外源添加碳源对突变体产酶影响２.４㊀外加不同氮源对Ａ２－４５３产酶的影响以２.３最优发酵条件为基础ꎬ研究外源添加１％的不同氮源对Ａ２－４５３产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ豆饼粉对于产酶具有促进作用ꎬ比对照组酶活提高了７％左右ꎬ其他几种氮源效果不是很明显ꎬ而蛋白胨㊁酵母粉反而使得产酶降低ꎬ检测发酵液ｐＨꎬ发现比对照组高ꎬ因此怀疑可能是因为原料消耗之后ꎬ体系中ｐＨ升高导致不适宜产酶ꎮ图４㊀不同外源添加氮源对突变体产酶影响结合以上几种条件ꎬ以发酵培养基配方(ｇ/Ｌ):氯化钠０.５ꎬ六水氯化镁０.１ꎬ氯化钙０.０６ꎬ磷酸氢二钾１.４㊁磷酸二氢钾０.７㊁羽毛粉１０ꎬ葡萄糖１０ꎬ豆饼粉１０ꎬｐＨ７.０进行发酵验证ꎬ发酵周期为６０ｈꎬ最终酶活单位能够达到４４８Ｕ/ｍＬꎬ比未优化之前提高了４２％ꎮ３㊀结㊀语ＮＴＧ是目前最有效ꎬ也是应用最广泛的化学诱变剂之一[２１]ꎮ对本实验室筛选的一株产角蛋白酶菌株Ａ２作为出发菌进行ＮＴＧ诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高１４４％的突变株ꎮ诱变之后的菌株表现出生长较快的生理变化ꎬ产酶大幅提高ꎮ根据菌种的特性ꎬ针对性的对其产酶时间㊁碳㊁氮源利用情况进行了发酵优化ꎮ葡萄糖㊁豆饼粉对其产酶具有较大的促进作用ꎬ根据最优条件进行发酵验证ꎬ整个酶活单位提高了４２％ꎮ其他一些发酵因素的优化可能会进一步的提高该菌的产酶能力ꎮ角蛋白酶现已广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[６]ꎮ但是现存的商业化用酶产量低㊁催化效率低㊁稳定性差等是限制其广泛应用的主要因素ꎮ因此ꎬ对现有产酶菌种进行优化及选育㊁对蛋白进行改造以及寻找可替代的菌种来生产角蛋白酶是现在的研究热点ꎮ本文通过对Ａ２菌进行诱变ꎬ得到一株酶活单位提高１４４％的突变株ꎬ并在此基础上进行发酵优化ꎬ酶活单位又提高了４２％ꎬ为该酶进一步的工业化应用研究提供了基础ꎮ参考文献[１]于晓鹏ꎬ赵新强.角蛋白酶研究进展[Ｊ].中国果菜ꎬ２０１５ꎬ３５(２):７７－８１.[２]ＣＯＵＬＯＭＢＥＰＡꎬＯＭＡＲＹＭＢ. Ｈａｒｄ ａｎｄ ｓｏｆｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｄｅfiｎｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅfiｌａｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１４:１１０－１２２.[３]ＫＯＭＩＬＬＯＷＩＣＺＫＴꎬＢＯＨＡＣＺＪ.Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎｗａｓｔｅ:ｔｈｅｏｒｙａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ[Ｊ].ＷａｓｔｅＭａｎａｇｅｍｅｎｔꎬ２０１１ꎬ３１:１６８９－１７０１.[４]ＤＡＲＯＩＴＤＪꎬＮＤＥＬＬＩＡ.Ａｃｕｒｒｅｎｔａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.２０１４ꎬ３４ꎬ３７２－３８４.[５]ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＫꎬＹＡＭＡＭＯＴＯＨꎬＹＯＫＯＴＥＹꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｍａｌｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｆｏｗｌｆｅａｔｈｅｒｋｅｒａｔｉｎ[Ｊ].Ｂｉｏｓｃｉ￣ｅｎｃｅꎬＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００４ꎬ６８:１８７５－１７８１.[６]ＢＲＡＮＤＥＬＬＩＡꎬＤＡＲＯＩＴＤＪꎬＲＩＦＦＥＬＡ.Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ８５:１７３５－１７５０.[７]ＧＵＰＴＡＲꎬＳＡＲＭＡＲꎬＢＥＧＱＫ.Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ:ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｔｅａｓｅｓｆｏｒｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ３３:２１６－２２８.[８]ＧＵＰＴＡＲꎬＲＡＭＮＡＮＩＰ.Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ:ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ７０:２１－３３. [９]ＦＲＩＥＤＲＩＣＨＡＢꎬＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮＧ.Ｋｅｒａｔｉｎｄｅｇｒａｄａ￣ｔｉｏｎｂｙＦｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓꎬａｎｏｖｅｌｔｈｅｒ￣ｍｏｐｈｉｌｉｃａｎａｅｒｏｂｉｃｓｐｅｃｉｅｓｏｆｔｈｅｏｒｄｅｒｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ６２:２８７５－２８８２.[１０]ＩＯＮＡＴＡＥꎬＣＡＮＧＡＮＥＬＬＡＦꎬＢＩＡＮＣＯＮＩＧꎬＢＥＮ￣ＮＯＹꎬＳＡＫＡＭＯＴＯＭꎬＣＡＰＡＳＳＯＡꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓｂｖ.ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓｂｖ.ｎｏｖ.ａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｏｒｇａｎｉｓｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｌｆａ￣ｔａｒｉｃｍｕｄｓ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００８ꎬ１６３:１０５－１１２.[１１]ＲＩＥＳＳＥＮＳꎬＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮＧ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｒｍｏ￣ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓｓｐ.ｎｏｖꎬａｎｏｖｅｌｔｈｅｒｍｏｐｈｉ￣ｌｉｃꎬａｎａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｉｔｈｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ.２００１ꎬ５ꎬ３９９－４０８.[１２]ＮＯＶＡＬＪＪꎬＮＩＣＫＥＲＳＯＮＷＪ.ＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｋｅｒａｔｉｎｂｙＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ１９５９ꎬ７７:２５１－２６３.[１３]ＳＺＡＢＯＩꎬＢＥＮＥＤＥＫＡꎬＳＺＡＢＯＩＭꎬｅｔａｌ.ＦｅａｔｈｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｗｉｔｈａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎ￣ｏｆａｃｉｅｎｓｓｔｒａｉｎ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ１６:２５３－２５５.[１４]ＳＹＥＤＤＧꎬＬＥＥＪＣꎬＬＩＷＪꎬｅｔａｌ.ＡｇａｓａｒＤ.Ｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎꎬｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｕｌｂａｒｇｅｎｓｉｓ[Ｊ].ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１００:１８６８－１８７１.[１５]ＩＧＮＴＯＶＡＺꎬＧＯＵＳＴＥＲＯＶＡＡꎬＳＰＡＳＳＯＶＧꎬｅｔａｌ.Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍａｗｏｏｌｄｅｇｒａｄｉｎｇｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｃｔｉｎｏｍｙ￣ｃｅｔｅｓｔｒａｉｎＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｃａｎｄｉｄｕｓ[Ｊ].ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ４５:２１７－２２２.[１６]ＨＡＢＢＥＣＨＥＡꎬＳＡＯＵＤＩＢꎬＪＡＯＵＡＤＩＢꎬｅｔａｌ.Ｐｕｒｉfiｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｄｅｔｅｒ￣ｇｅｎｔ－ｓｔａｂｌｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍａｎｅｗｌｙｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｃｔｉｎｏ￣ｍｙｃｅｔｅꎬＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｋｅｒａｔｉｎｉｌｙｔｉｃａｓｔｒａｉｎＣｐｔ２９ｉｓｏｌａ￣ｔｅｄｆｒｏｍｐｏｕｌｔｒｙｃｏｍｐｏｓｔ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１４ꎬ１１７:４１３－４２１.[１７]ＦｅｎｇＺꎬＪｕａｎＺꎬＧｕｏｃｈｅｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｐｒｏｖｅｄｃａｔａｌｙｔ￣ｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙꎬｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙꎬａｎｔｉ－ｓａｌｔａｎｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅＫｅｒＳＭＤｂｙｐａｒｔｉａｌｌｙｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｏｆＰＰＣｄｏｍａｉｎ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２７９５３[１８]高静雷.定向进化技术提高枯草芽孢杆菌角蛋白酶活性研究[Ｄ].无锡:江南大学ꎬ２０１４.㊀[１９]ＣｈｅｎｇｇａｎｇＣꎬＢｉｎｇｇａｎＬꎬＸｉａｏｄｏｎｇＺ.ＫｅｒａｔｉｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｋｅｒａｔｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙａｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ[Ｊ].ＪＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖＳｃｉꎬ２００８ꎬ９(１):６０－６７[２０]曲波.产酸性蛋白酶菌株的诱变育种研究[Ｊ].食品研究与开发ꎬ２０１５ꎬ３６(２０):１６９－１７３[２１]王付转ꎬ梁秋霞ꎬ李宗伟等.诱变和筛选方法在微生物育种中的应用[Ｊ].洛阳师范学院学报ꎬ２００２ꎬ２:９５－９９.。

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究角蛋白酶是一种重要的酶类蛋白，在食品、医药、皮革等领域具有广泛的应用价值。

为了提高角蛋白酶的产量和活性，角蛋白酶工程菌株的酶条件需要进行优化研究。

本文将从菌株选择、培养基组成、培养条件等方面探讨角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究。

首先，选择适合的菌株是进行角蛋白酶产酶条件优化的基础。

目前常用的工程菌株有大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。

这些菌株具有较高的生长速度和较好的表达能力，但也存在着一些问题，如蛋白质形成包涵体、酶活性低等。

因此，选择适合目标酶表达和活性的菌株是十分重要的。

其次，培养基组成对角蛋白酶产酶条件的优化也起到了至关重要的作用。

培养基的主要组成包括碳源、氮源、微量元素等。

在选择碳源方面，常用的有葡萄糖、麦芽糖等，但不同碳源对菌株的生长和酶的产量有不同的影响，因此需要进行筛选和优化。

氮源的选择包括无机氮源和有机氮源，如氨基酸和蛋白质等。

微量元素的添加也对角蛋白酶的产量和活性有影响，如金属离子（如镁离子、锰离子）和维生素等。

因此，合理选择培养基组成是进行角蛋白酶产酶条件优化的关键。

最后，培养条件的优化也对角蛋白酶的产量和活性具有重要影响。

培养条件包括温度、pH值、发酵时间等方面。

温度的选择主要取决于菌株的最适生长温度，一般在菌株的最适生长温度附近进行发酵。

pH值的选择也对角蛋白酶的产量和活性有影响，一般在菌株最适生长pH值附近进行发酵。

此外，发酵时间的选择也需要根据菌株的生长速度和目标酶的表达和积累情况来进行调整。

综上所述，角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究包括菌株选择、培养基组成和培养条件的优化。

通过合理选择菌株、优化培养基组成和调整培养条件，可以提高角蛋白酶的产量和活性，为其在食品、医药、皮革等领域的应用提供技术支持。

当然，由于研究深度有限，仍然需要进一步探索和优化。

蛋白酶辅助法腐乳发酵工艺优化和理化性质分析腐乳是我国具有民族特色的传统大豆发酵制品，因其味道鲜美，具有抗氧化和降血压等保健功能，深受消费者欢迎腐乳的发酵过程分为前发酵和后发酵［4］,其中主要发生了生物化学和物理化学变化［5］。

腐乳的前发酵是培养菌系和积累酶系的过程，一般为36~48h；后发酵是酶系作用于腐乳毛坯的过程，其毛坯中毛霉分泌蛋白酶降解大豆蛋白，从而破坏凝胶结构使其质地软化并产生大量游离氨基酸等。

该过程需要较长的后熟时间，一般为3~6个月，因此制约了其在我国的工业化生产［6-7］。

近年来，针对缩短腐乳生产周期的研究较多。

其中，在后发酵阶段直接加入外源蛋白酶是一种较便捷的方法。

此外，腐乳后发酵温度也在很大程度上影响腐乳的发酵周期，而如今对酶法辅助腐乳发酵中温度影响的研究较少。

本研究通过控制酶促腐乳后发酵的温度，对腐乳发酵过程中理化性质变化进行研究，了解温度对蛋白酶辅助腐乳发酵的影响，旨在为优化酶促腐乳工艺提供一定的理论和应用依据。

1材料与方法L1材料与仪器盐卤型豆腐、食盐、白酒（均为食品级），市售；雅致放射性毛霉菌粉，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶（活性单位：1X105U,均为食品级），沧州夏盛酶生物技术有限公司；冰乙酸、无水乙酸钠、乙酰丙酮、硫酸镀、37%甲醛，阿拉丁工业公司。

恒温培养箱，上海慧泰仪器制造有限公司；冷冻干燥机，美国Labconco公司；糖度仪，ATAGO（爱拓）中国分公司；酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；高速离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；组织研磨仪，上海净信科技。

1.2实验方法1.2.1酶促腐乳的生物酿制将盐卤型老豆腐切成约2cm×2. 5cm×2. 5cm的小块，喷洒雅致放射毛霉菌悬液至终浓度约为lX107CFU∕mL,在25七下前发酵3d后搓毛；毛坯称重后，按质量比加入10%的食盐腌制22h,制得咸坯；咸坯称重后，均匀分成11份，根据表 1 加入不同外源蛋白酶处理并装瓶，其总添加量为腐乳总蛋白的4%（质量分数）；最后加入10%食用乙醇至完全浸泡咸坯后加盖密封,分别在20、30、37、5（TC下后发酵20d[8]°表1添加外源蛋白酶样品分组TablelGroupingofsampleswithexogenousprotease1.2.2腐乳的样品采集及预处理样品采集：每个酶促腐乳样品的前发酵全部天数以及后发酵1、2、3、5、10、20d中取样用于理化特性分析。

产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中，属于水解酶类，约占世界酶制剂销量的60%（马俊阳等，2014）。

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。