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实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
芽孢染色法的原理
芽孢染色法是一种用于检测和鉴定芽孢形成菌类的常用方法。
其原理基于芽孢的特殊结构和反应性。
首先，芽孢是一种形成于某些细菌和真菌细胞内的一种耐受性很高的休眠状态。
在适当条件下，芽孢可以在短时间内释放，使其周围环境进行细胞增殖。
这一特性使得芽孢成为了一种理想的适应生存环境恶劣的细菌的策略，也使得芽孢形成菌类在食品、环境和医疗等领域的检测工作中具有重要意义。
芽孢染色法的目的就是通过染色方法将芽孢从其他细胞和杂质中区分开来，并使其能够进行清晰可见的观察。
其中最常用的芽孢染色方法包括热染法、抗酸染色法和国际染色法等。
热染法是基于芽孢对高温的特殊耐受性，通过将样本加热到大约80-90℃，使其他非芽孢细胞受到破坏和溶解，而芽孢则保持完整且可染色。
一般使用石碱溶液对样品进行染色，然后使用显微镜观察。
抗酸染色法是通过将样品加入酸性以及带有对比染色剂的染色液中进行染色，然后使用显微镜观察。
正常的细胞会被酸性环境破坏，而芽孢则能够在酸性环境下存活并保持染色。
最常用的抗酸染色方法是梅尔候特染色法。
国际染色法则是通过将芽孢样品加入固定剂中，使其固定在载玻片上，然后使用Grocott染色进行处理。
这种染色法的优点是可清晰显示芽孢内部的结构，并能够区分不同种类的芽孢形
成菌类。
综上所述，芽孢染色法利用了芽孢的特殊结构和反应性，通过不同的染色方法能够使芽孢与其他细胞和杂质进行区分，并能够进行清晰可见的观察和鉴定工作。
一、实验目的1. 了解细菌芽孢的基本特征和生物学意义。
2. 掌握细菌芽孢鉴别的实验方法，包括染色、观察和比较。
3. 培养实验操作技能，提高微生物学实验水平。
二、实验原理细菌芽孢是细菌在逆境条件下形成的一种休眠体，具有高度的抵抗力。
芽孢呈球形或椭圆形，具有厚而致密的壁，通透性低，对高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。
在显微镜下观察，芽孢具有强烈的折光现象，且与菌体颜色不同。
本实验通过染色和观察，对细菌芽孢进行鉴别，包括芽孢染色法、芽孢与菌体形态比较等。
三、实验材料1. 实验菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
2. 实验试剂：孔雀绿染液、番红染液、黑色素液、无菌水、生理盐水等。
3. 实验仪器：显微镜、接种环、培养皿、试管、酒精灯、载玻片等。
四、实验方法1. 芽孢染色（1）将待检菌种接种于平板培养基，培养24-48小时。
（2）用接种环挑取少量菌体，滴加孔雀绿染液，加热至沸腾，维持5-10分钟。
（3）用无菌水冲洗载玻片，滴加番红染液，覆以盖玻片，显微镜下观察。
2. 芽孢与菌体形态比较（1）在显微镜下观察菌体形态，记录细菌的形态、大小、排列等特征。
（2）观察芽孢形态，记录芽孢的大小、形状、颜色等特征。
（3）比较芽孢与菌体形态，分析细菌芽孢的生物学意义。
五、实验结果与分析1. 芽孢染色结果显微镜下观察，枯草芽孢杆菌呈现绿色，菌体呈现红色；大肠杆菌呈现绿色，菌体呈现红色；金黄色葡萄球菌呈现绿色，菌体呈现红色。
说明芽孢染色法可以有效地将芽孢与菌体区分开来。
2. 芽孢与菌体形态比较枯草芽孢杆菌芽孢呈球形，大小约为菌体的1/2，具有强烈的折光现象；大肠杆菌芽孢呈椭圆形，大小约为菌体的1/3，具有较弱的折光现象；金黄色葡萄球菌芽孢呈球形，大小约为菌体的1/2，具有较弱的折光现象。
说明不同细菌的芽孢形态存在差异。
六、实验结论通过本实验，我们掌握了细菌芽孢鉴别的实验方法，包括染色、观察和比较。
芽孢染色实验注意事项一、实验前准备1.实验室环境：芽孢染色实验需要在无菌条件下进行，因此实验室应保持清洁、干燥、无尘、无菌的状态。
2.培养基制备：芽孢染色实验需要使用特定的培养基，如液体营养琼脂培养基或固体营养琼脂培养基等，需要提前准备好。
3.器材准备：需要准备好显微镜、移液器、吸管、灭菌铁针等器材，并对其进行灭菌处理。
二、样品采集与处理1.样品采集：样品可以是土壤、水源或食品等，需要选择新鲜的样品，并在取样时避免污染。
2.样品处理：将样品放入无菌容器中，在合适的温度和湿度下进行预处理，如加热灭菌或过滤等方法。
三、芽孢染色操作1.制片技巧：制片时要注意避免空气污染和交叉污染。
制片前要将玻片和盖玻片用96%乙醇消毒，并在制片台上进行操作。
2.固定技巧：芽孢染色需要使用热固定法或甲醛固定法，需要掌握好固定的时间和温度。
3.染色技巧：芽孢染色需要使用马来酸铵水解法、甲醛溶液染色法或热染色法等方法，需要严格按照操作步骤进行。
四、结果判读与分析1.观察技巧：观察时要注意调节显微镜的倍数和焦距，以便清晰地观察细胞形态和颜色变化。
2.结果判读：根据颜色和形态等特征，可以判断出芽孢的种类和数量，并进行统计分析。
3.实验记录：实验过程中要认真记录每一步操作的细节和结果，以便后续分析和比较。
五、实验安全注意事项1.实验前应做好防护措施，如佩戴手套、口罩等防护用品，并将头发束起来。
2.实验过程中要注意避免接触有毒有害物质，如甲醛等化学药品。
3.实验后要及时清洗器材并进行消毒处理，避免交叉污染。
六、实验结果分析与应用1.根据实验结果可以分析出芽孢的生长条件和繁殖规律，为后续的研究提供参考。
2.芽孢染色实验可以应用于微生物学、食品卫生等领域，对于检测和控制微生物污染具有重要意义。
3.实验结果还可以为环境保护和农业生产等领域提供科学依据，促进可持续发展。
土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法一、实验目的1.学习掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理1.细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
2.芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色又难以脱色这一特点而设计的。
3.所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而更能明显地衬托出芽孢，便于观察。
4.染色方法：改良后的Schaeffer-Fulton氏染色法三、实验仪器及材料1.菌种：枯草芽孢杆菌2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液3.仪器或其他用具：Eppendorf管架、载玻片、显微镜、电磁炉、搪瓷杯等。
四、实验步骤1.制备菌悬液：在EP管中滴两滴生理盐水，挑取2-3环菌苔加入到含生理盐水的EP管中，混合均匀。
2.染色：在EP管中滴加2-3滴孔雀绿染液，盖紧EP管，将EP管插入浮筏中，放进沸水中加热15-20分钟，加热过程需要有人看护，随时控温，防止沸水进入EP管。
3.涂片固定：取半滴经孔雀绿染色的菌悬液在载玻片的中央，用接种环将菌液涂抹均匀，将载玻片用法电风机冷风吹干，经过酒精灯火焰固定三次。
4.脱色：待玻片冷却后，水洗脱色。
5.复染：滴加数滴0.5%番红水溶液在菌膜上，染色2min，再水洗。
6.镜检：将晾干后放在显微镜下观察。
五、实验结果结果描述：大部分菌体被染成红色，少部分被染成绿色，说明有芽孢产生，但是芽孢的数量没有菌体多，芽孢被染成绿色，菌体被染成红色，由绿色芽孢的外面还包裹着一层淡红色带可知，该芽孢是内生芽孢，芽孢呈椭圆形，位于菌体的中央，是中央生的芽孢，同时可以观察到枯草芽孢杆菌的大小比平常的小得多。
芽孢染色液(Moeller 法)简介：细菌是否有芽孢以及芽孢的形状和位置都是细菌的重要特征，细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂、致密、通透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。
芽孢有很强的抗热和抗化学物质的特性，当采用碱性染料并加热或延长染色时间时，使菌体和芽孢都能着色，再用蒸馏水冲洗脱去菌体颜色，但芽孢的颜色仍然可以保留，可以在显微镜下明显区分芽孢和营养体的形态。
Leagene 芽孢染色液(Moeller 法)主要由石炭酸染色液、Moeller 亚甲蓝染色液、Moeller 脱色液组成，芽孢会被染成红色，菌体呈红色，操作简单，结果判断更可靠。
但应注意，观察芽孢应在成熟期，但也不能过久，否则只能看到芽孢，而营养体已经消失。
该染色液仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。
组成：自备材料：1、 酒精灯2、 载玻片3、 蒸馏水4、 接种环5、 显微镜操作步骤(仅供参考)：1、 在洁净无油脂的载玻片上滴加1滴蒸馏水。
2、 用接种环挑取少许巨大芽孢杆菌斜面的菌体，与蒸馏水混合。
3、 制成涂片，自然干燥。
4、 在涂液处滴加石炭酸染色液，使细菌分布均匀，并用弱火加热，使染色液冒蒸汽，冷后水洗。
5、 Moeller 脱色液脱色编号 名称DM0028 3×20mlDM0028 3×50mlStorage 试剂(A): 石炭酸染色液 20ml 50ml RT 避光 试剂(B): Moeller 脱色液 50ml 100ml RT 试剂(C): Moeller 亚甲蓝染色液 20ml50ml RT 避光使用说明书1份6、用水轻轻冲洗。
7、用Moeller亚甲蓝染色液复染，用水冲洗。
8、镜检：干燥后镜检，观察芽孢的形状、大小，在菌体中的位置以及是否使菌体胀大。
染色结果：芽孢红色菌体蓝色附注：镜检应注意观察：形态圆形或卵圆形位置中央，末端，次末端大小菌体细胞是否膨大注意事项：1、玻片应洁净，无油污。
2、芽孢形成于生长发育期，观察芽孢应在成熟期，但也不能过久，否则只能看到芽孢，而营养体已经消失。
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色1.一、目的要求学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料菌种：金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕大肠杆菌〔〕试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是 1884年由丹麦病理学家ChristainGram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革染氏染色的根本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保存初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。
革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保存在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤1. 细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
制片：取菌种培养物常规涂片、枯燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。
以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。
2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。
3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。
4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。
以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。
