《动物毒理实验》课件：实验3 皮肤刺激性试验

毒理学实验三毒理学实验三皮肤刺激、眼刺激试验一、实验目的1、掌握家兔备皮技术2、掌握皮肤刺激性试验方法3、掌握家兔眼刺激试验方法4、学会观察受试物对皮肤和眼的损害作用二、实验材料与器材1、试验动物：家兔，每组1只，4人1组2、器材：手术剪、镊子、注射器，滴管、纱布、无刺激性胶布、玻璃纸三、实验内容及试验方法1、家兔脱毛及皮肤染毒（1）准备：备皮（家兔背部脊柱两侧），不要伤皮肤，范围3 cm×3 cm；（2）染毒：取受试物0.5 ml(500μg)涂一侧皮肤，另一侧为对照（记号笔画）；（3）2.5 cm×2.5 cm两层纱布覆盖，加一层油纸后，无刺激性胶布固定；（4）固定时间10min；（5）10min后，用温水除去残留受试物；（6）除去受试物后10min 、20min、30min 观察，对皮肤刺激反应进行评分，评价刺激强度。

2、皮肤刺激反应观察、评分及评价（1）10min 、20min、30min分别评分，每个时间段除以实验动物数（每只动物平均分）选最高分为总积分（最强刺激）(见评价表)；（2）皮肤刺激：红斑和水肿（不同程度），按表评价刺激强度；（3）多次皮肤刺激试验试验时间为14天，每天涂抹，1 小时后观察，总积分为总和除以实验动物数（每只动物）。

3、家兔眼染毒（1）染毒：受试物0.1ml(100g)滴入家兔一侧眼结膜囊内（轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑），另一侧作为空白对照；（2）冲洗：被动闭合1秒（分以下三种情况）(不冲洗、4秒后冲洗、30秒后冲洗）（生理盐水冲洗)；（3）观察：记录10s、20s、30s眼局部反应和恢复情况，必要时用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜的变化；4、眼刺激反应观察、评分及评价四、实验结果1、皮肤刺激反应观察、评分及评价（1）实验观察结果及评分记录10min：红斑形成（0分），水肿形成（0分）。

20min：红斑形成（0分），水肿形成（0分）。

实验三一次给药皮肤刺激实验一、实验目的掌握皮肤染毒技术，了解受试物对皮肤是否有刺激或腐蚀作用。

二、实验器材1、实验动物：小鼠24只，每组4只2、材料共用：剃毛器1把、剪毛剪2把、记号笔1支、透明胶1卷、纯桉叶油素10 mL、50%桉叶油素10 mL、25%桉叶油素10mL、3%吐温80 10mL、清洁温水500 mL 每组：长镊子1支、医用手套2双、、注射器（1 mL）1支、烧杯（50 mL）1个、纱布（1.5 cm×1.5 cm）8张。

三、实验内容与步骤1、保定：一人用一手抓住小鼠颈部皮肤，另一手抓住小鼠尾部，轻轻按住固定在操作台面上。

2、剃毛：小鼠保定后，一人用电动剃毛剪将小鼠背部脊柱两侧的毛剃净，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约2 cm×2 cm。

注意需将皮肤绷紧，把剪刀贴紧皮肤剪，但不可用手提起被毛，以免剪破皮肤；依次剪毛，不要乱剪；剪下来的被毛集中在一个装水的烧杯内，勿遗留在和操作台周围。

3、破损皮肤的制备：给药前24 h，用75%酒精消毒小鼠裸露皮肤部位，用消毒针头在剃毛部位做“井”字状划划痕，划破皮肤，以有组织液和血液渗出为度。

3、染毒：吸取1 mL受试物滴于两层灭菌纱布（1.5 cm×1.5 cm）上，将浸有受试物的纱布覆盖在左侧裸露皮肤区域，用透明胶布固定，右侧皮肤以3%吐温80为对照。

4、观察：一次给药4 h后，以温水洗去残留受试物，观察1 h，24 h、48 h、72 h涂抹部位的红斑和水肿等反应。

按表1进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，将观察结果填入表3中。

5、结果判定：根据24、48和72 h各观察时点最高积分均值，按表2判定皮肤刺激强度。

6、实验分组：见表4四、注意事项在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；做好实验观察记录。

五、思考题皮肤刺激实验与皮肤毒性实验有何区别？表 1 皮肤刺激反应评分表3 皮肤刺激强度分级表 3 桉叶油素对小鼠急性皮肤刺激性试验结果动物编号1 h 24 h 48 h 72h样品对照样品对照样品对照样品对照红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分红斑水肿总分1234总积分均值刺激强度分级表4 实验分组情况组别ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ完整皮肤100% 50% 25% 100% 50% 25% 完整皮肤100% 50% 25% 100% 50% 25% 破损皮肤100% 50% 25% 100% 50% 25% 破损皮肤100% 50% 25% 100% 50% 25%。

四、皮肤刺激性腐蚀性试验四、皮肤刺激性/腐蚀性试验Dermal Irritation/Corrosion Test1 范围本规范规定了动物皮肤刺激性或腐蚀性试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。

2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.404, July 1992)USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series 870. 2500, Aug. 1998 )3 试验目的确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度。

4 定义4.1 皮肤刺激性(Dermal irritation):皮肤涂敷受试物后局部产生的可逆性炎性变化。

4.2 皮肤腐蚀性(Dermal corrosion):皮肤涂敷受试物后局部引起的不可逆性组织损伤。

5 试验的基本原则将受试物一次(或多次)涂敷于受试动物的皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。

采用自身对照，以评价受试物对皮肤的刺激作用。

急性皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。

6 试验方法6.1 受试物液体受试物一般不需稀释，可直接使用原液。

若受试物为固体，应将其研磨成细粉状，并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。

使用其它溶剂，应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响。

受试物为强酸或强碱(pH值 ?2或?11.5)，可以不再进行皮肤刺激试验。

此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD小于200mg/kg体重或在急性经皮毒性试验中受试50物剂量为5000mg/kg体重仍未出现皮肤刺激性作用，也无需进行急性皮肤刺激性试验。

6.2 实验动物和饲养环境多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。

应使用成年、健康、皮肤无损伤的动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。