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免疫学免疫血清学技术课件

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免疫学课件——第七章 血清学反应

免疫学课件——第七章 血清学反应

免疫学原理与技术
5.血清学反应的影响因素 电解质:抗原与抗体的反应需要在适当浓 度的电解质参与下,才出现可见反应.血清学反 应一般用生理盐水作稀释液,但禽类血清需用 8-10%的高渗氯化钠溶液. 温度:通常用370C水浴中,有的补体结合反 应在冰箱低温结合效果更好. pH:血清学反应常用的pH为6-8,过高或过 低的pH可使抗原抗体复合物重新解离.如pH 降至抗原或抗体的等电点时,可引起非特异性 的酸凝集,造成假象.
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2.结合力和离解力 抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结 合,是分子表面的结合,这一过程受物理化学,热 力学的法则所制约,结合的温度应在0-400C范 围内,pH在4-9范围内,如温度超过600C或pH降 到3以下时,则抗原抗体复合物又可重新解离. 3.抗原抗体的结合比例 抗原与抗体的结合常需要适当的比例才出 现可见的反应,在最适比例时,反应最明显. 带现象:如抗原过多或抗体过多,则抗原抗 体的结合不能形成大的复合物,抑制可见反应 的出现. “格子学说”
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三.血清学反应的应用 1.抗原或抗体的快速检测 2.生物活性物质的超微量测定 3.抗原或抗体在细胞和亚细胞水平的定位 4.抗原组成的分析 5.微生物鉴定和抗原分型 6.血型鉴定
免疫学原理与技术
四.血清学试验的发展趋向 技术上要求高特异性,高敏感性,高分辨率, 精密定位,简易快速;在方法上要求微量化,自动 化,标准化;试剂上要求商品化.
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二.血清学反应的一般特点 1.特异性和交叉性 如肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌 Ab1 Ag1
Ab2 Ag2 交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据 关系数R R=√r1 *r2 x 100%
免疫学原理与技术

第5章--免疫血清学检验技术PPT课件

第5章--免疫血清学检验技术PPT课件

高，约为10μg／ml2。021
32
2021
33
（四）火箭电泳 Rocket Electrophoresis
又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电
泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体
的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时
间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，
沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特
96000
14 2021 Dy3+-PTA
1000 51
3、信号增强作用
Eu3+标记 的抗原-抗 体复合物
pH<4
Eu3+ 解离
结合 β-二酮体
荧光 增强
固相双抗体夹心法原理示意图
2021
52
4、双抗体夹心法
固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物
在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发
光下发射613nm荧光。2021
53
5、固相抗体竞争法
待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体 竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧 光增强液,测定荧光强度，荧光强度与 待检抗原含量成反比。
2021
54
6、固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的 Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加 入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度 与待检抗原含量成反比。
22
（二）间接Coombs试验
检测血清中的2021不完全抗体
23
六、沉淀反应 precipitation reaction
可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清
蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一
定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和
温度)下，经一定时间，于比例合适处形

免疫学实验技术培训课件

免疫学实验技术培训课件
质
免疫学实验技术
15
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（免l疫a学实t验t技ic术e theory） 16
三.血清学试验的优越性
• 1、特异性强，敏感性高 • 2、检样量少，预处理简单 • 3、试验方法多，功能各异，可择优选用 • 4、方法简易快速 • 5、可用于抗原或抗体的定位
免疫学实验技术
9
补体结合反应
检测病毒
免疫学实验技术
10
溶血
+
—
免疫学实验技术
11
4.沉淀反应 (precipitation)
• 沉淀反应是指可溶性抗原（细菌培养滤液 、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与 相应抗体在液相中特异结合后，形成的免 疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。
• 反应中的抗原称为沉淀原，可以是类脂、 多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素。
免疫学实验技术
26
抗体的免疫原性
马血清制备的 破伤风毒素
免疫学实验技术
27
一抗和二抗
一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检 测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出 来的。
二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标 记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团）， 作用是检测一抗。
当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚
至纳克水平上对其进行定量。
免疫学实验技术
23
免疫酶技术分为两类： 免疫酶组织化学法或免疫酶染色法
免疫酶测定法： 固相免疫酶测定法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 应用最广泛
免疫学实验技术
24
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）

血清学实验技术课件

血清学实验技术课件
•本质：间接凝集试验
•原理：不完全抗体(单价抗体)与颗粒抗原结合不出现可见凝集反应，用单价抗体免
疫动物,将获得的抗抗体与结合有单价抗体的颗粒载体混合，出现可见的凝集反应 •应用：初生动物自身免疫溶血性贫血诊断，布氏杆菌病的不完全抗体检测，抗组织细 胞不完全抗体的检测
Step 1 Step 2
+
不完全Ab
原分析和疾病诊断的基础；但不同微生物的 部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出现 交叉反应，后者是区分血清型或亚型重要依 据
• 结合比例:抗原抗体结合在比例适当时才出现 明显可见反应,抗原或抗体过多可抑制可见反 应,称为带现象
• 可逆性:抗原抗体结合力与非共价键性质、数
量和距离有关,形成的复合物可以解离, 离解 常数(K)反映抗体与抗原之间的亲合力,高亲
=
颗粒性抗原 如：RBCs
+
=
Anti-AbFc
第14页，幻灯片共36页
沉淀试验分类
液体沉淀试验 沉淀试验
凝胶内沉淀试验
絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳
第15页，幻灯片共36页
环状沉淀试验
• 在小口径玻璃管内进行 • 主要用于抗原的定性检测(如诊断
• 分类 • 凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原或与颗粒性载体
（红细胞、乳胶等）结合的可溶性抗原与相应抗体结合， 在电解质参与下形成肉眼可见的凝集团块 • 沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与 下形成肉眼可见的沉淀物
第8页，幻灯片共36页
凝集试验分类
直接凝集性试验 凝集性试验 间接凝集性试验
(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)

第五章 血清学反应 免疫学课件

第五章 血清学反应 免疫学课件
(2) 结果：阳性---类似粉笔沫样凝集物漂浮澄清液滴中；
阴性----无凝集物，液滴浑浊。
2020/7/6
（3） 用途意义：
① 用已知抗体诊断抗原（病原） ② 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存
在相应抗体，进行流行病学调查。
常用于布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验 。
2020/7/6
2020/7/6
三、免疫标记技术
（一）原理：抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子
小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将荧光素、酶分 子、胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上，可以通过检测标记 分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性 和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术。
标记免疫技术一般分为两类： （1）免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)： 用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 （2）免疫测定(immunoassay)：用于液体标本中Ag或Ab 的测定。
2020/7/6
第二节 沉淀反应
2020/7/6
一、沉淀反应概述
（一）原理： 可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒
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（3）用途意义： 是一种定性与定量相 结合的方法。用已知抗原检测待测血清中 是否存在相应抗体和测定该抗体的含量。
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（二）、间接凝集试验 1、原理：将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、
一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗粒)的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝 集反应称为间接凝集反应。吸附抗原称为正向；吸附抗体称为反向。
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免疫学课件：免疫血清学技术

免疫学课件：免疫血清学技术
抗体分子上具有特殊功能的区域，包括Fab段和 Fc段。Fab段负责与抗原结合，而Fc段则与效应 细胞或分子相互作用。
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。
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检测机体血液中的T细胞数量 • E玫瑰花环试验 • T细胞酸性α醋酸萘酯酶测定 检测机体血液中T细胞转化功能 • 淋巴细胞转化试验 • 巨噬细胞移动抑制试验 • T细胞活化试验
第3节 血清学技术的应用及发展
• 疫病诊断
趋势
• 动植物生理活性物质研究
• 物种及微生物鉴定
• 动植物形状的免疫标记
• 生物制品研究
• 应用：用AbF检测抗原 （定性、定位）
• 特点：敏感，需荧光显微镜
免疫酶标记技术
• 原理： • 常用标记酶：辣根过氧化物酶（HRP） • 酶标抗体的制备：抗原免疫动物 抗体提取
IgG标记（戊二醛法、过碘酸钠法）标记抗体 的提纯标记抗体的鉴定 • 常用免疫酶技术：免疫酶组织化学染色技术、酶 联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试 验（Dot-ELISA） • 应用：
电解质
可溶性抗原 +免疫血清 出现沉淀现象
(血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合
沉淀原
沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象
容易过多
后带现象
（稀释）
• 环状沉淀试验 • 双向单扩散（辐射扩散） • 双向双扩散 • 免疫电泳 • 对流免疫电泳 • 火箭免疫电泳
环状沉淀试验 原理：小试管内，下层沉
淀素与上层沉淀原 在界面应，形成白 色沉淀环。 用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验）
放射免疫分析
• 原理：竞争性RIA 固相夹心RIA Ag*(F)+Ab Ag*-Ab(B)
+ Ag
Ag-Ab 标记用同位素：3H、125I、32P、35S 常用方法：液相放射免疫测定、固相非竞争放射 免疫测定 应用：用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定
中和试验（病毒、毒素中和试验）
原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感
• 致病机理研究
• 分子生物学研究
• 发展趋势
第14章 凝聚性试验
第1节 凝集试验
• 直接凝集试验：颗粒性抗原 • 间接凝集试验：间接血凝实验、乳胶凝集
试验、炭素凝集试验
• 直接凝集试验：颗粒性抗原
基本原理：
电解质
颗粒性抗原 + 相应抗血清
抗原颗粒凝集
(细菌、红细胞)
比例适合
凝集原
凝集素
过多
前带现象
FMDV+抗血清 IB-RS-2单层细胞 细胞无病变CPU
用途：
1.用已知血清鉴定病毒——诊断病毒病 2.用已知病毒检测血清抗体——诊断病毒感染
，测定病毒免疫血清效价（中和价）
免疫检测新技术
• SPA免疫检测技术 • 免疫胶体金检测技术：免疫胶体金光镜染
色法、免疫胶体金电镜染色法、胶体金免 疫层析法等 • 免疫转印技术 • 免疫核酸探针技术
免疫荧光抗体技术
• 原理： 异硫氰酸荧光素（FITC）
原理：荧光素（F）+ Ab
AbF(FITC)
AbF + Ag Ag- AbF 紫外光 Ag- AbF
• 标记抗体的制备：抗原免疫动物 抗 体提取IgG标记标记抗体的提纯 标记抗体的鉴定
• 荧光抗体染色：标本制备染色（直接 法、间接发）
细胞免疫技术
一．E玫瑰花环试验 原理：人、猪、牛、羊等的T细胞膜上的CD2
是绵羊红细胞受体，马、猪的T细胞膜上的 CD2是豚鼠红细胞的受体。
E花环
T细胞的E玫瑰花环试验
二. 酸性α醋酸萘酯酶测定 原理：酸性α醋酸萘酯酶
醋酸萘酯
α萘酚+醋酸离子 +
六偶氮副品红
红色反应物
+ 甲基绿
红黑色颗粒 • 用途：1.鉴别T、B细胞；2.血液中T细胞计数
（稀释血清）
• 方法：玻片法、试管法、微量法
间接凝集试验：基本原理 • 可溶性抗原（或抗体）+惰性载体（聚苯乙
烯乳胶微粒、炭粒、绵羊红细胞等） 抗 原（或抗体）致敏载体
• 抗原（抗体）致敏载体+相应抗体（或抗原 ） 被动载体凝集（间接乳胶凝集、间接炭 素凝集、间接红细胞凝集等 ）
第2节 沉淀实验
第1节 免疫血清学技术概述
• 免疫血清学技术类型：凝集试验、沉淀试 验、标记抗体技术（免疫荧光抗体技术、 免疫酶标记技术、放射免疫测定）、中和 试验等
血清学反应的一般特点
• 特异性和交叉性 • 抗原与抗体结合机理 • 血清学反应的影响因素：电解质、温度、
酸碱度
带现象：前带 后带
第2节 细胞免疫检测技术
PHA+T细胞+3H-TdR
PHA+T细胞
转化
淋巴母细胞
转化淋巴母细胞（掺入3H NhomakorabeaTdR）
（无3H-TdR掺入）
液体闪烁仪测掺入 3H-T的脉冲数CPM
测CPM
计算转化刺激指数SI=试验管CPM/对照管CPM 特点：准确，需昂贵的闪烁仪
三．淋巴细胞转化试验 （一）形态学试验法 原理：PHA+T细胞（有PHA受体）
转化
大的淋巴母细胞
显微镜观察计算转化率
转化率=(过渡型细胞+母细胞)/200个淋巴细胞×100%
特点：简便，准确性较差
T细胞受PHA作用转化后的形态示意图
30
（二）3H胸腺嘧啶核苷（3H-T）掺入法
原理：
试验管
对照管
染易感动物、鸡或鸭胚、细胞活性
例1
-NDV
9～11d鸡胚
24～48h鸡胚死亡
-NDV+抗血清 9～11d鸡胚 鸡胚不死亡
例2
口蹄疫病毒(FMDV)
4～7d乳鼠
乳鼠死亡
FMDV+抗血清
4～7d乳鼠
乳鼠不死亡
例3
FMDV 仔猪肾传代细胞(IB-RS-2)单层细胞 细
胞病变(CPU)：变圆、成串、空泡、变形、脱落、裂解