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实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。
微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。
以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。
琼脂扩散法，亦称管碟法。
系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。
(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
(4) 小钢管放置器：四孔，一台。
硫酸庆大霉素可溶性粉质量标准（地标升国标第一册）硫酸庆大霉素可溶性粉Liusuan Qingdameisu KerongxingfenGentamycin Sulfate Soluble Powder本品为硫酸庆大霉素与适宜辅料配制而成。
含庆大霉素应为标示量的90.0%-110.0%。
【性状】本品为白色或类白色粉末。
【鉴别】（1）取本品适量（约相当于庆大霉素5mg），加水1ml使溶解，加0.1%茚三铜的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显紫蓝色。
（2）取本品与硫酸庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含20mg的溶液，照薄层色谱法（附录80页）试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点与同一硅胶G 薄层板（临用前于105℃活化2小时）上；另取三氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（1:1:1）混合振摇，放置1h，分取下层混合液为展开剂，展开，取出于20-25℃晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、颜色与位置应与标准品溶液斑点数、颜色与位置相同。
（3）本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应（附录21页）【检查】干燥失重取本品，105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（附录69页）其他应符合可溶性粉剂项下有关的各项规定（附录16页）。
【含量测定】取本品适量，精密称定，用灭菌水溶解并定量稀释制成每1ml中含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录103页）测定，即得。
【作用与用途】抗生素类药。
用于治疗鸡敏感的革兰氏阴性菌和阳性菌感染。
【用法与用量】以本品计。
混饮：每1L水，鸡2g，连用3-5日。
【不良反应】对肾脏有较严重的损害作用【注意事项】与头孢菌素合用可能使肾毒性增强。
【休药期】鸡28日；蛋鸡产蛋期禁用。
【规格】100g：5g（500万单位）【贮藏】遮光，密闭，在干燥处保存【有效期】2年。
制药GMP管理文件一．目的：制定硫酸庆大霉素内控质量标准，规范公司硫酸庆大霉素的采购与生产。
二．适用范围：适用于硫酸庆大霉素的采购与验收。
三．责任者：生产部经理、质管部经理、检验员四．正文：硫酸庆大霉素本品按无水物计算，每1mg的效价不得少于590庆大霉素单位。
【性状】本品为白色或类白色的粉末；无臭；有引湿性。
本品在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。
比旋度取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml 中约含50mg的溶液，依法测定，比旋度为+107°至+121°。
【鉴别】（1）取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显紫蓝色。
（2）取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含20mg 的溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板（临用前于105℃活化2小时）上；另取三氯甲烷-甲醇-浓氨溶液(1：1：1)混合振摇，放置1小时，分取下层混合液为展开剂，展开，取出于20~25℃晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置和颜色相同。
（3）本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致。
（4）本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。
【检查】酸度取本品，加水制成每1ml中含40mg的溶液，依法测定，PH值应为4.0～6.0。
溶液的澄清度与颜色取本品5份，各0.4g，分别加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色2号标准比色液比较，均不得更深。
硫酸盐取本品约0.125g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节PH值至11，精密加氯化钡滴定液（0.1mol/L）10ml及酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定，注意保持滴定过程中的PH值保持为11，滴定至紫色开始消褪，加乙醇50ml，继续滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。
庆大霉素标准品制备中效价测定及原材料选择的研究韩宁宁;徐嫄;于丽娜;郝利华;赵晖【摘要】在近期庆大霉素标准品制备过程中遇到两个问题——双圈与可靠性测验不符合规定.通过调整菌悬液浓度、抗生素浓度及上层菌液加入量使双圈现象得以抑制,以保证测量结果准确可靠.C组分测定结果显示原料药与标准品C组分差异较大,容易导致二者剂量反应直线不平行,进而影响可靠性测验结果.通过更换与标准品C组分更为相近的原料药使可靠性测验符合规定.上述改进措施保证了国家标准品赋值的准确性,以期为同业人员效价测定遇到类似问题提供借鉴.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(049)009【总页数】4页(P37-40)【关键词】庆大霉素;C组分;双圈;三剂量法;可靠性测验【作者】韩宁宁;徐嫄;于丽娜;郝利华;赵晖【作者单位】中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S859.796庆大霉素(gentamicin，GM)是由小单孢菌属(Micromonosporapurpurea)发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖苷类抗生素，它们在结构上是由脱氧链霉胺(purposamine)、紫素胺和3-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺缩合成的苷。
临床上使用的庆大霉素主要由Cl、Cla、C2、C2a四个活性成分组成，另外还有其他几个微量组分，如西索米星(sisomicin)、庆大霉素C2b(也称为沙加霉素，sagalnicin)、二-氢氧-庆大霉素C2a(Antibiotic JI-20 B，它是Cl、C2和C2a的前导物)等[1-2]。
多组分抗生素对检定菌抑菌作用存在差异，易发生双圈现象，在兽药典抗生素微生物检定法[3]规定范围内，通过调整菌浓、加菌量、加药量等措施可使双圈得以抑制。
实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。
微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。
以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。
琼脂扩散法，亦称管碟法。
系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。
(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
(4) 小钢管放置器：四孔，一台。
・检验技术与方法・硫酸庆大霉素微生物法效价测定方法的改进周芝梅【文献标识码】B【中图分类号】R927.1;R978.1【文章编号】1007-1040(2002)04-0239-01【关键词】硫酸庆大霉素; 效价; 测定 依照《中国药典(2000年)版》二部提供的方法测定庆大霉素效价,现通过在供试品溶液制备时增加缓冲液中氯化钠的浓度,对测定庆大霉素效价的方法进行改进探讨,取得了比较满意的结果。
1 材料与方法(1)仪器、试剂及药品 Z-82B抑菌圈面积测定分析仪(南通无线电仪器厂);游标卡尺(精密0. 02mm);氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾;硫酸庆大霉素注射液。
按《中国药典(2000年)版》二部配制含氯化钠分别为2.0%、4.0%、6.0%、8.0%的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.8～8.0)。
改进法为含氯化钠5.0%的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.8～8.0)。
(2)供试品溶液 用于标准曲线测定的浓度为采用庆大霉素标准品分别配成1、3、5、7、9、11、13u/ml 的溶液,用于效价测定的浓度为:高剂量10u/ml;低剂量5u/ml。
其他操作方法均按《中国药典(2000年)版》二部规定进行。
2 结果与讨论【作者单位】淮北药业有限责任公司,安徽淮北 2350002.1 缓冲液中氯化钠浓度对抑菌圈直径的影响 庆大霉素微生物法效价测定在测试浓度、上层菌层培养基加菌量相等的情况下,高剂量抑菌圈直径随缓冲液中氯化钠浓度的增大而增大;而低剂量抑菌圈直径则随缓冲液中氯化钠浓度的增大变化较复杂。
当氯化钠浓度由0增大至2.0%时,抑菌圈直径增大;当氯化钠浓度由2.0%增大至8.0%时,抑菌圈直径变化不太大,当氯化钠浓度在4.0%以上时可形成直径为18～22mm的抑菌圈,高低剂量直径之差也增大,菌层生长密集,抑菌圈边缘较清晰,可用Z-82B抑菌圈面积测量分析仪直接测量,且测得结果的可信限率也较好(表1)。
表1 氯化钠浓度与庆大霉素抑菌直径的关系3氯化钠浓度(%)抑菌圈直径(mm)低剂量(5u/ml)高剂量(10u/ml)010.2212.632.014.3717.644.014.1318.556.013.8918.968.014.2620.38 3均为8个抑菌圈直径的平均值2.2 改进法与药典法标准曲线 庆大霉素在2～10u/ml浓度范围内,两法对数剂量与抑菌圈半径之平方均呈直线关系,但改进法比药典法直线斜率小,从而有利于检测的灵敏度与重现性。
比浊法测定硫酸庆大霉素效价及其高通量测定方法探讨王颖;王伟【摘要】目的建立浊度法测定硫酸庆大霉素的效价.方法以金黄色葡萄球菌为实验菌,37℃培养4 h测定.采用96孔板培养酶标仪检测并与管碟法比较.结果微量比浊法测定硫酸庆大霉素的方法是可行的.结论该法快速、准确,适合在检测量大和快速获得结果的工作中推广.【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2010(025)005【总页数】2页(P327-328)【关键词】比浊法;效价;硫酸庆大霉素;高通量【作者】王颖;王伟【作者单位】河南医药技师学院,河南,开封,475000;河南大学生命科学院,河南,开封,475000【正文语种】中文【中图分类】R927.2抗生素生物测定常采用的方法有比浊法和管碟法。
与管碟法相比,比浊法具有快速、易操作和人为影响因素少等优点,被广泛采用,为此国内还开发了以比浊法为原理的抗生素效价测定仪,一次培养样品可达40份,但仍无法达到高通量要求。
笔者采用比浊法进行庆大霉素效价测定,以酶标仪作为检测仪器,以96孔板作为检定菌培养容器的高通量检测方法进行解析并确证。
1 仪器与材料1.1 仪器 754紫外可见分光光度计、Thermo MK 3酶标仪、玻璃大试管、96孔板、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。
1.2 菌株与试药金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、庆大霉素标准品(效价635 u/m g),均由中国药品生物制品检定所提供;硫酸庆大霉素注射液(河南开封制药厂)。
1.3 培养基与试剂［1］Ⅰ号培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏 6 g、酵母膏 4 g、葡萄糖 1 g,琼脂粉 20 g、水1 000m L,pH 6.5～6.6。
Ⅱ号培养基:蛋白胨 10 g、牛肉膏6 g,氯化钠 7 g,酵母粉3 g,磷酸氢二钾4.82 g,磷酸二氢钾 1.32 g、葡萄糖1 g、水 1 000m L,pH 6.9～7.0。
磷酸盐缓冲液(pH 7.0):磷酸二氢钾13.6 g,氢氧化钠2.37 g,水2 000 m L。
实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。
微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。
以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。
琼脂扩散法，亦称管碟法。
系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。
(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
(4) 小钢管放置器：四孔，一台。
(5) 游标卡尺：精密度0.02mm。
(6) 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料(1) 培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃灭菌30分钟。
(2) 营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH 使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.2-7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
(3) 磷酸盐缓冲液（pH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加蒸馏水使成1000ml，在115℃灭菌30分钟。
(4) 试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63 202).短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml 三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。
4. 双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I 20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。
另取培养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。
放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。
三、二剂量检定法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。
在35-37℃条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。
四、硫酸庆大霉素的效价测定：1. 标准品溶液的配制：精密称取硫酸庆大霉素标准品适量，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5℃以下的冰箱中保存，可使用7日。
将贮备液加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。
2. 供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇适量（硫酸庆大霉素约0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用水稀释成每1ml中约含1000单位的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，按（1）法同法配制，使供试品高剂量溶液和低剂量溶液按标示量计算每ml中含硫酸庆大霉素分别为10U和5U。
3. 测定法：按二剂量检定法测定效价，计算出供试品中含硫酸庆大霉素相当于标示量的百分数。
附录：生物检定统计法中的（2.2）法抗生素微生物检定法是以微生物为工具，不可避免地存在着较大的生物差异性，因此，必须借助于生物统计方法来减少生物差异对检定结果的影响，使结果达到一定的精确度。
英、美、日等国家药典附录中都详细地制定了生物检定方法的实验设计和统计分析，并根据生物统计的要求规定了各个品种的误差范围。
中国药典从1985年版起增加了生物检定法的实验设计和可靠性测验及误差估计等内容，这对判断检验质量及促使检验方法的改进等方面都具有重要意义。
1.可靠性测验抗生素微生物检定法按照观察的方法和生物反应的类型属量反应，即观察每一反应本身所表现的程度，可以用量来表示。
实验设计采用供试品（T ）和已知效价的标准品（S ）对比试验的平行线原理。
由于平行线测定的计算原理是在一定剂量范围内T 和S 的对数剂量与反应或反应的特定函数呈直线关系以及在T 和S 两条直线互相平行（当T 和S 的活性组分基本相同时）的基础上，因此，可靠性测验就是运用统计方法来验证实验结果是否符合量反应的平行线设计原理，是否显著偏离了直线性和平行性，以便评价实验结果的可靠性。
对不是显著偏离平行偏离直线（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。
(1)可靠性测验的统计方法抗生素微生物检定法的可靠性测验采用F 测验，即实验结果的方差分析。
方差分析为测验多组均数之间的差别是否显著。
通过统计运算求得试品间、回归、偏离平行、剂间及碟间项的方差，并以统计得的以上各项方差和误差项方差（S 2）的比值称F 值（各项F 值=)S 误差项方差（各该项方差）作为指标来观察其差别的显著性程度。
将实验结果求得的F 值，按相应各项的自由度及误差项的自由度查F 值表来判断实验结果求得的F 值是大于还是小于F 值表上()05.021f f F ⋅和()01.021f f F ⋅的F 值。
若大于()05.021f f F ⋅的F 值，则P<0.05,表示差别有显著意义。
若大于()01.021f f F ⋅的F 值，则P<0.01,表示差别有非常显著意义。
若小于()05.021f f F ⋅的F 值，则P>0.05,表示差别无显著意义。
P 称概率，即某一事件在一定条件下可能发生的机会，P 就是机会的定量表现形式，用数量的形式来反映出事情必然性的规律，它是生物统计的基础，一般在统计中评定实验结果的可靠程度以P 表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.01，即表示可靠性有99%的把握。
可靠性测验一般分为下述两个步骤：①实验结果的方差分析：从实验数据的总变异差方和中分出剂间变异和碟间变异的差方和后，即为误差项的差方和，其方差以S 2表示。
首先按剂量组将各反应值y （抑菌圈的直径）列成方阵见表1。
表1 实验结果 双碟数剂 量 组总 和 总和平方 (1)(2) (3) … （K ） Σy m [Σy m ]2 1 2 3m y 1(1) y 2(1) y 3(1)y m(1) y 1(2) y 2(2) y 3(2)y m(2) y 1(3) y 2(3) y 3(3)y m(3) … … …… y 1(k) y 2(k) y 3(k)y m(k) Σy 1 Σy 2 Σy 3Σy m [Σy 1]2 [Σy 2]2 [Σy 3]2[Σy m ]2 总 和 Σy (k)Σy (1)Σy (2)Σy (3)…Σy (k)Σy总 和 Σ[Σy m ]2总和平方 [Σy (k)]2[Σy (1)]2 [Σy (2)]2 [Σy (3)]2 …[Σy (k)]2总 和 Σ[Σy (k)]2y 2的总和 Σy 2表1中，K 为S 和T 的剂量组数，m 为各组内y 的个数（即双碟数），各组的m 应相等，n 为反应的总个数，n=m ×k 。
各项变异的差方和及自由度（f ）的计算差方和（总）=Σy 2— ny 2)(∑f (总)=n — 1式中 ny 2)(∑=校正数差方和（剂间）=my k 2)(][∑∑— 校正数f (剂间)=K —1 差方和（碟间）=ky m 2)(][∑∑— 校正数f (碟间)=m — 1差方和（误差）=差方和（总）—差方和（剂间）—差方和（碟间） f (误差)=f (总)—f (剂间)—f (碟间)=（k —1）（m —1） 方差=该项自由度该项差方和S 2=()()误差误差差方和f或S 2=)1)(1(][][][222)(2--∑+∑∑⋅-∑∑⋅-∑⋅m K Km y y m y K y Km m k②剂间变异的分析：剂间变异的显著性测验主要包括S 和T 试品间、回归、平行性及直线性等变异内容。
各项变异的差方和及自由度（f ）按表2二剂量法和表3三剂量法可靠性测验正交多项系数表计算。
表2 二剂量法可靠性测验正交多项系数表变异来源Σy (k)差 方 和自 由 度S 1S 2T 1T 2正交多项系数（Ci ）试 品 间-1 -1 1 122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1 回 归 -1 1 -1 122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1 偏离平行 1 -1 -1 122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1表中正交多项系数用Ci 表示，Σy （k ）为各剂量组反应值之和。
各项变异的差方和=22)(]}[{Cim y Ci k ∑⋅∑⋅∑，除以该项的自由度即等于方差。
