项目四 单相免疫扩散试验

第二十四章免疫诊断免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究。

在临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、发病机制的研究，病情监测与疗效评价等。

如传染病、免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、移植排斥反应、超敏反应等。

随着免疫学理论的进展和相关技术的发展，检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。

本章仅介绍免疫诊断常用技术的原理、基本步骤及其应用。

第一节抗原或抗体的检测一、抗原抗体反应的原理抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在经典的凝集试验及沉淀试验中，有盐离子存在时，多分子聚合，如分子比例恰当出现肉眼可见反应。

（一）抗原抗体反应的特异性一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。

抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。

抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。

此外，反应的条件与抗原抗体的结合力也有关系。

例如适宜的温度、酸碱度、离子强度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子间相互结合。

用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗）。

由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体（简称二抗）。

用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum)。

抗血清在免疫学检测中十分常用。

例如，用某种细菌免疫家兔制备的抗血清含有一抗，而将兔血清Ig免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig血清，即二抗。

在检测标本中的某种细菌时，可单独使用一抗，因为一抗与该细菌的结合是特异的；也可在使用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，来检测一抗所识别的细菌。

第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。

二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。

当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。

2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。

同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。

3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。

沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。

当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。

四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。

（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。

稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。

实验单向免疫扩散(Single immunodiffusion) 一、大体原理免疫沉淀反映是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情形下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。

据此现象设计的沉淀实验要紧包括絮状沉淀实验，环状沉淀实验和凝胶内的沉淀实验。

凝胶内的沉淀实验依所用的实验方式又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。

单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反映定量实验。

一样是用已知抗体测定未知量的相应抗原。

由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原多余，单向免疫扩散实验常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反映的效价。

因此一般是把抗体先混合在琼脂中，以不同稀释度的抗原在琼脂中扩散。

将定量抗体与熔化的含缓冲液的琼脂均匀混合，倾注平板，凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入待检抗原溶液，放室温或37℃让其自由扩散，24-48h后，可见孔的周围显现沉淀环。

抗原在必然范围内，沉淀环的直径与抗原的量成正相关，因此能够依照沉淀环的大小确信相应抗原（抗体）的量。

单向免疫扩散实验是一种定量实验，要紧用于血清中免疫蛋白（IgG、IgM、IgA）含量的测定。

单向免疫扩散示用意二、材料与器材(一)抗体：标准羊抗人IgG单价抗血清（抗体）（商品有售）。

(二)抗原：①工作标准参考蛋白（IgG，含量10mg/ml）（参考血清）（商品有售），②人全血清（作为待测血清），(三)生理盐水（采纳%的生理盐水），(四)其他用品：打孔器（孔径3mm），微量加样器（10微升），小离心管、载玻片、湿盒、量尺、水浴箱等。

三、实验方式（一）标准曲线的制备：（１）制备含抗体的琼脂凝胶板：A、制胶：用生理盐水配制%琼脂糖凝胶，微波炉中煮沸熔化至澄清后，移置56℃水浴箱中保温备用。

量取56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入氨苄青霉素（200μl/ml），和羊抗人IgG 抗体（1︰60，v/v）充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。

另再制备不加抗体与氨苄青霉素的%琼脂凝胶50ml，煮沸熔化至澄清。

常见的免疫检测技术(一)皮内试验(intrader rpmal test,ID) 宿主在病原体刺激后，体内产生亲细胞性抗体(IgE和IgG4)。

当其与相应抗原结合后，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性物质，引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红晕，以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在。

(二)免疫扩散(immunodiffusion)和免疫电泳(immunoelectrophoresis)1．免疫扩散于一定条件下，抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇，在二者含量比例合适时形成肉眼可见的白色沉淀。

本法有两种类型：①单相免疫扩散：将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使抗原溶液在凝胶中扩散而形成沉淀环，其大小与抗原量成正比；②双相免疫扩散：将抗原与抗体分别置于凝胶板的相对位置，二者可自由扩散并在中间形成沉淀线。

用双相免疫扩散法既可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。

2．免疫电泳是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合的一项技术。

事先将抗原在凝胶板中电泳，之后在凝胶槽中加入相应抗体，抗原和抗体双相扩散后，在比例合适的位置，产生肉眼可见的弧形沉淀线。

(三)间接红细胞凝集试验(indirect haemagglutination test，IHA) 以红细胞作为可溶性抗原的载体并使之致敏。

致敏的红细胞与特异性抗体结合而产生凝集，抗原与抗体间的特异性反应即由此而显现。

常用的红细胞为绵羊或O型人红细胞。

(四)间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody method，IFA)vvv 本法用荧光素(异硫氰基荧光素)标记第二抗体，可以进行多种特异性抗原抗体反应，即可检测抗原又可检测抗体。

本法具有较高的敏感性、特异性和重现性等优点，除可用于寄生虫病的快速诊断，流行病学调查和疫情监测外，还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和鉴定抗原、抗体和免疫复合物。

(五)对流免疫电流试验(counter-immunoelectrophoresis，CIE) 对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速，敏感的电泳技术。

单相琼脂扩散试验的临床意义
引言：
单相琼脂扩散试验是一种常见的临床检测方法，它可以通过测量琼脂扩散的速度来判断人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。

本文将从理论原理、实验方法和临床应用三个方面来探讨单相琼脂扩散试验的临床意义。

理论原理：
单相琼脂扩散试验是基于弗里德曼定律的原理而设计的。

弗里德曼定律指出，在一定温度下，溶质在溶剂中的扩散速度与其浓度成正比，与扩散距离成反比。

因此，通过测量琼脂扩散的速度，可以推算出溶质的浓度。

实验方法：
单相琼脂扩散试验的实验方法相对简单，只需要将待测物质加入琼脂中，然后观察琼脂扩散的速度即可。

通常情况下，实验会在恒定的温度和湿度下进行，以保证实验结果的准确性。

此外，实验中还需要控制琼脂的厚度和形状，以确保实验结果的可比性。

临床应用：
单相琼脂扩散试验在临床上有着广泛的应用。

例如，在肝功能检测中，可以通过单相琼脂扩散试验来测量血清中胆红素的浓度，从而判断肝
功能是否正常。

此外，在肾功能检测中，单相琼脂扩散试验也可以用
来测量血清中肌酐的浓度，从而判断肾功能是否正常。

此外，单相琼
脂扩散试验还可以用来检测血液中的葡萄糖、脂肪、蛋白质等物质的
浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。

结论：
单相琼脂扩散试验是一种简单、快速、准确的临床检测方法，它可以
用来测量人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。

在未来，随着科技的不断发展，单相琼脂扩散试验将会有更广泛
的应用，为人类健康事业做出更大的贡献。

1. 理解单向琼脂扩散实验的原理和方法。

2. 掌握实验操作技巧，包括制备琼脂板、打孔、加样、观察结果等。

3. 分析实验数据，如扩散速率、扩散系数等。

4. 探究单向琼脂扩散实验在实际应用中的作用和意义。

二、实验原理单向琼脂扩散实验是一种常用的免疫学检测方法，用于定量检测标本中的抗原。

其原理如下：将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，然后在板上打孔，孔中加入待测抗原。

抗原会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。

当抗原与抗体比例适宜时，形成白色沉淀环。

沉淀环的直径与抗原含量成正比。

通过测定沉淀环的直径，可以计算出标本中抗原的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 羊抗人IgG血清- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）- 载玻片、打孔器、37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 打孔器- 显微镜1. 制备琼脂板：将1%琼脂粉与0.01M PBS缓冲液混合，加热溶解，倒入载玻片上，待凝固后制成琼脂板。

2. 打孔：在琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔。

3. 加样：向孔内滴加羊抗人IgG血清、标准参考血清、待检人血清，每孔10 μl。

4. 扩散：将琼脂板放入湿盒中，37℃恒温箱中扩散24小时。

5. 观察结果：观察琼脂板上是否形成白色沉淀环，并测量沉淀环的直径。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 标准参考血清孔中形成明显的白色沉淀环。

- 待检人血清孔中也形成白色沉淀环，但直径较小。

2. 结果分析：- 标准参考血清孔中的白色沉淀环表明琼脂板制备成功，抗体与抗原发生了特异性结合。

- 待检人血清孔中的白色沉淀环表明待检血清中含有与羊抗人IgG血清特异性结合的抗原。

根据沉淀环的直径，可以计算出待检血清中抗原的含量。

通过制作标准曲线，可以进一步确定待检血清中抗原的具体含量。

项目四单相免疫扩散试验(Single immunodiffusion test)【实验原理】单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。

将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。

抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。

【试剂和器材】1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。

2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。

3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。

4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。

5．水浴箱、水平台。

【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。

取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。

2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。

将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。

用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。

3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。

要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。

标准抗原孔待检血清孔图1-4单相免疫扩散试验4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。

将待检血清用生理盐水1:50稀释。

按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。

表1-3 血清稀释表稀释倍数12.5 25 50 100 200IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.25．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。