啤酒酵母纯种分离

啤酒发酵酵母扩培学习资料啤酒厂获得接种酵母的方式有三种方式，其优缺点见图2.1：这三种方式是：购买酵母泥；购买纯种酵母；自己保存和培养纯种酵母。

图2.1 啤酒获得酵母的方式和其优缺点第一节纯种酵母的培养一、培养啤酒纯种酵母工艺原理酵母是一种兼性微生物，这就是说，细胞的新陈代谢和繁殖即可以在有氧的状态下也可以在无氧的状态下进行。

啤酒酵母菌的的繁殖过程分为四个阶段（见图2.7）：1．迟缓期：在此期间，虽有营养物质存在，但酵母基本不繁殖；2．对数生长期：此期间酵母繁殖最为迅速；3．稳定期：此时，代谢产物CO2和酒精的积累使酵母繁殖逐渐变慢，活菌数最高；4．衰亡期：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，酵母菌死亡率增加，活菌数减少。

酵母培养中，最重要的阶段是对数生长期，此时的营养、氧气供给及其他条件如：酵母细胞浓度和温度都必须达到最佳。

酵母由于不断地消耗氧气，必须连续通入足够的无菌空气。

因为氧气缺乏时，其中一部分酵母会进行发酵，从而产生CO2和酒精，而不是产生新细胞，这样生成的有活力的细胞数就减少了。

二、啤酒纯种酵母的分离培养啤酒酵母的分离培养就是利用特殊的分离技术，将优良强壮的单细胞酵母从原菌中分离出来，加以扩大培养，供生产使用。

分离培养的方法很多，工厂常用的是平板分离法或划线分离法。

获得原菌的方法：（1）从实验室保存的原菌种中分离，原菌种必须先经过几次培养活化的再行分离；（2）从生产中的酵母泥或主发酵液中分离。

1．平板分离培养法（又称稀释分离法，见图2.2）这种方法简单易行，适合于工厂现场使用。

先将盛有麦汁的琼脂试管培养基放在热水中融化，冷却至42～45℃，再将准备分离培养的酵母原菌用白金针移植到已融化的培养基内。

如分离培养发酵液的酵母，则先使之静置，倾出上部清液，留少量发酵液，混合均匀后接种。

如分离培养酵母泥，需加少量无无菌水或麦汁，稀释后再接种。

将分离培养的酵母移植于融化的培养基内后，充分振荡，使混合均匀，用白金针从该试管挑少许移植到第2支试管中，随即将第1支试管中的培养基倾注在已灭菌的培养皿中，均匀分布在培养皿底面，使之凝固。

酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。

以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。

采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。

2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。

在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。

3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。

4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。

酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。

5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。

这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。

6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。

7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。

在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。

在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。

此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。

在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。

２００７Ｎｏ．１ＳｅｒｉａｌＮｏ．１６６ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ在啤酒生产过程中，酵母的纯种培养和纯种发酵对啤酒的质量至关重要。

但实际生产中啤酒厂的酵母一般要连续使用多代，在循环使用过程中很容易染菌。

乳酸菌是最容易污染、且危害较大的细菌。

当使用受到乳酸菌污染的酵母进行啤酒发酵时，会导致啤酒产生丝状浑浊、酸味增加、双乙酰超标等质量问题。

因而对酵母定期进行微生物检测、控制乳酸菌的污染是非常重要的。

本文对种酵母中存在的乳酸菌进行了分离和初步鉴定。

１材料与方法１．１材料１．１．１样品连续使用５代以上的种酵母：取自济南某啤酒厂。

１．１．２培养基ＵＢＡ固体培养基：酵母膏６．１ｇ，蛋白胨１５ｇ，葡萄糖１６ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．３１ｇ，ＫＨ２ＰＯ４０．３１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１２ｇ，ＮａＣｌ０．００６ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．００６ｇ，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ０．００６ｇ，番茄汁２４４ｍＬ，啤酒２５０ｍＬ，琼脂２０ｇ。

蒸馏水定容至１０００ｍＬ，ｐＨ６．０。

改良ＵＢＡ固体培养基：ＵＢＡ固体培养基中加入２％ＣａＣＯ３。

用来分离种酵母中的乳酸菌。

ＰＹＧ培养基：蛋白胨０．５ｇ，胰酶解酪朊０．５ｇ，酵母膏１．０ｇ，葡萄糖１．０ｇ，盐溶液４．０ｍＬ，蒸馏水１００ｍＬ，ｐＨ值自然。

用来测定乳酸菌发酵葡萄糖产乳酸的情况。

盐溶液成分：无水ＣａＣｌ２０．２ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．４８ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ，ＮａＨＣＯ３１０ｇ，ＮａＣｌ２．０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。

麦汁培养基：将粉碎的粗麦芽与水按１：４在６３℃水浴中保温１ｈ，升温至６５℃继续保温１ｈ，至碘检无色。

糖化醪用纱布过滤，向滤液中加入３０ｍＬ／Ｌ麦汁澄清剂，煮沸３０ｍｉｎ后过滤，麦汁糖度调至１２°Ｐ。

麦汁培养基用来测定低温下乳酸菌的发酵产酸性能。

１．２方法１．２．１乳酸菌的分离纯化以无菌操作取２５ｇ酵母泥于装有２２５ｍＬ无菌生理盐水的５００ｍＬ三角瓶中，振荡均匀。

1. 学习微生物分离纯化的基本原理和方法。

2. 掌握酵母菌的分离纯化技术。

3. 观察酵母菌的形态和培养特征。

二、实验原理酵母菌是一种单细胞真菌，广泛存在于自然界中。

本实验通过平板划线法将混合菌液中的酵母菌分离纯化，并在适宜的培养基上培养，观察其形态和特征。

三、实验材料1. 菌种：啤酒酵母菌2. 培养基：酵母膏葡萄糖琼脂培养基（YGA）3. 工具：接种环、酒精灯、无菌试管、无菌棉签、培养皿、显微镜等四、实验方法1. 菌种活化：将啤酒酵母菌菌种接种于YGA培养基中，在28℃恒温培养箱中培养24小时。

2. 分离纯化：取活化后的酵母菌菌液，用无菌棉签涂布于YGA平板上，用接种环进行平板划线，划线时注意不要划破菌落。

将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养24小时。

3. 观察与计数：观察平板上的菌落，记录菌落形态、大小、颜色等特征。

用无菌棉签挑取单个菌落，接种于新的YGA平板上，重复上述操作，直至获得纯化的酵母菌。

4. 酵母菌形态观察：将纯化的酵母菌接种于YGA培养基中，在28℃恒温培养箱中培养24小时，用无菌吸管吸取少量菌液，滴加于载玻片上，用无菌盖玻片覆盖，在显微镜下观察酵母菌的形态。

五、实验结果1. 菌落特征：酵母菌菌落呈圆形，表面光滑，湿润，边缘整齐，颜色为乳白色。

2. 酵母菌形态：酵母菌为单细胞，呈椭圆形或卵圆形，细胞核明显，细胞壁较厚。

1. 通过平板划线法，成功分离纯化了酵母菌，表明该方法适用于微生物的分离纯化。

2. 酵母菌在YGA培养基上生长良好，菌落特征明显，便于观察和识别。

3. 显微镜下观察酵母菌的形态，有助于了解其生物学特性。

七、实验结论1. 本实验成功分离纯化了酵母菌，掌握了酵母菌的分离纯化技术。

2. 通过观察酵母菌的形态和培养特征，了解了酵母菌的基本生物学特性。

3. 平板划线法是一种简单、有效的微生物分离纯化方法，适用于实验室研究。

八、实验注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作，防止杂菌污染。

酵母的分离和鉴定酵母的分离实验目的：应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。

实验原理：酵母能在较高温环境生长能，在50至70摄氏度快速生长；酵母菌常见于含糖分比较高的的环境中，如果园中的果皮表面，多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0，酵母菌生长迅速，容易分离培养。

在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。

因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。

实验器材和材料：苹果皮马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，分装三角瓶乳酸马铃薯葡萄糖培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，乳酸5ml，pH5.5，分装试管无菌培养皿，无菌水，显微镜，接种环，枪，美兰染液实验方法1、接种：取苹果皮，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用枪吸取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28°C-30°C培养箱中培养24h2、加富培养：用枪吸取上述溶液1ml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28°C-30°C培养箱中培养24h3、镜检：用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，在高倍镜下观察酵母菌的形态和出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用枪吸取0.1ml加富培养液到平板中，涂匀后培养24h5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。

6、镜检：挑取单菌落，制片观察形态酵母的鉴定实验材料：酵母菌种：分离的酵母菌菌种分离培养基：11°P无酒花麦汁琼脂培养基菌种斜面培养基：11°P无酒花麦汁琼脂培养基发酵麦汁：11°P普通麦芽汁硫酸钙缓冲液实验步骤：观察单菌落，选取生长快、菌落大小适中、洁净、有代表性的移入液体试管中→培养后划斜面→1级筛选→选出两个候选菌株同保藏菌种一起进行鉴定。

啤酒生产酵母菌株筛选技术摘要: 鲜啤酒以其独特的风味、营养、时尚而流行于都市生活。

啤酒酵母菌株的特性直接决定着鲜啤酒的质量,在生产中采用不同的菌株和生产工艺,可酿造出不同类型的啤酒。

根据实际经验,提出了啤酒生产酵母菌株分离的技术要点，并依此进行了啤酒生产酵母菌株的筛选。

.关键词：啤酒酵母；筛选啤酒发酵是一个复杂的生化过程：在啤酒酵母所含酶系的作用下，原麦汁会发生变化生成酒精、二氧化碳和其它的醇、醛、酯以及硫化物，这些发酵产物使啤酒具有独特的风味，决定着鲜啤酒的泡沫、色泽和稳定性等各项指标。

啤酒生产过程中，可能存在野生酵母菌的污染及生产菌种的自然变异和衰老，从而使菌种发生退化现象[1，2]。

菌种退化后,经常表现为[1]：（1）细胞形态变化、增殖不良、初始发酵缓慢；（2）发酵过程降糖慢、发酵度低；（3）双乙酰峰值升高；（4）酵母凝聚性变差、滤酒困难。

因此,如果继续使用已退化的菌种，就会影响鲜啤酒的质量。

为了保持产品的质量，稳定鲜啤独特的风味，需要定期进行生产菌种的分离和纯化工作。

虽然有人使用活性干酵母[3]，可免除啤酒生产中的分离工作。

但是要制造有自己特色的啤酒，应在生产时从自己啤酒原液中分离、纯化出的酵母进行酿制更佳。

故建立一套自己的酵母菌株筛选体系，每年进行1-2 次的生产用菌的分离、纯化。

当然，为了不影响旺季的销售，此工作最好在销售淡季时进行。

1 啤酒酵母菌株的分离与纯化1.1 啤酒酵母菌株的分离啤酒酵母菌株的选择，即分离筛选底物的选择，一般存在选择保藏菌株和生产菌株两种方法。

保藏菌株虽然能保护原有菌种的优良性能，减少污染杂菌的机会，但从中难以选育到有益的突变型菌株。

因此，积极的筛选方法应从生产中不断选育出有利于产品质量和风味的菌株。

根据经验，选用第三代酵母发酵中，发酵旺盛的高泡期发酵液，作为啤酒酵母菌株筛选样品，最为合适。

1.2 发酵液的处理在无菌条件下吸取发酵液10mL，放入无菌的100mL 麦汁中，以10 倍稀释法稀释，取后三种稀释液各1mL 分别置于无菌平皿中，每个稀释度作两个皿。

3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作米氏常数正交实验结果分析：啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验一、实验目的1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。

二、实验原理1、蔗糖酶的提取细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。

提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。

材料不同，破壁的方法也不同。

我们用的酵母菌细胞破壁方法有机械（匀浆）法、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法、溶胞作用(酶溶解法)、自溶法，本实验采用自溶法。

自溶法即将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

2、蔗糖酶的纯化（1）酶的蛋白属性①两性电离：蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

②等电点(isoelectric point, pI) ：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。

③大分子(胶体) : 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。

④稳定的因素: 颗粒表面电荷、水化膜（2）调节酶溶解度的方法；①改变离子强度；盐析、硫酸铵分级沉淀（反抽提法）反抽提法（Back Extraction）例：E.coli RNA聚合酶42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀通常方法：先33%-------再50%反抽提法：再42%将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。

啤酒酵母分离后的提取方法摘要：一、啤酒酵母的培养与分离方法二、从土壤中分离啤酒酵母菌的步骤三、啤酒酵母在生产中的应用四、酵母菌提取方法的探讨正文：一、啤酒酵母的培养与分离方法啤酒酵母，作为一种常用的发酵剂，在食品、饮料等行业中具有广泛的应用。

啤酒酵母的培养与分离方法主要有以下两种：1.直接从麦汁中培养：这种方法适用于啤酒厂家的生产过程中，目的是将酵母添加到麦汁中进行发酵。

在此过程中，培养基就是麦汁，无需进行酵母分离。

2.从土壤中分离：这种方法适用于研究或生产中需要特定酵母菌的情况。

通过从土壤中分离啤酒酵母，可以得到具有特定性状的酵母菌株。

二、从土壤中分离啤酒酵母菌的步骤1.配制适合酵母菌的选择培养基，如麦芽汁培养基或YPD培养基。

2.对土壤样品进行梯度稀释，首先配制几包9mL的生理盐水，对1g土壤样品进行稀释，一般稀释到6的梯度就可以了。

3.倒平板，分区划线，将稀释后的土壤样品均匀涂布在培养基表面，25℃培养2到3天。

4.挑选生长良好的菌落进行进一步纯化。

三、啤酒酵母在生产中的应用啤酒酵母不仅在啤酒生产中起到发酵作用，还具有以下应用：1.酿造：啤酒酵母用于麦汁的发酵，使麦汁中的糖分转化为酒精和二氧化碳，从而制成啤酒。

2.食品添加剂：啤酒酵母含有丰富的营养成分，如蛋白质、维生素和矿物质，可作为食品添加剂，提高食品的营养价值。

3.生物发酵：啤酒酵母还可用于生产其他发酵产品，如葡萄酒、果酒、腐乳等。

四、酵母菌提取方法的探讨酵母菌提取是酵母生产与应用的关键环节。

常用的提取方法有以下几种：1.机械法：通过离心、过滤等机械手段将酵母菌从培养液中分离出来。

2.沉降法：利用酵母菌与培养液的密度差异，使酵母菌自然沉降，从而实现分离。

3.浮选法：通过添加表面活性剂，使酵母菌聚集在一起，形成浮游颗粒，从而实现分离。

4.生物分离法：利用酵母菌与其他微生物的生物学特性差异，选择合适的分离介质和条件，实现酵母菌的分离。

综上所述，啤酒酵母的培养、分离与提取方法多种多样，可根据实际需求和应用场景选择合适的方法。

啤酒酵母的质量检查一、实验目的：学习酵母菌种的质量鉴定方法，二、实验原理：酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。

酵母活力强，发酵就旺盛；若酵母被污染或发生变异，酿制的啤酒就会变味。

因此，不论在酵母扩大培养过程中，还是在发酵过程中，必须对酵母质量进行跟踪调查，以防产生不正常的发酵现象，必要时对酵母进行纯种分离，对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。

三、实验器材与试剂：显微镜，恒温水浴，温箱，高压蒸汽灭菌锅，带刻度的锥形离心管等0.025%美兰（又称次甲基兰，Methylene blue）水溶液：0.025g美兰溶于100mL水中；pH4.5的醋酸缓冲液：0.51g硫酸钙，0.68g硫酸钠，0.405g冰醋酸溶于100mL水中；醋酸钾（钠）培养基：葡萄糖0.06%，蛋白胨0.25%，醋酸钾（钠） 0.5%，琼脂2%， pH 7.0。

四、实验步骤：1.显微形态检查载玻片上放一小滴蒸馏水，挑酵母培养物少许，盖上盖玻片，在高倍镜下观察。

优良健壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。

年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；衰老的细胞中液泡多，颗粒性贮藏物多，折光性强。

2.死亡率检查方法同上，可用水浸片法，也可用血球计数板法。

酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活力，可将兰色的美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色。

一般新培养酵母的死亡率应在1%以下，生产上使用的酵母死亡率在3%以下。

3.出芽率检查指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。

随机选择5个视野，观察出芽酵母细胞所占的比例，取平均值。

一般生长健壮的酵母在对数生长阶段出芽率可达60%以上。

4.凝集性试验对下面发酵来说，凝集性的好坏牵涉到发酵的成败。

若凝集性太强，酵母沉降过快，发酵度就太低；若凝集性太弱，发酵液中悬浮有过多的酵母菌，对后期的过滤会造成很大的困难，啤酒中也可能会有酵母味，凝集性可通过本斯试验来确证：将1g酵母湿菌体与10mL pH4.5的醋酸缓冲液混合，20℃平衡20分钟，加至带刻度的锥形离心管内，连续20分钟，每隔1分钟记录沉淀酵母的容量。