凝胶过滤层析

凝胶层析的研究及其应用凝胶层析是一种常见的分离和纯化生物大分子的技术方法，广泛应用于生物化学、分子生物学、生物医学等领域。

本文将介绍凝胶层析的研究及其应用。

一、凝胶层析的原理和分类凝胶层析是利用凝胶作为分离介质，根据生物分子在凝胶中的分子大小、形状和电荷差异，通过毛细管效应和几何阻滞效应实现生物大分子的分离和纯化。

凝胶层析可分为凝胶过滤层析、凝胶吸附层析和凝胶电泳层析三种主要方法。

1.凝胶过滤层析：根据生物分子的大小和孔径大小的选择，将较大的生物分子滞留在凝胶中，而较小的生物分子则通过凝胶颗粒。

常用的凝胶过滤介质有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

2.凝胶吸附层析：根据生物分子与凝胶吸附剂（如离子交换剂、亲和吸附剂）之间的亲和性差异，实现生物分子的分离纯化。

常用的凝胶吸附介质有离子交换凝胶、亲和性凝胶等。

3.凝胶电泳层析：根据生物分子的电荷差异，在电场作用下，通过凝胶孔隙内的离子迁移实现生物分子的分离。

常用的凝胶电泳介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。

二、凝胶层析的研究进展凝胶层析技术的研究中涉及到凝胶材料的制备与改性、凝胶层析流程的优化和成像技术的发展等方面。

1.凝胶材料的制备与改性：为了提高凝胶分离效果，研究人员常对凝胶材料进行制备和改性。

如调控凝胶孔隙大小、凝胶表面的亲和性等。

同时，还探索了新型的凝胶材料，如纳米凝胶和水凝胶。

2.凝胶层析流程的优化：凝胶层析的分离效果受到多种因素的影响，包括凝胶浓度、缓冲液pH值、离子浓度和柱床尺寸等。

因此，优化凝胶层析流程能够提高分离效率和纯化效果。

3.成像技术的发展：凝胶层析结合成像技术能够实时观察分离过程中的分子分布，提供有关分子大小、形状和电荷的信息。

如蛋白质凝胶电泳的银染色、荧光标记和质谱等技术的应用。

三、凝胶层析的应用凝胶层析在生物化学、分子生物学和生物医学等领域广泛应用于分离和纯化生物大分子。

1.蛋白质纯化：凝胶层析可以根据蛋白质的大小、电荷和亲和性等特性进行分离。

凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。

(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。

蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。

注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。

(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。

(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。

2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。

该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。

凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。

离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。

凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。

通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。

凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。

【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。

本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。

（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。

（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。

（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。

可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。

多洗几次，尽量洗干净。

自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。

充分溶胀后，进行真空脱气。

（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。

（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。

（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。

（8）上样：上样量在5%~10%。

（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。

三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。