免疫电泳技术课件

免疫电泳技术将可溶性抗原（如人血清蛋白）与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。

如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。

根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。

抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。

不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。

所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。

抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。

只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。

当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。

若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。

在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。

如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。

这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。

在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。

此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。

抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。

图1的位置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。

这种结合也是相当稳定的。

在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。

第二章免疫电泳技术（Immunoelectrophoresis technique）一、基本概况（一）原理蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。

每种蛋白质都有它自己的等电点。

等电点的高低取决于蛋白质的性质，在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。

在pH大于等电点溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。

反之，在pH小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。

这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。

带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度，取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。

（二）影响电泳的因素不同带电质点在同一电场中的迁移率（或泳动度）不同，影响迁移率的因素有：①带电质点的性质：即颗粒所带净电荷的量，颗粒大小及形状等。

带电荷越多，分子越小，泳动速度越快；②电场强度：电场强度是单位厘米的电位差。

电场强度越大，带电质点泳动速度越快。

反之亦然；③溶液中pH值：溶液的pH值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。

对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。

反之则越慢。

蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白一般都带负电荷；④溶液的离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。

血清电泳一般最适宜离子强度在0.025～0.075之间。

离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。

离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。

溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。

μ=1/2∑CZ2(μ为离子强度，C为克分子浓度，Z为离子的价数)；⑤电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。

第七章免疫电泳技术本章考点1.概述2.免疫电泳技术3.应用免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。

第一节基本原理一、原理免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。

它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。

由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。

当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。

影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。

二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。

在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。

在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。

电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。

影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。

三、常用载体有琼脂和琼脂糖凝胶。

其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。

第二节常用技术免疫电泳常用技术有：1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。

在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。

通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。

本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。

免疫电泳技术一、概念免疫电泳技术是将凝胶内的沉淀反应与蛋白质电泳相结合的一项免疫检测技术，其实质是在直流电场中让抗原与抗体在凝胶中快速定向扩散，根据沉淀线（环）的有无，判断样品中有无与诊断抗体（或抗原）对应的抗原（或抗体）。

免疫电泳技术具有灵敏度高、分辨力强、反应快速和操作简便等特点。

二、基本原理将抗原抗体凝胶扩散系统置于直流电场中，在电流作用下，抗原及抗体向异相电荷的电极快速泳动，缩短了两者结合时间，加快了沉淀现象的产生。

免疫电泳的主要影响因素如下。

1、抗原与抗体特性：抗原或抗体的泳动速度与其所带静电荷量、分子量几物理形状等有关，静电荷量越多、颗粒越小，电泳速度越快，反之越慢。

在同一电场中，单位时间内个种带电粒子的移动距离称电泳迁移率。

当有多种带电荷的蛋白电泳时，由于静电荷量不同而区分成不同区带，得以区分不同的抗原抗体复合物。

2、电场因素：电场强度、溶液PH、离子强度、电渗现象（是指在电场中水对固相介质的相对移动，不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置）等。

三、免疫电泳技术（双向）1、对流免疫电泳是将双向琼脂扩散试验与电泳相结合的定向免疫扩散技术。

在琼脂板上打两排孔，在负电极侧的各孔内加入待检抗原溶液，在正电极侧的各孔内加入诊断抗体溶液。

在电场中，在缓冲液为PH8.6中，蛋白质抗原与抗体IgG均带负电荷，应都向正极泳动，与受电渗作用影响的水流方向（向负极流动）相反。

但由于抗原等电点较低（pI4~5），在电场中带净负电荷数量较多且分子量相对较小，能克服逆向水流作用保持向正极泳动；而IgG由于等电点较高（pI位6~7）带净负电荷较少且分子量大，不能克服逆向水流作用，因而顺水流方向朝负极泳动，致使抗原和抗体在电场中相向泳动。

如果抗原与IgG对应，可在相遇的最适比例处形成沉淀线。

对流免疫电泳敏感度比双向扩散试验高8~16倍，可测出ug/L量的蛋白质。

2、火箭免疫电泳火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。