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传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

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传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

１ １ １ 病料 ．．
辽宁省 大连市发 病鸡场 ） 置 一７ ￣ 冻保存 ；Ｐ ， ０ Ｃ冷 Ｓ Ｆ鸡
胚 和 Ｓ Ｆ鸡购 自济南吴泰实验 动物繁育有 限公 司 。 Ｐ
１ １ ２ 主 要 试 剂 Ｅ． ２ ． ｏｉ Ｌ １
５的 比例 （ 质量 比） 加无 菌 Ｐ Ｓ匀 浆 ， Ｂ 反复 冻 融 ３次 ，
１ ２ ２ 动 物 回归试 验 ． ． 将 １ ５羽 同一 批 次 的 ４周 龄
１ Ｏ羽每 只鸡 注射油 乳剂 疫苗 ０ ３ｍＬ， ． 第二 组 ５羽 每 只鸡 注 射 ０ ２ｍＬ 白油 佐 剂 作 为 对 照 组 ， 疫 注 射 ． 免
后 ３周 翅下 采血 ， 分离 血 清 ， 进行 琼脂 扩散 试验 。
层 呈现 黄色 胶 冻样 。琼 脂 免 疫 扩 散试 验 结 果 表 明 ， Ｉ ＤＶ 阳性血 清 与 Ｉ ＤＶ 标 准抗 原 和 回归试 验鸡 的 Ｂ Ｂ 法 氏囊 组织 匀浆 之 间均 出 现 沉 淀线 ， 与 阴性 对 照 而
之 间无 沉淀 线 出现 （ １ 。 图 ）
质 粒的构 建
动 物 医 学 进 展 。０ ２ ３ （ ） １— １ ２ １ ，３ ５ ：８２
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
传 染性 法 氏囊病 病 毒 ＶＰ ２基 因原 核 表 达 及 抗 原 性 分 析
单 学强 ， 明 义弘 ， 李 高 轩
模板 ， 构建 重组 表 达质 粒 ｐ Ｔ ８— ２ 使 用 大 肠 埃 Ｅ ２ ａＶＰ ； 希菌 进行 原 核 表 达 ， 备 ＶＰ 制 ２蛋 白并 分 析 Ｖ ２蛋 Ｐ 白的生物 学活 性 ， 鸡 传 染性 法 氏囊 病 基 因工 程 亚 为 单位 疫苗 的研 制奠 定基础 。

鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研究进展

鸡传染性法氏囊病新型疫苗的研究进展
ｃａｕｓｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃ １０ｓｓｅｓ ｉｎ ｐｏｕｌｔｒｙ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ａ ｖｉａｂｌｅ ０ｐｔｉｏｎ ｔ０ ｃｏｎｔｒｏｌ ＩＢＤ ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｃｔｉｖｅ ｏｒ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍ ｍｕｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ．Ｔｈｕｓ， ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ０ｆ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＢＤＶ ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅ ｐｏｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃ０ｍ ｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆｔｅｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｆａｉｌｕｒｅ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｉｔ ｉｓ ｕｒｇｅｎｔ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＩＢＤ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌ０ｐｍ ｅｎｔ ０ｆ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｓｕｍｍ ａｒｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｆ ＩＢＤ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＩＢＤ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｖａｃｃｉｎｅ，ｌｉｖｅ ｖｉｒｕ ｓ ｖｅｃｔｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ＳＯ ｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ；ｉｎ ｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒ ｕｓ；ｖａｃｃｉｎｅｓ

免疫学综述.doc

免疫学综述.doc

免疫学综述摘要:核酸疫苗是一种新型的基因工程疫苗,它将含有编码某种抗原蛋白基因序列的重组质粒作为疫苗直接导入机体细胞内。

通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白．诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，从而使被接种机体获得相应的免疫保护而达到防病治病的目的。

该文就核酸疫苗研究历史,特点、免疫机制，目前存在的主要问题及在免疫中的应用情况进行综述。

正文：核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)，又称DNA疫苗(DNA vaccine)、基因疫苗(Genetic vaccine)。

核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗口2（1）由于核酸疫苗可以诱导机体产生全面的免疫应答，并且对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用，同时又具有安全、可靠、生产方便等优点，故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第3代疫苗。

核酸疫苗虽然具有常规疫苗所没有的优点，但同时核酸疫苗也存在一些尚未解决的问题。

核酸疫苗的历史。

1990年，Wolff等3（2）在进行基因治疗时，在小鼠肌肉组织内直接注射质粒DNA，质粒及其携带的外源基因被小鼠肌细胞吸收并能在体内较长期稳定地表达蛋白质，接种60 d后，编码的酶仍有生物学活性。

这是一次偶然发现，却导致一个具有划时代意义的研究从此产生。

1991年，William等4’（3）发现输入的外源基因在体内的表达产物可诱导免疫应答。

1992年，Tang等5（4）将含有人生长激素基因的质粒载体导人小鼠皮内，小鼠产生了特异性免疫应答，并在随后的免疫过程中得到加强，于是他提出了基因免疫的概念。

1993年，u1．mer 等6（5）将含有流感病毒核心蛋白编码基因的质粒载体直接注入小鼠肌肉中，使小鼠产生了对该病的免疫保护。

1994年，世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开国际会议，将其统一命名为核酸疫苗(nucleic acid vaccine)7J（6），其作为第三代疫苗的地位得到确认，并开辟了疫苗学研究的新纪元。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位的鉴定的开题报告一、研究背景鸡传染性法氏囊病(CDV)是由法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种常见的急性传染病，多发生于3-6周龄的肉鸡和蛋鸡。

IBDV属于Birnaviridae 家族，病毒颗粒包含两个单链RNA、VP1和VP2两个壳蛋白。

VP2是病毒唯一的表位性蛋白，与宿主细胞进行结合，进而引起感染。

因此，研究VP2蛋白的配体结合表位对于研究IBDV的感染机制具有重要意义。

二、研究目的本研究旨在通过生物信息学方法预测CDV VP2蛋白结构及其表位，并构建VP2蛋白与其配体结合的三维模型，进一步探究CDV感染的分子机制，为防治CDV提供新思路。

三、研究内容及方案1.预测CDV VP2蛋白的结构和表位：利用基于序列的方法和结构预测软件对CDV VP2蛋白的二级结构、三级结构和表位进行预测，并通过功能域分析和进化保守性评估，筛选出重要的结构域和表位。

2.构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型：根据预测的结构和表位，利用蛋白质分子对接软件构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型，并进行能量最小化优化。

3.验证CDV VP2蛋白的配体结合表位：利用同步辐射小角散射(SAXS)技术进行CDV VP2蛋白与其配体的结合情况检测。

同时，通过基于动力学模拟的微细分子模拟技术进行验证和优化，得到最终可靠的CDV VP2蛋白与其配体的结合模型。

四、预期成果1.预测和解析CDV VP2蛋白的结构和表位，明确其与配体结合的分子机制。

2.构建CDV VP2蛋白与其配体的三维模型，揭示其结构与功能的关系。

3.验证CPV VP2蛋白的配体结合表位，为进一步研究CDV感染机制提供可靠的理论依据。

【国家自然科学基金】_多表位疫苗_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802

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2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
科研热词 重组腺病毒 质粒 表位疫苗 融合蛋白 疫苗 生物信息学分析 流感病毒 抗原表位 恶性疟原虫 多表位基因盒 多表位基因 口蹄疫病毒 原核表达 tau
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
科研热词 核酸疫苗 表位 羊痘病毒 真核表达 病毒样颗粒 疫苗 生物信息学分析 猪细小病毒 河流弧菌 日本血吸虫 恶性疟原虫 多表位基因 多表位 分离鉴定 分子设计 克隆测序 o型口蹄疫病毒 ompu基因
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
科研热词 间日 表达 表位 衣原体,沙眼 细菌外膜蛋白质类 疫苗 疟原虫 毕赤巴斯德酵母 旋毛虫 多位疫苗基因 噬菌体展示 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
科研热词 推荐指数 腺病毒 2 结构蛋白 2 疫苗 2 汉坦病毒 2 抗原表位 2 传染性法氏囊病病毒 2 ctl表位 2 表达 1 肾综合征出血热 1 组合基因 1 磷酸甘油酸变位酶 1 烯醇酶 1 沙眼衣原体 1 日本血吸虫 1 嵌合体 1 多表位疫苗 1 免疫保护 1 人乳头瘤病毒 1 乙肝病毒核心抗原(hbcag) 1 主要外膜蛋白 1 vp2基因 1 dna疫苗 1
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 序号 1 2 3 4
2014年 科研热词 表位分析 结核分枝杆菌 t细胞 rd12区 推荐指数 1 1 1 1

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定杜冬华;周静;王爱华;王磊;孙继国【摘要】为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定.将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达.SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55 ku,以包涵体形式存在.重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)002【总页数】4页(P71-74)【关键词】传染性法氏囊病病毒;HB株;VP2蛋白;克隆表达;免疫原性【作者】杜冬华;周静;王爱华;王磊;孙继国【作者单位】河北北方学院动物科技学院动物医学系,河北张家口075131;河北北方学院动物科技学院动物医学系,河北张家口075131;河北北方学院动物科技学院动物医学系,河北张家口075131;农标普瑞纳饲料有限公司,河北廊坊065000;河北农业大学,河北保定071000【正文语种】中文【中图分类】S852.659.4传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的严重影响养禽业发展的重要传染病之一，病原属双RNA病毒科成员［1-3］。

从IBDV发现至今，新的变异株及超强毒株不断出现，使得传统活疫苗和灭活疫苗已无法完全阻止IBD的发生和流行［4］，迫切需要开发更加安全、有效的新型疫苗，而且基因工程疫苗是未来发展方向［5］。

目前，已知该病毒基因组共编码VP1、VP2、VP3、VP4和VP5 5种蛋白，其中VP2蛋白是宿主保护性免疫原，可诱导产生中和抗体，已成为近年来众多学者研究的热点［6-7］。

兽医微生物学模拟题含参考答案

兽医微生物学模拟题含参考答案1、真菌孢子的主要作用是( )A、抵抗不良环境的影响B、进行繁殖C、抗吞噬D、引起炎症反应答案：B2、引起猪格氏病（多发性、纤维素性浆膜炎和关节炎）的病原是A、里氏杆菌B、多杀性巴氏杆菌C、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌D、副猪嗜血杆菌答案：D3、兽医微生物实验室的生物安全的含义是（）A、防止病原微生物、其他有害生物或物质传入实验室B、防止病原微生物等传出实验室C、做好实验室人员的自身安全防护D、以上都是答案：D4、正黏病毒科中对人和动物危害最大的是哪种病毒？A、B型流感病毒B、A型流感病毒C、C型流感病毒D、托高土病毒答案：B5、病毒复制过程的一般顺序是（）A、吸附、脱壳、侵入、生物合成B、脱壳、侵入、吸附、装配和释放C、侵入、生物合成、脱壳、装配和释放D、吸附、侵入、脱壳、生物合成、装配和释放E、脱壳、侵入、吸附、生物合成、装配和释放答案：D6、一般用于病毒的分离培养的细胞是（）A、对数生长期的细胞B、贴壁期的细胞C、悬浮期的细胞D、潜伏期的细胞E、脱落期的细胞答案：A7、下列哪种方法不能用于伪狂犬病毒的诊断（）。

A、乳胶凝集试验B、ELISAC、PCRD、HA-HI答案：D8、关于“灭活菌苗”说法错误的是（）A、接种剂量较大B、需多次注射C、不影响动物产品品质"免疫期较长D、需要加入佐剂答案：C9、猪圆环病毒的核酸类型（）A、单股环状DNAB、单股线状DNAC、双股线状DNAD、双股环状DNA答案：A10、禽传染性喉气管炎病毒属于（）。

A、痘病毒科B、冠状病毒科C、腺病毒科D、疱疹病毒科答案：D11、关于“猪瘟病毒”说法错误的是（）A、病毒无囊膜B、感染怀孕母猪可导致死胎!流产C、荧光抗体染色法可快速检出组织中的病毒抗原D、猪瘟兔化弱毒疫苗是公认的有效疫苗答案：A12、病毒分离诊断的优点（）A、阳性即可确诊B、适合快速诊断C、阳性检出率高D、操作简单答案：A13、用于分离病毒，采集病料不宜的做法是（）A、急性期采集病料B、康复期采集病料C、病料低温保藏D、釆集新鲜病料E、抗生素处理病料答案：B14、经过物理方法或化学方法处理而杀死细菌制备的疫苗是（）A、减毒疫苗B、灭活苗C、新型菌苗D、基因工程苗答案：B15、具有粘附作用的细菌结构是（）A、鞭毛B、普通菌毛C、荚膜D、性菌毛答案：B16、影响消毒剂作用的因素有（）A、消毒剂的性质B、消毒剂的浓度和作用时间C、环境中的有机物D、以上都是答案：D17、有关荚膜描述错误的是（）A、具有免疫原性,可用于鉴别细菌B、可增强细菌对热的抵抗力C、具有抗吞噬作用D、一般在机体内形成E、化学成分为多糖或多肽等答案：A18、下列细菌中繁殖最慢的是（）A、大肠埃希菌B、丙型链球菌C、链球菌D、结核分枝杆菌答案：D19、在一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比，称为（）A、MOIB、IFNC、TCID50D、RD50E、ID50答案：A20、关于小反刍兽疫的说法，错误的是A、主要感染偶蹄类小型反刍动物B、幼龄动物更易感C、免疫接种是该病最有效的防控措施D、我国没有该病的发生答案：D21、微生物遗传物质的结构发生突然而稳定的改变，但与其他个体遗传物质的转移无关，称为（）A、突变B、转化C、转导D、接合答案：A22、关于“猪瘟病毒”说法错误的是（）A、黄病毒科瘟病毒属B、病毒主要通过采食侵入机体，最先定居于扁桃体C、属于DNA病毒D、病毒粒子呈球形答案：C23、不属于构成病毒持续性感染的机体因素的选项是（）A、病毒抗原发生变异B、免疫耐受C、干扰素产生能力低下D、细胞免疫应答低下答案：A24、酒精消毒最适宜浓度是( )A、100%B、95%C、75%D、50%答案：C25、糖类和脂肪酸等物质的摄取采用哪种方式（）A、单纯扩散B、促进扩散C、主动运输D、基团转移答案：D26、炭疽杆菌在猪的咽喉部位呈现（）A、典型的竹节状B、球状C、螺旋状D、弯曲且粗细不均答案：D27、病毒的突变体获得方法中不属于物理诱变的是（）A、基因重组获得B、紫外线照射C、X射线D、γ射线答案：A28、炭疽杆菌在含有青霉素培养基（0.5IU/ml）上出现“串珠现象”是（）A、青霉素抑制细胞壁脂多糖合成B、青霉素抑制细胞壁肽聚糖合成C、青霉素抑制细胞壁磷壁酸合成D、青霉素抑制芽胞壁胞壁酸合成答案：B29、炭疽杆菌丧失荚膜产生能力后，毒力会（）A、减弱B、增强C、不变D、死亡答案：A30、能够引起神经毒和肝脏毒的毒素是（）A、F-2毒素B、T-2毒素C、伏马毒素D、丁烯内脂答案：C31、朊病毒(或称朊毒体)的化学本质是（）A、核酸和蛋白质B、核酸、蛋白质和多糖C、核酸D、蛋白质答案：D32、关于PFU说法错误的是（）A、PFU是病毒的定量单位B、感染性病毒量用每毫升含有的PFU来表示C、测定病毒滴度可以用PFU表示D、PFU是空斑形成单位E、PFU是测定每毫升含有的细菌量答案：E33、关于病料采集说法错误的是（）A、有病毒血症时采取血液B、呼吸道感染采取可以鼻咽洗漱液、咽拭子、鼻拭子C、脑内感染采取脑脊液D、肠道感染采集粪便标本E、随机选择部位采集标本答案：E34、形成中央芽孢且芽孢直径小于菌体宽度的细菌是（）A、大肠杆菌菌落B、巴氏杆菌菌落C、炭疽杆菌菌落D、产气荚膜梭菌菌落答案：C35、关于煮沸消毒法，下列哪项是错误的（）A、煮沸100℃ 5min可杀死细菌繁殖体B、可用于一般外科手术器械、注射器、针头的消毒C、水中加入1～2%碳酸氢钠，可提高沸点到105℃D、不足以杀死所有细菌答案：D36、目前公认的细菌分类体系是（）A、《伯吉系统细菌学手册》B、《伯吉系统微生物学手册》C、《伯吉系统原核微生物学手册》D、《伯吉系统真菌学手册》E、以上均不是答案：A37、“动脉炎病毒科”不包含（）A、猪繁殖与呼吸综合征病毒B、猪流行性腹泻病毒C、猴出血热病毒D、小鼠乳酸脱氢酶病毒答案：B38、螺形菌中菌体只有一个弯曲，呈弧状或逗点状的细菌称为（ )A、螺菌B、弧菌C、球菌D、杆菌E、以上都不是答案：B39、细菌所具有的细胞器是( )A、高尔基体B、内质网C、核糖体D、线粒体E、中心体答案：C40、外毒素经0.4%甲醛溶液处理后，毒力减弱，但仍保持其抗原性称为（）A、内毒素B、类毒素C、抗毒素D、肠毒素答案：B41、禽流感病毒 H 亚型分型的物质基础是A、核蛋白B、磷蛋白C、血凝素D、神经氨酸酶答案：C42、革兰阳性菌细胞壁特有的组分是（）A、脂质B、脂多糖C、磷壁酸D、肽聚糖E、蛋白质答案：C43、关于“死于炭疽的病畜尸体”说法错误的是（）A、切开肋间采取脾脏B、可无菌操作从心脏采血C、可自耳根部采血D、严禁剖检答案：B44、炭疽杆菌在感染的动物体内，形态上通常是（）A、有荚膜、无芽胞B、有鞭毛、有芽胞C、有荚膜、有芽胞D、无荚膜、无芽胞答案：A45、大肠杆菌在下列哪种培养基上培养显红色( )。

传染性法氏囊病病毒抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分析

第３ ２卷 第 １ 期 １
２１ 年 １ 月 ００ １
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖ ｏ ． ２． ｏ １ １３ Ｎ ．１ ＮＯ ２０１ Ｖ． ０
Ｃｈ ｎ ｓ ｏ ｎ ａｌｏｆＰ ｅ ｎ ｉｅ Ｖ ｅｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｃｎｅ ｉ ｅ ｅ Ｊ ｕｒ ｒ ｖｅ ｔｖ ｔｒｎ ｒ ｄｉｉ
ｈ ｍｕ ｏｏ ｙ Ｍｉｉ ｒ ｆ ｒｃｌ ｒｌ ｔｔ Ｃ ｎｅ ｆｒ ｎ ｉｅｒ ｇＲ ｓａｃ ｆ ｔ ｉａ ｉ－ｒｄ ｃｓ Ｎａｊ ｇ２ ０ １， ｈｎ ； ｎ ｎ ｌｇ ， ｎｓｙｏ ｉ ｔ ａ／ ａ ｅｔｒ ｏ ｇｎ ｅｉ ｅｅｒｈｏ ｅ ｎｒ Ｂｏｐｏ ｕｔ， ｎｉ １０ ４ Ｃ ｉａ ｔ Ａｇ ｕ ｕ Ｓ ｅ Ｅ ｎ Ｖｅ ｒ ｙ ｎ
（ ． 苏 省 农 业 科 学 院 兽 医 研 究 所 农 业 部 动 物 疫 病 诊 断 与 免 疫 重 点 开 放 实 验 室 ／ 家 兽 用 生 物 制 品 工 程 技 术 研 究 中心 ， １江 国
江 苏 南京 ２ ０ １ ；２ 南 京农业 大学 动物 医学 院 ，江 苏 南京 ２ ０９ ；３ 南京军 区军事 医学研 究所 ，江苏 南 京 ２ ００ ） １０ ４ ． １０ ５ ． １ ２ ０
２ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｔｒ ａ ｄｃｎ ， ｎｉｇＡ ｒ ｕｔｒｌ ｎｖｒｉ ， ｎｉｇ２ ０ ９ ， ｈｎ ； ． ｏｌ ｅｏ ｅｉ ｒ Ｍｅ ｉｉｅ Ｎａｊ ｇｉ ｌ ａ ｉ ｓｙ Ｎａｊｎ １０ ５ Ｃ ｉａ ｅ Ｖｅ ｎｙ ｎ ｃ ｕ Ｕ ｅ ｔ
３ Ｍｉｔｒ ｄｃｌＩｓｔｔ ｆ ｎｉｇＣ ｍｍａ ｄ Ｎ ｎｉｇ２ ０ ０ ， ｈｎ ） ｌａ Ｍｅｉａ ｎｔｕｅｏ ｊ ｏ ｉｙ ｉ Ｎａ ｎ ｎ ， ａｊ １０ ２ Ｃ ｉａ ｎ

传染性法氏囊病病毒NN1107广西株的分离鉴定及遗传进化分析

传染性法氏囊病病毒NN1107广西株的分离鉴定及遗传进化分析李军;陶立;兰美益;陈泽祥;韦志锋;秦若甫;彭昊;杨威【摘要】为研究从广西南宁市某鸡场疑似患传染性法氏囊病的鸡群中分离鉴定出的一株传染性法氏囊病病毒NN1107株的分子特征,通过反转录-聚合酶链反应特异扩增后进行克隆、序列分析.NN1107株VP2基因高变区(vVP2)的克隆测序和序列比较结果显示,序列符合超强毒传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的分子特征；其与广西vvIBDV毒株的核苷酸同源性在96％～99.6％之间.根据vVP2核苷酸序列同源性绘制的遗传进化树结果显示,NN1107株属于vvIBDV毒株群,与2004年、2005年、2007年和2010年流行毒株BH09、NNTZ(3)、NN07122、HP1001的亲缘关系最近,与疫苗株B87(in)、Bursine-2、FW2512株的亲缘关系较远.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)004【总页数】5页(P63-67)【关键词】传染性法氏囊病病毒;超强毒株;VP2基因高变区;遗传进化【作者】李军;陶立;兰美益;陈泽祥;韦志锋;秦若甫;彭昊;杨威【作者单位】广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.4传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）的病原体。

生物制品

名词解释30％生物制品：是人类用于预防、治疗和诊断疾病的有力武器，是由微生物（细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）或微生物代谢产物、动物毒素、人或动植物主要组织经纯化或现代生物技术加工制成的产品，在预防人类各种传染性疾病、治疗或者辅助治疗数种疾病方面发挥了重要作用。

兽医生物制品(veterinary biologics) 是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质，专供相应的疫病诊断、治疗或预防之用。

生物制品学（biopreparatics）是指研究各类生物制品的来源、结构特点、应用、生产工艺、原理、现状、存在问题与发展前景等诸方面知识的一门科学。

兽医生物制品学(Veterinary biopreparatics) 是以预防兽医学和生物工程学理论为基础，研究动物传染病和寄生虫病的免疫预防、诊断和治疗用生物性制品的制造理论和技术、生产工艺、制品质量检验与控制及保藏和使用方法，以增强动物机体特异性和非特异性免疫力，及时准确诊断动物疫病，并给予特异性治疗，防止疫病传播的综合性应用学科。

弱毒疫苗：由微生物自然强毒株通过物理、化学或生物处理，并经连续传代和筛选，培养而成的丧失或减弱对原宿主动物致病力，但仍保存良好免疫原性和遗传特性的毒株，或从自然界筛选的具有良好免疫原性的自然弱毒株，经培养增殖后制备的疫苗。

灭活：是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。

佐剂：在免疫学和生物制品学上又称为免疫佐剂，是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用者，都称之为佐剂。

最新的概念为：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂。

冷冻真空干燥：又称冷冻干燥，简称冻干，把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，干燥后体积不变的一种物质干燥的方法。

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免疫试验。参照文献 ［8］ 制备 @B">CP， 与免疫佐剂和 间隔 8=， 卡介苗素混合乳化， 皮下注射， 免疫 $ 次， @B">CP 的免疫剂量为 ?22 ,W 只 W 次。实验兔在免疫 # 时和免疫后每间隔 8= 经耳静脉采血， 用 C46Z 病毒 抗原包被反应板 （B ， 以常规间接 "5CP9 测定 ,WK5） # 血清中 C46Z 抗体的效价。 !"- ’&()*+ 对鸡的免疫保护试验 !"-"! 病毒： C46Z 超强毒株 DG%W33 由崔治中等 12 分离鉴定， 在进行攻毒试验前， 将冻存的 DG%W33 感 染鸡法氏囊组织悬液过滤除菌， 用 12 日龄的 P>S 鸡 胚测定悬液中病毒的 "56B2 W2V1K5。 购回后 %M !"-"$ 免疫： 1? 日龄 P>S 来航鸡 ?B 只， 内进行实验。随机分成 7 组： 加佐剂免疫组 @B">CP （@B">CP ’ +=[\*+.U） 、 单用佐剂免疫对照 组 （ +=[\*+.U 和饲养对照组 （ &;+.A N).U@); ） ， 1B 只 W 组。 N).U@);） 胸部肌肉注射佐剂型 @B">CP @B">CP 加佐剂免疫组， 免疫物， 免疫剂量为 B2 单用佐剂免疫对照 ,W 只 W 次， # 组则只注射等体积的佐剂， 两个组同步试验， 均免疫 间隔 8=； 饲养对照组中的鸡不进行免疫， 只是 $ 次， 与两个免疫组在相同条件下饲养。实验鸡在免疫后 每间隔 8= 经翅下静脉采血， 以常规间接 "5CP9 测定 血清中 C46Z 抗体的效价。 第 $ 次免疫 8= 后， 在实验鸡的眼和鼻 !"-"# 攻毒： 内各滴 2V1K5 1 ] 122 稀释的 DG%W33 感染鸡法氏囊 组织悬液 （病毒量约 $22 个 "56B2 ） 。实验观察 8=， 及时取出死亡鸡、 剖解检查法氏囊变化。
［3］ 下简称： 多克隆抗体） ， 由本课题组制备 。 F0GH 免
噬菌体展示随机 #$ 肽库中筛选含有 F0GH 抗原表位 的短肽， 经测序分析， 得到了 ’ 个含有不同 F0GH 抗 ［!］ 原表位的模拟肽序列 。 构 本研究旨在 F0GH 抗原表位分析的基础上， 建由 ’ 个抗原表位模拟肽串联组成的多表位抗原基
!" 卷 # 期 $%%" 年 $ 月 ! 日
微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
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基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （/%’"#/"#） ； 江苏省自然科学基金资助项目 （ 01$%%/%##） 作者简介：王永山 （ #23/ 4 ） ， 男， 山 东 诸 城 人， 研 究 员， 博 士， 研 究 方 向 为 动 物 病 毒 学 与 分 子 生 物 学。 5)6： 738$’873%’%327； (-9： 738$’8 7%73"#"2， 7!7#!3/2； :8;-<6： =->?.@>?AB->$%%# C .-B@@D E@;D E> 收稿日期：$%%38%/8#/； 接受日期：$%%38%"8#%； 修回日期：$%%38%"8$/
［$， /］ 位， 在 HM/ 上也发现了 # 个线性中和抗原表位 。 （ ;I*） 从 前期， 本课题组运用 ’ 株 F0GH 单克隆抗体
!"!"! 抗 体： ’ 株 F0GH 单 克 隆 抗 体： YZ(# 和 抗体亚类均为 F?J#， 由河南省农业科学院生 YZ("， 物技术研究所惠赠； 抗体亚类为 F?J#， 由中国 0/!， ［’］ 抗体 兽药监察所陈光华研究员惠赠 ； $0# 和 $J7，
［3］ 亚类分别为 F?J# 和 F?J$， 由本课题组制备 ； 相加 这 ’ 株单克隆抗体对应不同的病毒抗 :RFKI 分析，
原表位， 病毒中和试验证明 0/! 和 $J7 对 F0GH 具 ［’， 3］ 有中和作用 。 F0GH 免疫血清系用 F0GH 分离毒 （以 株 [0 和 5I/ 制备的纯化病毒抗原免疫兔获得
用 DDDP 四肽 串 构建多表位模拟肽基 联 （R(S1JR(S8J47?J$41J$D%） 因， 命名为 B-!OL， 长度 $71&!， 编码 8Q++。将 B-!OL 分 成 Q 个片段 （ S1 T SQ ） 合成， 长度均为 B?.U， 各片段两 端有互补部分， S1 、 S7 、 SB 片段为正向链， S$ 、 S? 、 SQ 片 。6(9 合成自上海博亚公司。 段为反向链 （图 1） !"# 多表位基因的克隆 将合成的 Q 个 6(9 片 段 按 等 摩 尔 数 混 合、 退 火， 以 6(9 聚合酶 ! （ :;-.)< 片段） 补链， 用 !061%J 获 得 B-!OL 重 组 克 隆 质 粒 !06JB-!OL。 # 载 体 克 隆， 用 !"# !和 $%& ="酶切分析、 对插入片段测序。 !"% 多表位基因的表达 根据 !"#$%& （’） 启动子下 游 阅 读 框， 将 B-!OL 基因的克隆质粒 !06JB-!OL 和 !"#$%& （’） 用 !"# ! 和 $%& ="酶切， 回收 !06JB-!OL 的 $%2&! 片段 （克隆 后的 B-!OL 基因两端加了 !061%J# 载体的多个限制 性酶 切 位 点 序 列） 和 !"#$%& 的 BV7A& 片 段， 用 #? 构建 B-!OL 基因表达质粒 6(9 连接酶连接两片段， 涂布于含终浓度为 72 !"#JB-!OL。转化 /0123， ,WK5 # 卡那霉素 （ A+.） 的 54 琼脂平板上， 78X 培养 1?M。挑 取单菌落， 接种在 7K5 含 A+. 的 54 培养基中， 振荡 抽 提 质 粒， 酶 切 鉴 定 后 再 用。纯 化 !"#J 培养 1?M， （ 6"7） ， 挑取单菌落， 接种在 7K5 含 B-!OL 转化 45$1 以 A+. 的 54 培养基中， 78X 振 荡 培 养 1?M。次 日， 1Y 接种在含 A+. 的新鲜 54 培养基中， 78X 振荡培
［?］ ［%， 3］
体进行平行试验， 分析 @B">CP 的特异性和免疫反应 性。简述之： !"#JB-!OL 重组菌诱导表达， P6PJ>9D" 分析 （分离胶浓度 1BY ） ， 电泳转移， 用抗 C46Z 单克 标记的兔抗鼠 C,D 先后与 隆抗体和碱性磷酸酶 （9>） 转移膜反应， 显色。在用 C46Z 多克隆抗体进行的 平行对照试验中， 只是用 C46Z 多克隆抗体和 9> 标 其它与单克隆抗体 记的羊抗兔 C,D 替代对应抗体， 试验相同。试验同步设 45$1 （ 6"7） 和 !"#$%& 转化 的 45$1 （6"7） 菌对照。 !", ’&()*+ 对兔的免疫试验 用雌性新西兰兔 7 只， 体重约 1VBA,， 进行兔体
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（$228） （1） ?8 H9(D ^).,JLM+. ’( ") _ W *#(" +%#,-.%-)-/%#" !%&%#"
（’） 分别购自南京生兴生物技术公司和 !"#$%& （ 6"7） 为本 ()*+,-. 公司。大肠杆菌 /0123 和 45$1
［8］ 。 课题组保存
加入终浓度为 1KK);W5 的 C>#D 诱导， 养 $M， 78X 继 续培 养 ?M。取 1VBK5 细 菌 培 养 液， 高 速 离 心， 用 扫描分析重组多表位蛋 P6PJ>9D" 分析沉淀的菌体， 白 （命名为： 的表达量。实验同步设立 45$1 @B">CP） （6"7） 和 !"#$%& 转化的 45$1 （6"7） 菌对照。 !"& ’&()*+ 的免疫反应性分析 以免疫印迹法用 C46Z 单克隆抗体和多克隆抗
疫血 清 与 单 克 隆 抗 体 腹 水 经 （ ZY! ） $ K\! 盐 析 和 G:I:8纤维素纯化后使用。 质粒和菌种： 噬菌体展示 #$ 肽库试剂 !"!"# 肽库、 盒 （ MB D GD 8#$5] MB-?) G<AL6-. M)LX<Q) R<*+-+. 1<X） 购自 " Z:^ :ZJRIZG 0<@R-*A 公 司。 载 体 L]G#785 和
要： 用 ’ 株传染性法氏囊病病毒 （ F0GH） 单克隆抗体 （;I*） 从噬菌体随机肽库中得到了 ’ 个含有不同 F0GH 抗原
表位的模拟肽序列。在此基础上， 将 ’ 个抗原表位用 JJJK 四肽连接构建多表位基因 ’)L<A。将该基因合成、 克隆 在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白 +’:MFK， 经 KGK8MIJ: 分析， 后， 构建原核表达质粒 L:58’)L<A， +’:MFK 占菌体总蛋 白的 #’N 、 分子量 #%OG-。用 F0GH 单克隆抗体和多克隆抗体对 +’:MFK 进行免疫印迹对比分析， 结果表明， +’:MFK 具 免疫 $ 次， 间隔 "Q， 用 F0GH 间接 :RFKI 有 F0GH 特异性和免疫反应性。将 +’:MFK 经皮下注射免疫兔， !%% ?P 只 P 次， ! 检测血清抗体， 第一次免疫 "Q 后抗体效价为 # S !%%%， 第二次免疫 #!Q 后抗体效价升高到 # S $’3%%%， 说明 +’:MFK 可诱 导机体产生 F0GH 特异性抗体。用 +’:MFK 加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡， 免疫 $ 次后， 血清抗体效价可 ’% ?P 只 P 次， ! 用 $%% 个 :RG’% F0GH 超强毒株 JT7P22 攻击实验鸡， 而单用佐剂对照组的死亡 达到 # S #$7%%， +’:MFK 免疫组全部存活， 率为 73U"N （#/P#’） ， 证明 +’:MFK 可诱导机体产生抗 F0GH 感染的保护性免疫应答， 预示构建的 ’)L<A 可作为 F0G 多 表位疫苗研究的候选基因。 关键词：传染性法氏囊病病毒；抗原表位；表达；免疫原性 中图分类号： V7’$U3’ 文献标识码： I 文章编号： %%%#83$%2（$%%"）%#8%#$#8%’