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实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。
2.了解其他灭菌方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。
其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。
2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。
3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖。
五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。
2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。
微生物学第一章第一章绪言一、一、微生物概述1、1、什么是微生物微生物(microbe，microorganism)通常是描述一切不借助显微镜用肉眼看不见的微小生物。
这类微生物包括病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物和某些藻类。
微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。
因此，微生物通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类，它们的大小和特征见表1.1所示。
但是有些例外，如许多真菌的子实体、蘑菇等常肉眼可见；相同的，某些藻类能生长几米长。
一般来说微生物可以认为是相当简单的生物，大多数的细菌、原生动物、某些藻类和真菌是单细胞的微生物，即使为多细胞的微生物，也没有许多的细胞类型。
病毒甚至没有细胞，只有蛋白质外壳包围着的遗传物质，且不能独立存活。
表1.1 微生物形态、大小和细胞类型2、2、生物中哪些是微生物物生非细胞生物病毒、亚病毒细胞生物原核生物真细菌、古细菌真核生物生动物真菌、单细胞藻类、原3、3、微生物的特点a a 个体微小，结构简单在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。
b b 繁殖快生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。
c c 代谢类型多，活性强。
d d 分布广泛有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。
e e 数量多在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。
f f 易变异相对于高等生物而言，较容易发生变异。
在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。
微生物种内的遗传多样性非常丰富。
所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
二、二、微生物学的重要性微生物与人类生活所有方面紧密联系，下面仅列出几个：1、1、环境微生物在碳循环、氮循环和磷循环(地球化学循环)中承担主要作用，构成生物体的所有基本成分。
绪论一、什么是微生物非分类学上名词，来自法语“Microbe”一词。
是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。
一般只有借助显微镜才能其进行观察。
三界（域）系统Woese提出将生物分成为三界(后来改称三个域)：古细菌、真细菌和真核生物。
1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。
并构建了三界(域)生物的系统树。
微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。
微生物是人类的朋友微生物是自然界物质循环的关键环节；体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；微生物可以为我们提供很多有用的物质；微生物是现代生物技术使用的重要宿主和工具。
少数微生物也是人类的敌人！认识微生物的四大障碍：个体过于微小；群体外貌不显；种间杂居混生；形态与作用后果很难被认识。
二、人类对微生物世界的认识过程（一）、微生物的发现——形态学时期荷兰人列文虎克（1632-1723）首次观察到了细菌。
（二）、微生物学的奠基——生理学时期法国人巴斯德（1822-1895）（1）证实了微生物活动和否定了微生物自然发生学说。
（2）免疫学——预防种痘（3）发酵的研究——相信一切发酵作用都和微生物的存在及繁殖有关。
不同的发酵是由不同的微生物引起的。
（4）发明巴斯德消毒法。
德国人柯赫（1843-1910）1、建立微生物学研究基本技术（1）分离和纯化细菌：划线法，混合倒平板法。
（2）设计了培养细菌用的肉汁胨培养液和营养琼脂培养基。
（3）设计了细菌染色技术2、证实疾病的病原菌学说，提出了柯赫准则。
柯赫准则（1）某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。
（2）必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。
（3）用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。
(4) 必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。
（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
微生物学实验讲义（2008级基地班）任课教师：熊芳教授教化时数：15学时实验周数：4周生物学实验教授教化中间微生物实验目次（15学时）微生物实验差不多常识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：泥土自生固氮菌的分别纯化（5学时）实验三：显微镜的应用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验差不多常识一、实验目标1.熟悉实验室规矩和安稳守则，精确应对实验中显现的不测变乱；2.熟悉微生物学实验室常用仪器和有关试剂的全然常识；3.操纵实验申报的精确书写。
二、实验内容1.实验室规矩；2.实验室安稳守则；3.实验室中不测变乱处理；4.常用器皿及器具；5.显微镜及有关常识；6.实验预习、实验记录和实验申报。
实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌设备培养基的全然流程如下：原料称量→消融→调剂pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、养分成分1. 依照不合微生物的养分须要配制不合的培养基，如自养型微生物的培养基完全能够（或应当）由简单的无机物质构成。
异养微生物的培养基至少须要含有一种有机物质。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体供给全部心理活动所须要的能量（异养微生物）。
氮源(nitrogen source) 凡是供给微生物养分所需的氮元素的养分源，称为氮源。
氮源物质的重要感化是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能应用铵盐、硝酸盐作为机体进展的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的前提下，也能够应用氨基酸作为能源物质。
能源指能为微生物的生命活动供给最初能量来源的养分物或辐射能。
2. 留意各类养分物质的浓度与配比养分物的浓度：在一样情形下，浓度合适的养分物质才对微生物表示出优胜感化，浓度大年夜时对微生物进展起克制造用，浓度小时不克不及知足微生物进展的须要。
各养分物质之间的浓度比：培养基中各养分物质之间的浓度比直截了当阻碍微生物的进展与滋长和（或）代谢产品的形成与积聚，专门是碳氮比（C／N）（碳氮比一样指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的阻碍更为明显。
《微生物学实验技术》讲稿任课教师：余文英、黄碧芳教学时数：30学时实验周数：5周微生物实验目录（30学时）第一周微生物学实验基础知识介绍（1学时）实验一：微生物大小的测定（3学时）实验二：培养基的配制与灭菌（3学时）第二周实验三：微生物血球计数板直接计数（3学时）实验四：酵母菌子囊孢子形态的观察（2学时）实验五：土壤中细菌、放线菌、真菌的分离与纯化（3学时）第三周实验六：稀释平板计数法微生物活菌测数（2学时）实验七：四大类微生物菌落的形态比较与识别（2学时）实验八：微生物菌种保藏（3学时）第四周实验九：细菌芽胞的观察（2学时）实验十：细菌染色观察个体形态（3学时）实验十一：滤膜法测定水中大肠菌群（3学时）第一周微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。
二、实验内容给学生介绍以下几点内容（具体内容见书上）：1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。
微生物的大小测定一、实验原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。
由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。
由于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图1）是一块圆形玻片，在玻片中刻有精确等分的刻度。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺时处在目镜的隔板上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。
而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、物镜两次放大成象后才进入视野的。
即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求的得在一定放大倍数下的实际测量时的每格长度。
实验一革兰氏染色实验一、目的要求1、学习并初步掌握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
实验四显微测微技术与细菌运动性观察一、目的要求1．了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。
2．学习悬滴法观察细菌运动性技术二、实验原理(一)显微测微技术微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。
物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01mm，即10 pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。
目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75 mm的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度(有50格和100格两种)测量时，需将其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。
(二)细菌运动性在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。
通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。
观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。
三、实验器材1．活材料：培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母2．试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。
3．器材：目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。
四、操作步骤(—)显微测微技术1．装目镜测微尺：取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒。
2．校正目镜测微尺(1) 将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上(2) 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。
利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。
试验一培养基的配制及灭菌【目的要求】1．了解培养基的概念、种类及用途2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序3．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法。
【基本原理】培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。
自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。
不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。
此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。
高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。
马丁氏培养基和豆芽汁葡萄糖培养基分别用于霉菌和酵母菌的分离培养。
【材料与用品】1．材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。
【仪器与用品】天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。
一、肉膏蛋白胨培养基的配制1．培养基成分牛肉膏0. 3g蛋白陈1gNaCl 0.5g琼脂 1.5g水100mlpH 7.2~7.4 2．配制方法（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于唐瓷缸中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。
然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述唐瓷缸中。
将唐瓷缸加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化。
（2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。
（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/l NaOH溶液调pH至7.2~7.4。
生物学实验讲义课程组人员:缪礼鸿胡申才代江红周帼萍曾驰武汉工业学院生物与制药工程学院生物工程教研室录实验须知 (1)实验一普通光学显微镜的使用和细菌的简单染色 (2)实验二革兰氏染色法 (5)实验三细菌芽孢和荚膜染色法 (7)实验四放线菌、蓝细菌、藻类和原生动物的形态观察 (9)实验五霉菌的形态观察 (11)实验六酵母菌的形态观察、死活鉴别及大小测定 (12)实验七微生物的数量测定 (14)实验八玻璃器皿的洗涤、包扎、灭菌及无菌操作台的使用 (16)实验九培养基的制备与灭菌 (18)实验十芽孢杆菌的分离纯化及观察 (20)实验十一抗稻瘟霉的芽孢杆菌的分离筛选 (22)实验十二食品或水中大肠菌群的检测 (23)实验十三大肠杆菌生长曲线的测定 (27)实验十四细菌质粒的接合转移与检测 (28)实验十五微生物菌种保藏技术 (29)实验须知普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。
同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。
为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。
2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。
4．实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。
如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。
必要时用灭火机。
6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。
《微生物学基础实验》（胡开辉主编）中国林业出版社（节选改编）任课教师：刘芳教学时数：20学时实验周数：4周实验学时数：5学时/周实验内容：一：培养基制备与灭菌二：无菌操作技术三：自生固氮菌的分离四：养分和温度对细菌生长的影响五：荚膜染色与革兰氏染色六：微生物大小与数量的检测第一部分：培养基的配制与灭菌Ⅰ培养基培养基是按照微生物生长发育的需要，将不同组合的营养物质调制而成的营养基质。
人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。
把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。
自然界中，微生物的种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，所以培养基在组成原料上也各有差异。
但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育所需的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。
此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（PH值）、一定缓冲能力、一定氧化还原电位和合适的渗透压。
一、培养基的主要成分1、水：水是构成微生物细胞的重要物质，其含量约占70%～90%。
大部分营养养物质必须先溶解于水中，才能为微生物细胞吸收，而且微生物细胞内进行的各种合成代谢、分解代谢等都是在水溶液状态下进行的。
因此，水是微生物生命活动不可缺少的条件。
一般情况下，配置培养基时，可用自来水、井水，天然水中含有的微量杂质不仅对微生物无害且可作为营养物质被微生物吸收利用，但在测定微生物某些生理特性、合成产物数量以及其它要求精确性高的实验时，则必须采用蒸馏水，以保证结果的准确。
2、碳源：碳素是组成微生物细胞的主要元素，也是异养生物生命活动的能源。
可作为培养基碳源的物质很多，最常用的碳源为葡萄糖，因为能利用葡萄糖的微生物很多。
其它糖如蔗糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、纤维素，以及脂肪、蛋白质、有机酸、醇类、烃等都可作为培养不同微生物时选择使用的碳源。
根据微生物对碳素同化能力的不同，微生物可分为自养型（无机营养型）和异养型（有机营养型）两大类。
华中大微生物学实验讲解实验一微生物制片及形态观察一、细菌简单染色法及形态观察（一）基本原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
（二）实验材料1．菌种：大肠杆菌、酵母菌的斜面培养物。
2．染色剂：吕氏碱性美蓝、草酸铵结晶紫等。
3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸等。
（三）实验步骤1. 涂片：取一块载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，从菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，并涂成薄膜。
涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2. 干燥：室温自然干燥或烘干。
3. 固定：涂面朝上，通过火焰2～3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同时还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
4. 染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加1~2滴染液于涂片上。
草酸铵结晶紫染色约1 min；若用吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。
5. 水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。
6. 干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。
7. 镜检：涂片干后镜检。
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
实验一玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌一、目的要求1、熟悉微生物实验所需的各种常用器皿名称和规格；2、掌握对各种器皿清洗方法；3、掌握玻璃器皿的干热灭菌操作过程；4、了解手提式高压蒸汽灭菌锅的结构、使用方法和操作要点。
二、基本原理为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。
保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。
试管和三角瓶要做棉塞。
这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。
因此应看作是微生物实验的基本操作。
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物的营养体，包括芽胞和孢子。
灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。
本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。
通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。
细胞内的蛋白质凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强；湿热的蒸汽有潜热存在，从而增加灭菌效力。
三、实验器材1、吸管，试管，三角瓶，试管刷，棉花，报纸、包扎绳、去污粉等；2、手提式高压蒸汽灭菌锅。
四、实验步骤1、玻璃器皿的洗涤清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。
1）不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用酸性溶液（2%的盐酸溶液）浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。
2）用过的器皿应立即洗涤。
3）强酸，强碱，琼脂等能腐蚀，阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。
一般的器皿都可用去污粉，肥皂或配成5%的热肥皂水来清洗。
油脂很重的器皿应先将油脂擦去。
沾有煤膏，焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂(苯，二甲苯，汽油，丙酮，松节油等)揩去。
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】《生物学实验Ⅰ——微生物》（2008级基地班）任课教师：熊芳教学时数： 15学时实验周数： 4周生物学实验教学中心微生物实验目录（15学时）微生物实验基础知识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时）实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。
二、实验内容1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。
实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌配置培养基的基本流程如下：原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、营养成分1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。
异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。
碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。
氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。
氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。
能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。
2. 注意各种营养物质的浓度与配比营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。
各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。
二、控制培养基的PH值各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。
在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。
外源调节：按实际需要流加酸或碱液三、渗透压注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。
培养基的种类据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。
如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。
2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
例如，马铃薯蔗糖培养基。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。
从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。
2.固体培养基：在液体培养基中加入1-2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入—%凝固剂而成的半固体状培养基。
按照培养基的用途，可将其分为1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。
2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。
利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。
牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。
基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。
琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏蛋白胨NaCl水 1000mlpH ～。
二、实验器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。
2、仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（～），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。
三、操作步骤1、称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
2、溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按%～%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。
配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。
3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达。
反之，用1mol/LHCl 进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配置pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。
4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。
5、分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。
（1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。
分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6、加塞a)包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。
）b)灭菌：将上述培养基以,121℃，20min高压蒸气灭菌。
c)搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
d)无菌检查：将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。
阿斯毕无氮培养基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4NaClCaCO3 5g琼脂 20g水 1000mlPH ~121℃灭菌30分钟高压蒸汽灭菌一、目的要求1．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。
2．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。
本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
三、器材牛肉膏蛋白胨培养基，阿斯毕无氮培养基，培养皿，立式高压蒸汽菌锅等。
四、操作步骤1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
