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第四章植物组织培养的基本方法外植体的选择外植体灭菌方法外植体接种，培养培养物污染原因和预防措施外植体褐变及其防止玻璃化现象及其预防第一节外植体选择1、外植体部位不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应不一致2、取材季节大多数植物，应在生长开始的季节采样3、器官或组织的生理状态，发育年龄幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力4、材料大小茎尖培养中，外植体越小成活率越高外植体的两种类型：A.带芽的外植体如茎尖和侧芽B.分化的组织：茎段，叶，根，花瓣等第二节外植体灭菌方法要去除材料上的微生物，又不能伤及材料。
1、常用灭菌剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解。
应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡。
一些表面消毒剂的消毒效果。
乙醇（70%—75%）、次氯酸钠溶液（0.5%—10%）、升汞（0.1%—1%）、抗生素类杀菌剂等。
外植体消毒步骤如下：取外植体自来水冲洗70%酒精表面消毒30s后无菌水冲洗消毒剂处理（在消毒液中加入几滴表面活性剂）无菌水冲洗干净备用一般可将材料冲洗干净后，放入70%酒精中数秒，用无菌水冲洗后再放入升汞（1—10min）或次氯酸钠中（5—30min）消毒。
再用无菌水反复冲洗四、五遍，可达到灭菌目的。
不同植物不同部位都有各自的特点，即使同样的植物组织，由于栽培条件或季节不同，污染情况也不同。
灭菌方式也有所差异。
可参照相似植物的灭菌或是通过实验得到最适灭菌方式。
1.外植体表面灭菌从室外带回来的材料．除去一些不必要的部分．洗去泥土．然后用皂液或洗衣粉及消洗灵浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗材料，然后剪成适宜的大小，再行深灭菌。
通过表面灭菌可清除许多杂菌，如在马蹄莲根茎的离体培养中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几层包庇物，流水冲洗1小时，可把杂菌清洗掉60％左右（Merel LG, 1998）。
外植体的深灭菌通过外植体表面灭菌后，仍有一部分杂菌存在于材料表面或内部，必须经过更深层次的的灭菌处理如加消毒药剂、抗生素、水浴、灼烧等措施才能获得不带菌的外植体。
实验二外植体的消毒接种与培养一、实验目的本次实验主要是为了掌握外植体的消毒、接种和培养技术，了解外植体的形态特征和生长规律，为后续的组织培养和基因转化提供基础。
二、实验原理1.外植体的消毒外植体是指从植物细胞或组织中切取的一小段或一小块，应用于外植体培养中。
外植体在切取和处理过程中容易受到细菌和真菌的污染，所以需要对外植体进行消毒处理。
消毒方法分为物理消毒和化学消毒两种。
物理消毒主要是利用高温烤过或微波消毒，化学消毒则是利用消毒剂进行消毒。
本实验中，我们采用化学消毒的方法，使用70%酒精和0.1%次氯酸钠溶液进行消毒处理。
接种是指将消毒好的外植体移植到培养基上，进行生长和分化。
接种需要注意接种时间、接种方式和接种密度。
外植体的培养主要依靠培养基和培养条件的控制。
培养基的配制和不同植物种类、发育阶段和培养目的有关。
培养条件主要包括光周期、光强度、温度、湿度等。
对不同植物种类和培养阶段，要采取不同的培养条件进行调整。
三、实验操作1. 实验材料和设备氧化锌瓶、脱脂棉、酒精棉球、玻璃针、外植体、琼脂、MS基本培养基、10%蔗糖溶液、0.8%琼脂糖、0.1%次氯酸钠溶液、高温烤箱、显微镜、组织取片剪刀、组织取片镊子。
2. 实验步骤（1）消毒外植体的消毒是外植体培养中的一个必要步骤。
将外植体放入脱脂棉盒中，加入70%酒精或0.1%次氯酸钠溶液进行浸泡消毒，时间一般为3-5分钟。
消毒后用脱脂棉纸吸干余液，进行无菌操作。
（2）接种将已消毒好的外植体用组织取片剪刀分割成2-3mm长的段，将其移植到琼脂中，培养基为MS基本培养基，添加10%蔗糖和0.8%琼脂糖。
接种时注意切口与琼脂接触，并尽量避免外植体处于吸水的状态，以减少周围细胞破裂。
（3）培养将已接种好的外植体置于温度适宜、光照强度适中的培养箱内，在合适的光周期下进行培养，并观察外植体的生长状态。
观察时应注意以下几点：①外植体的生理状况：生长慢、残缺、干瘪、腐烂、出现菌丝等表明外植体存在刺伤、污染等问题。
