RD细胞复苏、传代、冻存

细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。

（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。

（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。

（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。

吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。

（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。

（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。

（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。

（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。

②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。

⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。

其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。

细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。

在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。

原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。

通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。

原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。

传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。

在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。

传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。

在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。

冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。

冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。

冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。

## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。

推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。

如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。

正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。

在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。

体细胞培养标准
体细胞培养标准操作主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。

一、细胞复苏
1.从冻存管中取出细胞，放入37℃水浴中迅速解冻。

2.将解冻后的细胞悬液转移至培养瓶中，用PBS清洗两次，以去除残留的冻存液。

3.加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。

4.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，进行细胞培养。

二、细胞传代
1.当细胞融合率达到80%时，用胰酶或胶原酶消化细胞，分散成单个细胞。

2.将消化后的细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。

3.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，继续进行细胞培养。

三、细胞冻存
1.将细胞沉淀至离心管中，用PBS清洗两次，去除残留的培养基。

2.加入冻存液（10% DMSO +90%胎牛血清），轻轻混匀。

3.将离心管放入-80℃的冰箱中，进行慢速冻存。

4.当细胞悬液完全冻实后，将其转移至液氮中，长期保存。

四、体细胞培养的特点
1.严格的无菌操作：为避免细胞污染，需在无菌环境下进行细胞培养。

2.适宜的培养条件：细胞生长需要适宜的温度（37℃）、湿度（5% CO₂）
和营养环境（培养基）。

3.细胞数量控制：细胞传代前融合率应达到80%，冻存时每管细胞量应达到规定数量。

4.质量控制：监测细胞数量、活率、表面标记、支原体和内毒素等指标，以确保实验结果的准确性和可靠性。

5.应用广泛：体细胞培养技术在生物学、医学、生物工程等领域具有广泛的应用价值，可用于研究细胞生长、分化、信号传导等生物学过程。

细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。

本文将对这些问题进行讲解。

一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。

由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。

复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。

2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。

3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。

换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。

2、向细胞培养管中加入新的培养液。

3、培养之前搅拌均匀。

4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。

三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。

传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。

每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。

2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。

3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。

4、传代时需要更换新的培养基。

四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。

冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。

2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。

3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。

总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。

只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。

细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。

具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。

2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。

消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。

3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。

根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。

离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。

4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。

放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。

注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。

-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。

-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。

冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。

具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。

对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。

2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。

将冻存液预暖。

3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。

用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。

4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。

等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。

注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。

-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。

-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。

复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。

具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。

细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。

②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。

二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。

其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。

细胞冻存1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时冻存为佳。

2.准备：胰酶、培养基、PBS、胎牛血清、DMSO、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。

3.弃细胞瓶中培养基。

1ml PBS洗一次，弃PBS。

加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。

4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。

用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。

5.1200rpm下室温离心5分钟。

在此期间，将胎牛血清滤菌处理后，按DMSO:FBS=1:9的比例配置冻存液。

6.离心后弃上清，加入1ml冻存液。

细胞重悬后加入冻存管，冻存管置入冻存盒，置于-80℃下保存。

细胞复苏1.水浴锅预热至37℃。

-80℃冰箱中取出冻存细胞，37℃水浴下快速融化（1分钟左右为宜）。

2.准备：培养基、1ml灭菌枪头、25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。

3.吸取细胞悬液至15ml离心管中。

1200rpm下室温离心5分钟。

期间，新的25T细胞瓶中加入4ml培养基。

4.弃上清，尽量吸干净，加入1ml培养基重悬，直接加入至25T细胞瓶，晃匀后送入培养箱进行培养。

细胞传代1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时传代为佳。

2.准备：胰酶、培养基、PBS、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。

3.弃细胞瓶中培养基。

1ml PBS洗一次，弃PBS。

加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。

4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。

用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。

5.1200rpm下室温离心5分钟。

每25T细胞瓶加入4ml培养基，其余据面积依次换算。

6.离心后弃上清，加1ml培养基重悬，根据经验于25T细胞瓶（或六孔板）中加入适量重悬细胞液。

简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷
冻的操作方法
动物细胞培养过程中的细胞复苏、传代和冷冻是常见的操作步骤。

具体方法如下：
1. 细胞复苏：
a. 将冷冻保存的细胞样品快速解冻，可以将冰冻管置于37°C的水浴中缓慢解冻。

b. 解冻后，将细胞迅速转移到含有预暖的培养基的离心管中。

c. 用培养基轻轻洗涤细胞，并将其移至培养皿中，使细胞附着于培养器皿表面。

d. 增加足够的预热培养基，将细胞放回合适的培养条件中进行复苏。

2. 细胞传代：
a. 当细胞达到适当的密度或已达到培养器皿的最大生长容量时，需要进行细胞传代。

b. 首先，先用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。

c. 使用无菌酶消化液（如胰蛋白酶）轻轻润湿细胞，然后加入等量的无菌培养基来停止消化。

d. 耐心地将细胞悬浮液吸取并转移到新的培养皿中，保持适当的稀释比例，并加入新的预热培养基。

e. 将新的培养皿放入培养箱中，提供适当的温度、湿度和氧气供应。

3. 细胞冷冻：
a. 将细胞按照细胞传代的方法进行收获和洗涤。

b. 用细胞冻存试剂（如DMSO）缓慢添加到细胞悬浮液中，最终细胞密度通常为1-2×10^6个细胞/mL。

c. 将细胞悬浮液转移至预冷的冻存管中。

d. 快速将冷冻管放入冷冻等温器中，以确保细胞迅速冷冻。

e. 细胞冷冻后，将冷冻管转移到液氮罐中进行长期储存。

请注意，动物细胞培养的具体操作方法可能因细胞类型和研究需要而有所不同。

在进行这些操作之前，应仔细阅读并遵守相应的实验室指南和安全操作规程。

细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。

细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。

下面将详细讨论这些过程。

细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。

2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。

3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。

4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。

5.定期观察细胞的生长情况。

细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。

3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。

4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。

5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。

冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。

3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。

4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。

5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。

6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。

7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。

一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。

二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。

2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。

3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。

4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。

（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。

3.离心，1 000 rpm，5 min。

4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。

四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。

一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。

二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

准备工作：1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台,接着紫外灭菌30—50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。

2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基注意事项:1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒,烘干.2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

开始工作：1、实验前换衣帽,开风淋，吹风。

2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

5、取移液管一支,塞棉花端，及管身,均在酒精灯上烤一下，套好吸球。

6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。

7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。

8、将细胞置于5％CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性,促进消化。

9、取待用细胞,取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。

10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中,封口，标签.11、离心5min，1000转/min。

以下分别介绍:一换液1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

3、取移液管一支，塞棉花端,及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球.4、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。

5、取移液管一支,塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下,套好吸球。

6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。

7、将细胞置于5％CO2、37度培养箱培养。

二传代1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量,加入离心管中，将细胞重悬、吹匀.2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞,镜下观察，细胞密度适宜则置入5％CO2、37度细胞培养箱中。

细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。

3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。

细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。

2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。

1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。

细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。

3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。

4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。

5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。

7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。

面做好标志，注明细胞、组别及日期。

细胞复苏及传代操作方法
细胞复苏和传代是细胞实验室中常用的实验技术，用于维持和增殖细胞系。

细胞复苏方法：
1. 从冻存细胞库中取出冻存细胞，并将其快速解冻。

可以使用热水浴或速溶法进行解冻。

2. 解冻后，将细胞迅速转移到预先准备好的培养基中。

培养基应包含适当的营养物质和生长因子，以支持细胞复苏和增殖。

3. 将细胞培养在恒温培养箱中，通常在37摄氏度、5% CO2下培养。

4. 定期观察细胞的形态和增殖情况，确定细胞已成功复苏。

传代操作方法：
1. 当细胞达到足够的密度和数量时，用胰酶/胆碱盐溶液或丝裂霉素等方法将细胞从培养器表面剥离。

2. 将细胞转移至新的预先准备好的培养器中，添加新的培养基，以稀释细胞并提供新的营养物质。

3. 培养细胞在恒温培养箱中继续生长和增殖。

4. 定期观察细胞的形态和增殖情况，重复传代操作直到需要的细胞数目达到或超过所需的实验要求。

细胞复苏和传代操作需要严格的无菌操作和细胞培养条件，确保细胞的健康和纯度。

在进行这些操作之前，应进行充分的培训，并遵循实验室的安全操作规程。

细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。

细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。

4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。

细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。

2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。

3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。