脂肪酶产生菌发酵条件的优化

脂肪酶生产工艺
脂肪酶是一种重要的酶制剂，广泛应用于食品加工、制药、制糖、造纸、皮革、饲料等各个领域。

脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养、酶液提取与纯化等几个关键步骤。

首先，菌种筛选是脂肪酶生产的起始步骤。

传统的方法是从环境中筛选出产酶能力强、耐受性好的菌株，如大肠杆菌、放线菌等。

随着现代生物技术的进步，可通过基因工程手段改造菌株，使其具有更高的酶活性和稳定性。

接下来是发酵培养，这是脂肪酶生产的核心环节。

首先，将选定的菌株进行预培养，使其进入活跃期。

然后将菌种接种到含有适宜营养物质的培养基中，并调节好温度、pH值、溶解氧和搅拌速度等发酵条件，促使菌株大量繁殖并产生酶。

在发酵过程中，可通过测定培养基中脂肪酶活性的变化，调节发酵条件以提高酶产量。

酶液提取是将发酵液中的酶分离和提取出来的步骤。

首先，通过简单的物理方法如离心、滤过等将固体颗粒去除。

然后，采用适当的预处理方法进行酶的初步分离，如酸碱沉淀、盐析、溶剂抽提等。

最后，通过纯化技术如层析、凝胶过滤、电泳等进一步提纯酶液，去除掉杂质和其他蛋白质。

脂肪酶生产工艺中的关键点在于发酵培养和酶液提取。

发酵培养涉及到菌株的选取和培养条件的优化，需要通过不断试验和改进，提高酶产量和酶活性。

酶液提取则需要采用合适的分离和纯化技术，以达到酶的高效提取和纯度的要求。

总的来说，脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养和酶液提取等几个关键步骤。

这些步骤需要通过科学合理的操作和技术手段，不断优化提高，才能够实现高效、稳定地生产脂肪酶。

脂肪酶发酵条件优化第一篇：脂肪酶发酵条件优化脂肪酶产生菌的发酵条件优化即其脂肪酶的分离纯化一、实验仪器及药品仪器：显微镜、血球计数板、旋转式恒温摇床、电子天平、pH计、生化培养箱、低速离心机、高速离心机、离子交换柱、透析袋、磁力搅拌器药品：NaCl、琼脂粉、蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4·2H2O、酵母浸膏、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、蔗糖、橄榄油、聚乙烯醇(PVA)、NaOH、邻苯二甲酸氢钾(C8H5O4K)、硫酸铵、95%乙醇、氯化钡、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、DEAE-Sepharose FF、浓HCl、酚酞二、培养基及试剂的配制培养基的配制：斜面培养基(g/l)：琼脂20.0、蛋白胨5.0、NaCl 3.0、K2HPO4 1.0、酵母浸膏5.0。

种子培养基(g/l)：蛋白胨5.0、蔗糖5.0、NaCl 3.0、K2HPO4 2.0、酵母浸膏 5.0。

发酵培养基(g/l)：蛋白胨20.0、蔗糖 5.0、橄榄油 5.0、(NH4)2SO4 1.0、MgSO4·7H2O 1.0、K2HPO4 1.0。

加蒸馏水 1000 ml，加热溶解，分装后121℃灭菌 30min。

试剂的配制：①、2%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取20g聚乙烯醇（PVA）放入800mL蒸馏水中，边搅拌边加热，使其完全溶解，自然冷却后加蒸馏水定容至1000ml，然后用双层纱布过滤，保存滤液备用。

②、4%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取40g聚乙烯醇（PVA），其他同上。

③、橄榄油乳化液：取橄榄油与聚乙烯醇（4%）按1:3比例混合，用高速组织搅拌机搅拌乳化3-5min，4℃保存备用。

④、0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液：甲液：称取KH2PO417.01g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。

乙液：称取Na2HPO4·2H2O 44.77g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。

尖孢镰刀菌产碱性低温脂肪酶发酵条件的优化张建国;王蕾【摘要】The effect of single factor on the flask incubation of Fusarium oxysporium NC03 was investigat- ed. The optimum medium for the yield of lipase was that containing peptone 5 g/L, NaH2 PO4 3g/L, olive oil 250 mL/L, emulsifier Tween 80 25mL/L. The strain was cultured under the condition of 30 ℃ for 84 h. The enzyme activity under the optimal condition was 3.0 times of that under the condition before optimized, and reached to 11.32 U/mL%通过实验对尖孢镰刀菌NC03摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行了优化,得出最佳产酶培养基组成配方为：蛋白胨5 g/L,酵母膏6 g/L,NaH2PO43 g/L;橄榄油250 mL/L,吐温80 25 mL/L。

最优发酵条件为250 mL的摇瓶装液量50 mL,培养温度30℃,发酵时间84 h。

经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到11.32 U/mL,较优化前提高了3.0倍。

【期刊名称】《长治学院学报》【年(卷),期】2012(029)005【总页数】7页(P1-7)【关键词】脂肪酶;培养基;发酵;优化【作者】张建国;王蕾【作者单位】长治学院生物科学与技术系,山西长治046000;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q55脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、植物种子及微生物中。

[收稿日期] 2011-05-16;2011-08-12修回[基金项目] 贵州省科技攻关项目 生物酶法生产生物柴油 [黔科合NY(2006)3031];贵州省科技创新人才团队建设项目 贵州省特色动植物资源保护与可持续利用科技创新人才团队 [黔科合人才团队(2009)4007][作者简介] 洪 鲲(1973-),男,讲师,硕士,从事生物化学研究。

E -mail:ken _hong2004@yah *通讯作者:乙 引(1967-),男,教授,博士,硕士生导师,从事植物生理与生物化学研究。

E -mail:yiyin@gz [文章编号]1001-3601(2011)09-0561-0103-03产脂肪酶细菌的筛选及发酵培养条件的优化洪鲲,张豪,乙引*,张习敏(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳550001)[摘 要]为给扩大脂肪酶的生产源提供基础资料,对富含油脂的67份土壤样品进行了产脂肪酶细菌的筛选及目标菌株发酵培养条件的优化试验。

结果表明:筛选分离出15株脂肪酶产生菌,经过对其发酵液脂肪酶活力的比较,菌株D9-1发酵液脂肪酶活力最高。

目标菌株D9-1产脂肪酶最佳培养条件:最适氮源为1%蛋白胨,最适碳源为1%橄榄油,表面活性剂为1%OP -10,最适发酵温度30 ,摇床转速为170r/m in,发酵培养时间为24h 。

[关键词]脂肪酶;细菌;筛选;发酵;培养条件[中图分类号]S182;S154[文献标识码]AScreening for Lipase -produ cin g Bacterial Strains andOptimization of the Fermentation Con ditionsH ONG Kun,ZH A NG H ao,YI Yin *,ZH ANG X-i min(School of Lif e Sciences ,Guizhou Normal U niversity ,Guiy ang,Guizhou 550001,China)Abstract:15lipase -pr oducing bacterial strains w ere isolated fr om 27soil samples rich in oil and D9-1w as selected as the mo st potential lipase -producing strain through comparing the lipase activity in fermentation broths o f these strains.T he results show ed that the o ptimum nitrog en source is peptone,optimum carbon source is 1%o liv e oil,optimum surfactant is 1%OP -10,optimum temperature is 30 ,and w hen the rotating speed w as 170r/min,the lipase activity in ferm entation broth r eached the highest after 24h.Key words:lipase;bacter ium;screening;ferm entation;fermentation conditio ns 脂肪酶广泛存在于动植物、细菌、真菌和霉菌体内[1-2],具有催化三脂酰甘油及其他一些水不溶性脂类的转酯、水解、酯化、醇解及酯类逆向合成的特性。

华中科技大学硕士学位论文脂肪酶高产菌株筛选、产酶条件优化及脂肪酶大量纯化研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：刘曼西;闫云君20050323摘要从武汉襄樊十堰等地采集含油污土样208份经平板粗筛摇瓶复筛得到酶活力在5.0U/mL以上菌株6株其中Aspergillus sp.F044酶活最高达到11.18U/mL 应用逐因子试验Seriatim-Factorial Experiment Plackett-Burrman反应面法Response Surface Methodology, RSM和单因子试验Monofactorial Experiment分析对曲霉Aspergillus sp.F044产脂肪酶发酵条件进行了快速优化首先应用逐因子试验确定Aspergillus sp.F044产脂肪酶最适碳源和最适氮源分别为麦芽糖和牛肉膏在此基础上通过Plackett-Burrman设计对八个影响其产酶相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的橄榄油乳化液浓度牛肉膏浓度硫酸镁浓度三个因子然后拟合三个因子关于发酵液酶活力的一阶线性模型再沿着一阶模型指定的路径进行最速上升试验在上升最高点处由中心组合试验和反应面法确定其最优培养基组成最后通过单因子试验确定最适发酵温度和最适摇床转速得到优化培养条件为麦芽糖1.5硫酸铵7‰磷酸氢二钾1‰牛肉膏1.25硫酸镁2.11‰橄榄油乳化液1.41自然pH250r/min和30培养72h后酶活达到32.15U/mL与初始11.18U/mL相比酶活提高了2.88倍在此基础上研究了Aspergillus sp.F044脂肪酶在双水相Aqueous Two PhaseSystem ATPS中分配平衡选择影响较大的五个参数如PEG平均相对分子质量PEG浓度磷酸盐浓度pH和NaCl浓度研究其对分配平衡的影响试验得到最优纯化条件为:PEG相对分子质量为600浓度17.5w/w,磷酸盐浓度12.5w/w , NaCl浓度0.5w/w pH7.0在此条件下脂肪酶分配系数达到7.1纯化系数达到4.7回收率达到0.91微生物脂肪酶在工业应用中具有重要经济价值目前我国在这方面尚处于起步阶段本课题目的是在酶法生产生物柴油技术工艺以及脂肪酶规模化生产等方面的一些瓶颈问题做一些有益探索因此具有重要意义关键词脂肪酶 Plackett-Burrman设计RSM试验设计双水相纯化AbstractTwo hundred and eight oil-stained soil samples were collected from Xiangfan city Shiyan city and Wuhan city. By primary plate screening with bromothymol blue as indicator and second flask assay, six strains with high ability of lipases production were obtained, and the catalytic activity of the lipases were more than 5.0U/mL, among which the one from Aspergillus sp.F044 ranked the first and reached 11.18U/mL.Lipase production condition of Aspergillus sp. F044 was fleetly optimized using seriatim-factorial experiment Plackett-Burrman design, response surface methodology(RSM) and Monofactorial experiment. The optimum carbon source and the optimum nitrogen source for Aspergillus sp.F044 screened through seriatim-factorial experiment were maltose and bovine extract, respectively. By Plackett-Burrman design eight process factors related to lipase production were evaluated, among which three factors, concentrations of olive, bovine extract and bitter salt were found to have prominent effect on lipase production. Then the first-order model about the factors was conducted to direct steepset ascent experiment. Under the optimum condition central-composite design and response surface analysis were exercised to estimate optimum culture medium composition. Optimum fermentation temperature and optimum agitation speed of rocking incubator were determined by Monofactorial experiment. The composition of the optimum cultureHPO4,medium was 1.5w/v maltose , 7‰w/v ammonium sulfate1‰w/v K1.25w/v bovine extract,2.11‰w/v bitter salt, 1.41v/v emulsified-olive,nature pH, and the optimum fermentation temperature and the optimum agitation speed were 30and 250r/min, respectively. After 72h incubation with the optimum medium under the condition of 250r/min and 30, a maximum lipase yield 32.15U/mL wasobtained, which was 2.88-fold higher than that under beginning culture mediums.The partition behaviors of the lipase from Aspergillus sp.F044 were also studied inAqueous Two Phase System ATPS. The results showed that relative molecular weight of polyethylene glycol, concentration of polyethylene glycol, concentration of phosphate salt, pH value and concentration of NaCl greatly influenced on the partition equilibrium of the lipase in ATPS. The optimized purification condition of Aspergillus sp.F044 lipase was: 17.5 PEG600, 12.5 phosphate salt, 0.5 NaCl and pH7.0. Under the optimalcondition partition coefficient of the lipase was 7.1, purification fold was 4.7, and lipase yield was 0.91.Microbial lipases possess great economical potential in industrial applications, and it is just on the first phase for lipase applied in industry in China at present. The main purpose of this subject is to research the problems in lipases industrial production and biodiesel-synthesis, so this study is of great significance.Keywords: lipase Plackett-Burrman design Response Surface Methodology Two Aqueous Phase System purification独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果近我所知除文中已标明引用的内容外本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名陈晖日期2005年3月30日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文保密在______年解密后适用本授权数本论文属于不保密请在以上方框内打学位论文作者签名陈晖指导教师签名闫云君刘曼西日期2005年3月30日日期2005年3月30日1 文献综述引言随着石油等传统矿产能源日益枯竭以及燃烧矿产燃料产生的环境污染问题日益严重迫使人们开始寻找清洁可持续利用的替代能源生物柴油作为可再生清洁能源受到日益广泛关注生物柴油是指由动植物油与短链醇甲醇或乙醇进行酯交换反应所制备的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯目前采用的化学合成法具有工艺复杂能耗高产品色泽深以及污染环境等缺点用脂肪酶法催化合成生物柴油可以解决上述问题是新型能源工业重要发展方向但酶法也有其不足1酶的制备成本相对较高2反应底物短链醇对脂肪酶具有失活作用因此获得大量高活力耐受性强的脂肪酶是酶法生产生物柴油的关键所在目前国际国内尚没有很好地解决这一技术难题所以脂肪酶具有重要研究和开发价值脂肪酶Lipase, EC3.1.1.3是一类重要的甘油酯键水解酶可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油以及中间产物甘油一酯和甘油二酯[1-3]脂肪酶广泛存在于动物组织植物种子和微生物中商业化的脂肪酶主要来源于微生物[4]由于微生物脂肪酶种类多具有比动物脂肪酶更宽的反应pH适宜温度范围和更强的底物专一性便于进行工业生产获取高纯度制剂因而得到广泛研究[5]目前工业上采用微生物发酵制备和提取脂肪酶并将其应用于食品医药洗涤皮革造纸等行业领域[6]近年来因其可催化各类化学选择性区域选择性立体结构选择性转化反应以及不催化副反应且一般不需要辅助因子等特点促使脂肪酶在有机合成中得到广泛应用[78]矿化石油资源枯竭和人们生态环境保护意识的提高使得脂肪酶催化合成生物柴油作为可再生替代环保燃料为世人瞩目 [912]随着分子生物学和生物技术的快速发展脂肪酶细胞表面展示[13]基因表达调控[14]特异脂肪酶的高通量分子筛选[15]等已成为人们的关注焦点并将逐步替代传统菌株筛选产酶条件优化等试验方法更好的为工业应用提供支持1.1 脂肪酶性质1.1.1 脂肪酶理化特性目前已发现的脂肪酶相对分子质量大多在30kDa40kDa之间等电点在3.79.7之间酶蛋白分子含有一到几个亚基脂肪酶最适作用温度最适pH pH稳定性以及耐热性因不同来源而异Staphylococcus simulans组成性分泌脂肪酶由四个相对分子质量约40KDa脂肪酶亚分子聚集而成分子质量160kDa最适温度和最适pH分别是37°C和pH8.5在60°C保温几分钟酶即失活对Ca2无依赖[16]来源于Bacillusthermoleovorans ID-1嗜热脂肪酶相对分子质量34kDa最适温度和最适pH分别是70 75°C和pH7.5在60°C保温一小时或70°C保温半小时仍保持50的初始活力 Ca2或Zn2对其有激活作用[17]某些微生物可产两种或两种以上的脂肪酶如Ophiostoma piliferum可分泌两种脂肪酶相对分子质量分别为60kDa和52kDa等电点分别为3.79和3.6[18]总体上微生物脂肪酶最适pH大多为中性最适pH范围与微生物种属无明显相关性真菌脂肪酶最适作用温度相对较低而细菌脂肪酶则比较耐热虽然不同来源的脂肪酶相对分子质量相差很大一级结构同源性程度较底但三级结构之间却含有相似的α/β模体结构[19]这些保守的α螺旋和β折叠形成空洞空洞中含有高度保守的丝氨酸组氨酸天冬氨酸三合体结构三合体相互作用使得空洞变成活性氧洞成为脂肪酶分子催化活性中心空洞外有一个由表面环和螺旋结构构成的亲水性盖子使得氧洞不会直接暴露出来[20]一些真菌来源的脂肪酶肽链上连接有糖基但不直接决定酶活力如切除Rhizpous niveus型脂肪酶的糖基型酶转变成型但酶活并不降低[21]脂肪酶具有界面催化特性其催化脂肪酸油脂水解反应需在油水界面上进行[22]且需要一定量的活性水[23]金属离子对脂肪酶催化能力也有影响Chartrain等发现1mM Zn2+可以抑制P.aeruginosa MB5001脂肪酶94的酶活力而加入10mMCa2+可重新将酶激活[24]P.pseudoalcaligenes F-111脂肪酶能够在301mM Fe3中保温1h被抑制60的酶活但1mM Ca2+Hg2+Zn2+Mn2Cu2+Mg2+Co2+Cd2Pb2等在同样条件下对酶活没有显著性影响[25]笔者研究的Aspergillus sp.F044脂肪酶可以被Ca2+激活脂肪酶是一类剪切力低耐受性蛋白质在反应过程中机械搅拌反应体系可以增大油水界面但搅拌所带来的液液以及气液界面间的剪切应力可能会使脂肪酶变性解开折叠但酶蛋白不会裂解成多肽链随着温度升高变性作用加剧[26]1.1.2 脂肪酶催化机理脂肪酶必须和底物结合才能起催化反应但酶是水溶性的而底物是不溶于水的因此水解反应必须发生在油水界面上这种反应的机制尚不清楚但Brockerhoff于1974年提出脂肪酶在油水界面上定位假说[27]该假说认为脂肪酶只能与一种不同于一般底物的超底物结合超底物比酶分子大的多超底物中包埋有反应底物脂肪酶在水溶液中作热运动碰到超底物时脂肪酶亲水性盖子定位到超底物表面此时超底物内部疏水作用力推开脂肪酶亲水性盖子促使脂肪酶发生构象改变暴露出疏水性活性中心使得底物疏水性头部进入活性中心近年来脂肪酶的结构和催化机理有不少报道有Pseudomonas cepaica,Pseudomonas.sp Staphylo-coccushyicus,金黄色葡萄球菌, Geotrichumcan-didum,Caudida cylindracea Rhizomucormiehei RML和人胰脂肪酶HPL虽然不同来源的脂肪酶氨基酸序列有较大的差异但它们却有相似的折叠方式和活性中心有着非常相似的立体结构一般来说脂肪酶的多肽链折叠成两个结构域即N末端和C末端结构域N末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性通道该通道从催化部位的Ser直到分子的表面[28]几乎所有的脂肪酶的活性部位都由组氨酸His色氨酸Ser天冬氨酸Asp组成, 但也有一些脂肪酶的活性部位为组氨酸色氨酸和谷氨酸Glu三合体结构通常情况下脂肪酶的活性部位被一个螺旋片断所掩盖在底物存在的情况下酶的构象发生变化盖子打开含有活性部位的疏水部分就暴露出来盖子中α螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油水界面上的结合能力其双亲性的减弱将会导致脂肪酶活性的降低盖子的外表面相对亲水而其面向催化部位的内表面则相对疏水由于脂肪酶与油/水界面的缔合作用使盖子打开活性部位得以暴露这使得底物与脂肪酶的结合能力增强此时底物就容易进入疏水性的通道而于活性部位结合三合体结构中三个氨基酸残基相互作用使得活性部位形成活性氧区活性氧亲和进攻酯键形成酶底物复合物[29]酯键打开生成水溶性脂肪酸和甘油1.1.3 反应类型总体上脂肪酶可催化酯合成酯水解酯交换和氨/胺解四种反应具有反应条件温和化学选择性强高度立体结构专一性副产物少等优点酯合成反应如方程式所示在脂肪酶作用下羧基化合物和醇缩合脱去一分子水生成酯类近年来脂肪酶催化合成光学不对称化合物发展迅速正逐渐替代常规的有机合成途径通过假丝酵母脂肪酶选择性地催化外消旋体2甲基羧酸和醇酯化获得S2甲基羧酸酯而R 型不会被酯化, 如方程式所示酯水解反应如方程式中逆反应脂肪酶催化酯键水解生成羧酸和醇由于脂肪酶具有高度立体结构专一性因此该反应被广泛应用于光学化合物的拆分R-HPBE 是合成多种血管紧张素转化酶的抑制剂的重要中间体如合成抗高血压药西拉普利Cilazapril用脂肪酶催化水解外消旋的HPBE 可以得到光学纯的RROOH +OH OHOHRR R OO O O OO+OH 2方程式 脂肪酶催化酯合成反应Equation Esters synthesis catalyzed by lipasesCH 3COOHCH 3CH2n+CH 3CH2nOH环己烷CH 3CH2n +OC H 3CH 3CH2nO CH2nCH32甲基羧酸外消旋RS方程式S 2甲基脂肪羧酸酯的合成 EquationS2methylcarboxylate synthesisHPBE和S HPBA[30]其过程如方程式所示OOHO CH3 (?）HPBE+3OOHOH(S)HPBA方程式脂肪酶手性拆分HPBEEquation Enzymatic resolution of chiral compound-HPBE脂肪酶催化酯交换反应类型类似于酯合成总体上包括狭义酯交换反应醇解和氨/胺解解随着能源危机的到来和环保意识的提高脂肪酶催化合成生物柴油成为当前科学应用研究的热点领域如反应方程式所示此外脂肪酶被广泛应用于制备光活性药物S-1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇是合成β-抗肾上腺素的中间体可以从(CH2)nCH2(CH2)nCH2(CH2)nCH2OOOOOOCHCH3CHCH3CHCH3天然油脂(n14)+CH3OH脂肪酶CH3(CH2)nCH2OOCH2脂肪酸甲酯生物柴油方程式脂肪酶催化合成生物柴油Equation Biodiesel synthesis catalyzed by lipasesO N3OH+CH2OO CH3CH3脂肪酶O N3OHAr3(s)醇(R)酯()1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇方程式脂肪酶催化选择性醇解反应Equation Resolution reaction by lipase catalyzed enantoselective acetylation其外消旋体拆分获得以乙酸异丙烯酯为酰化剂在南极假丝酵母脂肪酶催化下外消旋体1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇选择性地转化为相应的S -醇和R -酯[31]反应过程如方程式脂肪酶具有较低的酰胺酶活性能够催化胺氨的酰化酶法氨解反应和酯交换反应的区别在于酰基供体不同被活化的酯在脂肪酶作用下和胺发生酰化反应O OHOEtCH 3NH 3OOHOEtC3+2H 3(R)氨基酯3-羟基戊二酸二甲酯方程式 脂肪酶催化氨解反应Equation Ammonolysis reaction catalyzed by lipases被活化的酯常用于氨解反应以Candida Antarctica lipase B CAL-B 为催化剂3-羟基戊二酸二甲酯和胺或氨发生反应可以得到对映体纯的氨基酯在溶液中前体R酯发生亲核反应生成R氨基酯[32]反应过程如方程式所示1.1.4 底物特异性脂肪酶对底物具有化学和空间结构选择性根据脂肪酶来源不同其底物特异性也有所差异人们对这一点已有非常深入的认识如上面提到的通过脂肪酶实现对HPBE 1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇3-羟基戊二酸二甲酯等光学拆分以得到光学纯的反应产物又如2芳氧基丙酸是一类重要的除草剂目前市面上多数是外消旋体而研究表明只有R -型异构体具有除草活性外消旋2芳氧基丙酸乙烯酯在黑曲霉脂肪酶催化下与甲醇进行酯交换反应可选择性得到光活性R2芳氧基丙酸乙烯酯和S -2芳氧基丙酸甲酯且收率高达46[33]Alford 曾比较了23种不同的微生物脂肪酶发现大多数脂肪酶作用于三酯酰甘油的13位酯键Aspergillus terrus 专一性地作用于13位酯键对猪油和落花生油表现了较高地活性[34]总体上脂肪酶表现出对醇链上羟基比脂肪酸链上酰基更强的立体结构专一性但目前对于这一专一性的分子机理知之甚少[35]Rogalska 等通过研究脂肪酶被脂滴功能性吸附表明底物物理化学状态如表面张力和表面特性将会影响脂肪酶活力和特异性[36]部分融合一级结构有86同源性但底物特异性不同的两种白地霉脂肪酶Geotrichum candidum lipase GCL-和GCL-的氮末端和碳末端发现GCL-349到406位的58个氨基酸残基决定其对cisΔ-9不饱和脂肪酸酯特异性催化进一步研究发现其中有十四个氨基酸残基处于脂肪酶分子的表面它们可能参与进行底物识别[37-38]通过建立褶皱酵母脂肪酶与手性底物结合模型研究发现脂肪酶识别特异性光学底物可能与手性底物结合模型的自由能有关自由能越低识别作用越强烈[39-40]1.2 菌株筛选和酶活测定1.2.1 野生菌株很多微生物都产脂肪酶包括细菌放线菌真菌和酵母共计约65个属的微生物产脂肪酶[6]而实际上可能更多我国微生物脂肪酶研究起步较晚1967年中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母Candida lipolytica AS2.1203并于1969年制成酶制剂供应市场国内产脂肪酶微生物概况见表1.1常见的商品化的脂肪酶产生菌见表1.2表1.2 常见的商品脂肪酶Table 1.2 Some familiar commercial lipases菌株缩写生产厂商Amano Candida cylindracea CCL Sigma,Fluka Aspergillus niger ANL Amano,Rhizopus delemar RDL AmanoNovo Humicola lanuginose HLL Amano, Mucor Miehei MML Novo,Gist-Brocades Horse-Liver esterase HLE Sigma, Fluka, Amano1.2.2 筛选方法筛选脂肪酶高产菌的方法常见的是采用含甘油三酯琼脂平板法首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢废油布等无菌水梯度稀释样品涂平板培养观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B溴甲酚紫维多利亚蓝等作为筛选标记观察变色圈的大小透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶能力即透明圈和变色圈越大菌株产脂肪酶能力可能越大例如C ardena等以三丁酸甘油酯为底物通过观察菌落周围的透明圈筛选得到六株脂肪酶高产菌[59]我国高修功等以橄榄油乳化液为底物通过观察透明圈筛选得到一株高酶活假单胞菌[56]李春华粗筛以维多利亚蓝B为指示剂以罗丹明B为复筛指示剂筛选得到一株耐热碱性芽孢杆菌[51]作者所在实验室分别以溴甲酚紫和罗丹明B为指示剂筛选得到多株高酶活菌株有些研究则以吐温为底物如Mohd以吐温80为底物分别在筛选平板中添加维多利亚蓝甲基红和罗丹明B作为筛选标记发现脂肪酶活力与三种指示剂的变色圈大小和颜色深浅成正比[60]又如Ionita以G.Y.P.组成w/v:葡萄糖2.0酵母膏0.5蛋白胨0.5琼脂2.0为基本培养基然后在其中添加0.1CaCl 2和1.0吐温80脂肪酶作用在平板上形成不透明的皂化钙圈计算皂化钙圈与菌落圈的比值可以近似估计菌株产脂肪酶能力[61]这种方法屏蔽了因橄榄油不溶于水乳化液不稳定从而造成底物在平板中分布不均匀以及三丁酸甘油酯作为底物时透明圈不明显的缺点但以吐温80为底物最大缺陷是不能区分酯酶和脂肪酶另外一些产脂肪酶菌可以寄生在动植物组织中如Abbas等从棕榈果实中分离得到一株毛霉其发酵酶活达到57U/mL[62],因此有目的从含油动植物组织中分离寄生菌是特殊有效的方法筛选具有特殊性质的脂肪酶如耐酸耐碱耐高温需在极端环境下采集样品然后根据所要得到的酶的性质设计菌株分离方法Lee等在印度尼西亚热带地区采集土样60下土样在含有0.5橄榄油乳化液的液体培养基富集产脂肪酶菌株然后以罗丹明B为指示剂用甘油三酯平板法60下培育分离产脂肪酶菌株分离得到一株耐热芽孢杆菌其脂肪酶最适作用温度为75在60°C保温一小时或70°C保温半小时仍保持50初始酶活 [17]表1.1 国内产脂肪酶微生物概况Table 1.1 The figure of lipases production microorganisms in mainland菌名酶活力U/mL研究机构参考文献微球菌Micrococcus 5.6吉林大学酶工程实验室41根霉菌* Rhodobacter.sp 147Ug-1无锡轻工业学院42华根霉Rhizopus chinensis20 无锡轻工业学院45卡门柏青霉P.camembertii 60中国科学院微生物研究所44根霉Rhizopus.sp 50中国科学院成都生物研究所43类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes 26.5福建师范大学生物工程学院46链霉菌* Streptomyces 596浙江工业大学生物工程系47毛霉Mucor sp.15.5山东大学微生物技术国家重点实验室48铜绿假单胞菌Pseudomonas Stutzeri6 吉林大学分子生物学系49液化沙雷氏菌Serrasia liquejaciens 43南京大学生物科学与技术系50芽孢杆菌* Bacillus 100湖北大学生命科学学院51黑曲霉Aspergillus niger 16.4 云南大学生物系52异常毕赤酵母Pichia ananala 20福建师范大学生物工程学院53扩展青霉* Penicillium expansum 1000福建师范大学生物工程学院54褶皱酵母Candida rugosa 19.5 华南理工大学生55假单胞菌Pseudomonas 11.3 无锡轻工业大学56无花果丝孢酵母Trichosp figueroe 30大连轻工业学院食品工程系57丝孢酵母Trichosporon 55山东大学微生物技术国家重点实验室58*表示酶活测定方法与其它不同酶活数值与表中其它菌株酶活值无可比性此外可以通过物理化学诱变细胞杂交蛋白质定向进化以及转基因技术等筛选特殊性质的高酶活菌株Tan等通过紫外NGTN-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine诱变快中子辐射筛选得一株Candida sp.其酶活从112U/mL提高到1108U/mL[63]Liebeton 等对铜绿假单胞菌脂肪酶Pseudomouas aeruginosa lipase, PAL进行定向进化使其光学选择性突变至野生型得25倍以上[64]1.2.3 脂肪酶活力测定脂肪酶活力测定分两大类定性检测和定量测定定性检测脂肪酶活力主要采用平板法即在含有底物的平板上打孔将酶液加入到孔内然后根据水解圈或变色圈定性分析脂肪酶活力高低如kouker等于1987年报道了一种脂肪酶平板检测法他们以三油酸甘油为底物罗丹明B为指示剂在平板上比较酶液周围荧光圈大小进而判断脂肪酶活力大小[65]常用的定量测定方法有三种碱滴定法PNPB法[17]皂铜法[17]碱滴定法是以橄榄油或三油酸甘油酯和2聚乙烯醇乳化液为底物以1酚酞为指示剂0.05MNaOH中和反应产生的脂肪酸每产生1μg脂肪酸定义为一个酶活力单位PNPB法不同于碱滴定法它以对硝基苯丁酸酯为底物乙腈为溶剂加入酶液反应15分钟然后在405nm下测定反应产生的对硝基苯的吸光度以反应产生的对硝基苯的量评估酶活力测定前需制作对硝基苯吸光度标准曲线皂铜法是以甘油三酯和阿拉伯胶为底物反应产生的脂肪酸用有机溶剂正己烷抽提然后有机相中加入醋酸铜水溶液生成皂铜最后提取有机相加入染色剂二乙基二硫氨基甲酸混合均匀后在430nm测定二乙基二硫氨基甲酸铜的吸光度反应也需制作吸光度标准曲线三种方法中以碱滴定法最为常用该法简单易行操作方便但试验误差较大而且当总酶量很低或总酶活很低时无法检测PNPB法和皂铜法虽然检测灵敏度高但相对操作繁琐而且PNPB法使用的试剂昂贵因此建议酶量和总酶活较高时可以用碱滴定法而当脂肪酶经过凝胶过滤离子交换层析后总酶活较低可以用PNPB法和皂铜法此外尚有一些其它测定方法如在Beisson等报道了甘油氧化法pH 电极自动滴定法油膜表面张力法等[66]因不常用在此不作介绍1.3 脂肪酶发酵生产1.3.1 发酵影响因素微生物发酵生产脂肪酶因菌株不同发酵生产条件亦不相同作者曾对不同菌株产脂肪酶最优化培养条件进行比较发现差异很大如表1.3所列举总体上微生物产脂肪酶发酵分两类:固体发酵和液体发酵法相对液体发酵法固体发酵生产脂肪酶具有简洁经济的优点Bhushan 等以米糠和麦麸为底料培养酵母生产碱性脂肪酶[69]又如Ikram 在30下用麸皮和磷酸盐培养根霉菌72h 然后用液体抽提液抽提得到脂肪酶[70]影响菌株发酵产脂肪酶的因素有氮源碳源底物诱导剂表面活性剂矿物质pH培养温度摇床转速培养时间接种量等为了解菌株发酵特性和得到最优化培养条件研究人员通常设计各种试验研究各个影响因素或者通过比较找到主要影响产酶因素Tan等分别研究了氮源包括有机氮大豆粉大豆饼粉大表1.3 培养条件之比较Table 1.3 Compare of some microbial cultivation condition菌株 最优培养条件参考文献 假单胞菌Pseudomonas sp.黄豆粉 2.51玉米浆2.74可溶性淀粉1.0K 2HPO 40.87, NaNO 30.5, 起始pH9.032150r/min 67铜绿假单胞菌 Pseudomonas stutzeri 大豆1.5 玉米浸出液 3.0葡萄糖0.5橄榄油0.75初始pH7.028150r/min 49 白地霉Geotrichum sp.玉米浸出液1315橄榄油0.6硝酸氨0.830 68 褶皱酵母Candida rugose葡萄糖0.1橄榄油 4.00.3NH 4NO 30.3, K 2HPO 41.2, MgSO 4.7H 2O 0.4,初始pH6.530180r/min, 60h 55链霉菌 Streptomyces糊精1黄豆粉3尿素1K 2HPO 40.05NaCl0.1AEO 90.05, 初始pH9.526 47。

碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化摘要利用筛选和验证相结合的方法筛选出了产碱性脂肪酶活性较高的菌株bl1011。

经过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，结果表明该菌株为假单胞菌（pseudomonas sp.）。

运用单因素试验和均匀试验优化了bl1011菌株摇瓶产酶培养基和最佳发酵条件。

在培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，大豆油0.5%，k2hpo4 0.2%，培养条件为起始ph值7.5，温度33 ℃，转速180 r/min，装液量20 ml，发酵周期为60 h的条件下，酶活力达到最高，为223 u/ml。

关键词脂肪酶；筛选；发酵优化；均匀试验中图分类号 q55 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2012）22-0274-03脂肪酶（lipase，e.c.3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶）是一种特殊的酯键水解酶，能在油水界面催化油脂水解，生成甘油和脂肪酸，具有化学选择性和底物选择性[1]。

脂肪酶被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域[2]。

尽管自然界中产脂肪酶的微生物很多，但用于商业化生产的细菌很少，主要有伯克霍尔德氏菌（burkholderia）、无色杆菌属（achromobacter）、假单胞菌属（pseudomonas）、色杆菌属（chromobacterium）、产碱杆菌属（alkaligenes）、节杆菌属（arthrobacter）[3]。

假单胞菌产碱性脂肪酶国内外虽有研究，但酶活力均不高[4]。

该研究通过罗丹明b平板法快速筛选出一株产碱性脂肪酶能力较强的菌株，并对其产酶条件进行优化研究。

1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株。

细菌：bl1001-1020；酵母：bl2001-2015；霉菌：bl3001-3025。

试验菌株均由郑州轻工业学校食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏。

1.1.2 培养基。

①种子培养基。

产脂肪酶真菌的筛选及产酶条件优化李军红;姜绍通;童洋洋【摘要】[目的]从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌,以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料.[方法]从上海市、河北省唐山、江苏省兴化、安徽省合肥地区土样中,经富集培养、平板筛选得到22株脂肪酶产生菌株,通过复筛得到1株脂肪酶活力较高真菌.根据《常见与常用真菌》对菌株进行鉴定,并研究不同条件对菌株产酶的影响.[结果]从富含油脂土壤中分离得到1株产脂肪酶能力较高菌株,根据菌落群体及个体形态,查阅相关鉴定手册,初步确定该菌株为黑曲霉.菌株产酶条件研究表明:其最适产酶条件为温度30℃,初始pH 7,装液量20％,最适碳源与氮源分别为淀粉和蛋白胨.[结论]为脂肪酶产生菌以及脂肪酶的工业化生产与应用奠定了基础.%[Objective]The study aimed to seek for the fungi with high yield of lipase from the greasy soil, so as to provide the material for ex panding the fungi source of lipase. [ Method]22 strains of fungi producing lipase were isolated by enrichment culture and flat screening methods in soil samples collected from Shanghai City, Tangshan City of Hebei Province, Xinghua area of Jiangsu Province, Hefei area of Anhui Province. A stain with higher activity of producing lipase was isolated by re-screening methods. The strain was identified according to "The Common and Com mon-used Fungi" and the effects of different conditions on the strain producing lipase were studied. [Result] A stain with higher ability of produ cing lipase was isolated from the greasy soil. The strain was identified as Aspergillus niger according to groups characteristic and individuals forms of colonies and the relevant appraisal manual. The study on the conditions ofproducing enzyme for the strain showed that the optimal conditions of producing enzyme were as follows: the temperature for fermentation of 30 t, the initial pH of 7, the medium volume of 20% , and the optimum carbon and nitrogen sources were starches and peptones, resp. [Conclusion]The study laid a foundation for lipase producing bacteria and industri al production and application of lipase to some extent.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)026【总页数】3页(P15840-15842)【关键词】脂肪酶;筛选;产酶条件【作者】李军红;姜绍通;童洋洋【作者单位】合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】S132脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸［1］。

米曲霉产脂肪酶的发酵条件优化邓琳芬;郑毅;王娅;刘源慧【摘要】对米曲霉产脂肪酶的发酵培养基进行优化.首先通过单因素试验确定发酵最适碳源为玉米粉,最适氮源为蛋白胨,然后通过Plackett-Burman优化选出对发酵影响最显著的因素,分别为蛋白胨、橄榄油、Na2HPO4.产脂肪酶的最适培养条件为:玉米粉0.5%,蛋白胨5%,橄榄油1.5%,NaNO3 1%,Na2HPO4 0.25%,KCl0.05%,MgSO4 0.05%,FeSO4 0.001%.【期刊名称】《海峡科学》【年(卷),期】2010(000)010【总页数】3页(P12-14)【关键词】米曲霉;脂肪酶;发酵条件【作者】邓琳芬;郑毅;王娅;刘源慧【作者单位】福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院【正文语种】中文脂肪酶广泛应用于脂肪的生产工艺、去污剂和脱脂业、食品、工艺、精细化学品合成业、造纸业、化妆品制造业以及制药业中，脂肪酶还可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解，大多数工业生产的微生物脂肪酶是出自真菌和细菌的酶[1]。

随着对脂肪酶研究的日益深入,其应用领域正日渐拓宽,与此相应,新型脂肪酶的研究开发就备受关注。

通过对原有脂肪酶改性或对菌株进行优化培养可以得到新型的脂肪酶[2]。

本研究对一株米曲霉产脂肪酶的发酵条件进行优化。

1.1.1菌种米曲霉，为本实验室保藏菌种。

1.1.2培养基斜面培养基：0.2%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4,3%蔗糖,1.5%~2.0%琼脂,1%麸皮.种子培养基：0.5%玉米粉，0.5%葡萄糖，2%黄豆饼粉，0.5%酵母膏，1%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

初始设计发酵培养基：1%玉米粉，4%黄豆饼粉，1%橄榄油，1%NaNO3，Na2HPO4 0.1%，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种通过加速脂肪的加水分解而使其水解成胆固醇、甘油、游离脂肪酸等组分的生物催化剂。

脂肪酶已经广泛应用于食品、乳制品、制药、皮革等行业，因此其生产研究具有重要意义。

微生物发酵是目前最主要的脂肪酶生产方法之一，本文详细介绍了微生物发酵生产脂肪酶的研究进展。

1. 常用微生物种类微生物发酵生产脂肪酶常用的微生物种类有真菌、细菌、放线菌、酵母等。

其中最常用的微生物是霉菌和细菌。

霉菌对不同类型的底物都具有良好的酶活性，但是其生长速度较慢，反应时间长。

细菌则生长速度快，能够迅速产生大量的酶，但是它们的适应能力较差。

2. 脂肪酶生产工艺流程微生物发酵法生产脂肪酶的具体工艺流程大致分为以下几个步骤。

（1）培养基的制备：首先需要制备含有所需营养物质的培养基。

一般来说，优质的培养基含有碳源、氮源、微量元素、维生素等。

（2）微生物的接种：将所选的微生物菌株接种到培养基中，并进行预培养。

（3）发酵过程中的条件调控：这一步的关键在于对发酵过程的控制，包括温度、pH 值、培养时间等因素。

（4）分离纯化：分离、纯化和测量酶的本质是为了得到高纯度、活性较高的脂肪酶产品。

3. 研究进展（1）发酵条件的优化脂肪酶活性的提高对生产工艺的产率和经济效益都有着重要的意义。

为此，研究者通过对发酵温度、pH值、氮源等条件进行优化，成功提高了脂肪酶的产量和酶活。

例如，Jamil Khaskheli等发现，酵母菌Candida rugosa生产脂肪酶的酶活性受到温度影响较大，并在32℃的条件下达到最大值。

（2）遗传工程改造遗传工程技术在脂肪酶生产领域也已经得到广泛应用。

相关研究表明，基于DNA重组技术可以对脂肪酶的生产菌株进行改造，提高酶的稳定性和催化效率。

例如，一项由瑞典Karolinska Institute的研究人员完成的研究表明，通过在大肠杆菌中表达脂肪酶基因，可以显著提高脂肪酶的产量和催化效率。

（3）新型菌株的筛选与发现是时候采用新型菌株用于脂肪酶生产。

脂肪酶的生产原理及应用前言脂肪酶是一种酶类，其主要作用是加速脂肪的降解反应。

脂肪酶的生产原理和应用在生物技术领域中具有重要的意义。

本文将介绍脂肪酶的生产原理以及其在食品、医药和环境等方面的应用。

生产原理脂肪酶的生产主要通过微生物发酵得到。

下面将介绍脂肪酶的生产原理。

1.微生物选择：选择合适的微生物菌株对脂肪酶的生产至关重要。

常用的微生物菌株有放线菌、毛霉、酵母等。

2.培养基配方：合理的培养基配方是脂肪酶生产的基础。

培养基中应提供合适的碳源、氮源、矿物盐和生长因子。

3.发酵条件控制：合理的发酵条件对脂肪酶的生产影响巨大。

发酵温度、pH值和发酵时间是影响脂肪酶生产的关键因素。

一般来说，脂肪酶在温度为30-40℃，pH值为7-8的条件下生产效果较好。

4.酶提取和纯化：经过发酵得到的发酵液中含有脂肪酶，需要提取和纯化以得到高纯度的酶。

常用的方法有沉淀法、超滤法等。

脂肪酶的应用脂肪酶在食品、医药和环境等领域具有广泛的应用。

下面将介绍脂肪酶在不同领域中的应用情况。

食品领域1.食品加工：脂肪酶可用于食品加工过程中的油脂酯化反应和水解反应，用于改善食品的质地、口感和保鲜性。

2.乳制品工业：脂肪酶可用于乳制品中乳脂肪的酯化反应，用于改善乳品的风味和乳脂质的稳定性。

3.面包工业：脂肪酶可用于面包制作过程中的面糊脂肪分解，用于改善面包的质地和延长保鲜期。

医药领域1.药物制剂：脂肪酶可用于药物制剂的制备过程中的脂肪酯水解反应，用于改善药物的溶解性和生物利用度。

2.肥胖症治疗：脂肪酶可用于治疗肥胖症，通过促进脂肪的降解和消化，达到减重的目的。

环境领域1.油污处理：脂肪酶可用于油污处理过程中的脂肪降解反应，用于减少油污对环境的污染。

2.生物柴油制备：脂肪酶可用于生物柴油的制备过程中的酯交换反应，用于提高生物柴油的产量和质量。

总结脂肪酶的生产原理主要通过微生物发酵得到，需要选择合适的微生物菌株、合理的培养基配方以及控制合适的发酵条件。

绵阳师范学院本科生毕业论文（设计）题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术院部生命科学与技术学院学号0811420218姓名杜长蔓指导教师李俊刚答辩时间2012年5月论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化学生：杜长蔓指导老师：李俊刚摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉+1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。

脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。

对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。

关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization offermentation conditionsUndergraduate: Du ChangmanSupervisor: Li Jun GangAbstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test.Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions；optimization ；orthogonal test目录1前言 (6)1.1脂肪酶的概况 (6)1.2国内外脂肪酶的研究概况 (7)1.3本研究的目的及意义 (7)2实验材料和器具 (7)2.1 实验菌种 (7)2.2 主要实验仪器 (8)2.3 实验试剂 (8)2.4培养基 (8)3 实验流程 (9)4. 实验方法 (9)4.1 生长曲线的测定 (9)4.2 产酶曲线的测定 (9)4.3 脂肪酶产生菌M-6-2菌体生长的最佳条件的确定 (10)4.3.1 PH对M-6-2菌体生长的影响 (10)4.3.2 温度对M-6-2菌体生长的影响 (10)4.3.3 装液量对M-6-2菌体生长的影响 (10)4.3.4 摇床转速对M-6-2菌体生长的影响 (11)4.4 脂肪酶培养基的优化 (11)4.4.1 脂肪酶培养基单因素条件的优化 (11)4.4.2 产脂肪酶培养基的正交试验 (12)4.5 脂肪酶发酵条件优化 (13)4.5.1 发酵条件单因素条件优化 (13)4.5.2 产脂肪酶发酵条件的正交试验 (13)5分析方法 (14)5.1脂肪酶酶活测定与计算方法 (14)5.2 酶活测定的原理 (14)5.3 酶活的定义 (14)5.4 酶活的测定 (14)5.5 酶活的计算方法： (14)5.6 生物量的测定 (14)6 结果与讨论 (14)6.1 生长曲线的测定结果 (14)6.2 产酶曲线的测定结果 (15)6.3菌体的生长和产酶动力学关系 (16)6.4 脂肪酶产生菌M-6-2菌体生长最佳条件的确定结果 (16)6.4.1 PH对M-6-2菌体生长的影响 (16)6.4.2 温度对M-6-2菌体生长的影响 (17)6.4.3 装液量对M-6-2菌体生长的影响 (17)6.4.4 摇床转速对M-6-2菌体生长的影响 (18)6.5 脂肪酶培养基的优化 (19)6.5.1 单因素实验 (19)6.5.2 正交试验 (22)6.6 脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化 (23)6.6.1 单因素实验 (23)6.5.2 正交实验 (26)6.6 讨论 (27)参考文献 (29)致谢 (31)1前言1.1脂肪酶的概况脂肪酶酶[EC 3.1.1.3]又称三酰基甘油酰基水解酶（acylglycerol hydrolases）[1]，是一类具有多种催化能力的酶，广泛存在于动植物、植物及微生物中。

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展概述脂肪酶是一种重要的酶类，在工业生产中具有广泛的应用价值。

它能够在水和油脂界面上催化水解和合成酯化反应，常用于食品、医药、皮革、纺织等行业。

微生物发酵生产脂肪酶是目前最主要的脂肪酶生产方式之一，由于其生产过程易于操作、生产成本较低，且酶活性高，因此备受关注。

本文将对微生物发酵生产脂肪酶的研究进展进行探讨。

微生物来源微生物种类的选择对脂肪酶的生产具有非常重要的影响。

目前常用的产脂肪酶的微生物种类包括真菌、细菌和酵母菌等。

真菌是脂肪酶生产的重要来源之一，如青霉菌、曲霉菌、酵母菌等，这类微生物具有较高的脂肪酶产量和较高的酶活性。

细菌属和酵母属中也有一些菌株能够高效产生脂肪酶。

选择合适的微生物来源是微生物发酵生产脂肪酶的首要条件。

发酵条件的优化发酵条件的优化对脂肪酶的产量和酶活性有着直接的影响。

在微生物发酵生产脂肪酶的过程中，温度、pH、培养基成分和发酵时间等因素均会对生产效果产生影响。

研究人员通过对这些因素的调控和优化，以提高脂肪酶的产量和酶活性。

通过利用实验设计方法，对微生物发酵生产脂肪酶的影响因素进行系统优化，可以得到最佳的发酵条件，从而提高脂肪酶的产量和酶活性。

基因工程技术的应用随着基因工程技术的不断发展，将其应用于微生物发酵生产脂肪酶已成为目前的研究热点之一。

通过对脂肪酶基因的克隆、表达和改良，可以获得产量更高、酶活性更强的脂肪酶。

利用重组DNA技术将脂肪酶基因导入高产酶的真菌或细菌中，可以显著提高脂肪酶的产量和酶活性。

还可以通过对脂肪酶基因进行改良，获取具有更适应工业生产需求的脂肪酶。

提高产酶菌株的筛选筛选高效产酶菌株是微生物发酵生产脂肪酶的关键一步。

传统的筛选方法主要依赖于培养基中蛋白质、酯酶可诱导表达的碳源。

近年来, 一些研究人员通过利用高通量筛选技术, 对大量菌株进行筛选, 以获取具有高脂肪酶产量和较高酶活性的微生物菌株。

例如, 利用背景荧光素分子检测技术, 可以对高产酶菌株进行快速筛选, 从而提高了筛选的效率。