单向免疫扩散试验1

项目四单相免疫扩散试验(Single immunodiffusion test)【实验原理】单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。

将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。

抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。

【试剂和器材】1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。

2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。

3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。

4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。

5．水浴箱、水平台。

【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。

取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。

2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。

将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。

用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。

3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。

要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。

标准抗原孔待检血清孔图1-4单相免疫扩散试验4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。

将待检血清用生理盐水1:50稀释。

按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。

表1-3 血清稀释表稀释倍数12.5 25 50 100 200IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.25．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。

单向免疫扩散图片分析系统用于流感疫苗血凝素含量测定章春宇1 石 晶2(1 长春医学高等专科学校药学系 吉林长春 130031;2 东北师大基因工程有限公司吉林长春130024)摘 要 本文建立了一种基于自主研发图片分析软件的单向免疫扩散(S R I D)分析方法,通过SR ID图片导入、图片数据采集、数据分析、系列标准品误差分析、数据存储输出等环节完成抗原或抗体含量的分析工作。

该方法操作简单,自动化程度较高,省时省力且误差较小,适用于疫苗的大规模生产检验。

应用S R I D图片分析系统对H1N1型流感裂解疫苗进行血凝素含量测定,同时与传统手工测量方法进行比较,从线性、重复性、回收率三个方面对该系统进行验证。

线性测量结果表明,SR ID图片分析系统标准曲线的相关系数均大于0 99,且平均相对偏差为0 21%;手工方法测量的相关系数低于0 99,平均相对偏差为1 14%。

S R I D图片分析系统重复性试验的相对偏差、变异系数均较游标卡尺方法小,重现性较好。

回收率试验结果表明,SR ID图片分析系统测量值与真实值基本一致,回收率相对平均偏差均小于1%,游标卡尺测量方法测量值与真实值存在一定偏差,相对平均偏差大于4%。

关键词 图片分析系统 单向免疫扩散 血凝素 流感疫苗由于流感病毒主要表面抗原血凝素(H e m ag glutinin,HA)和神经氨酸酶(Neura m idi n ase,NA)经常发生变异,从而逃避机体免疫系统,因此易感人群(老人、新生儿及其他免疫力低下群体)每年均需接种流感疫苗[1]。

由于需根据WHO每年公布的毒株进行流感疫苗的生产,也为生产企业带来了时间压力[2]。

因此建立一种简便快速的流感疫苗质量控制方法具有重要实践意义。

应用单向免疫扩散方法(Sing le Radia l I m m u nod iffusion,SR I D)进行抗原或抗体含量的测定已广泛应用于生物医药的检测、分析及质量控制领域。

一、实验名称单向扩散试验二、实验目的1. 了解单向扩散试验的原理和操作方法。

2. 掌握实验操作技巧，提高实验操作能力。

3. 分析扩散速率和扩散系数等数据。

4. 探究单向扩散试验在实际应用中的作用和意义。

三、实验原理单向扩散试验是一种利用抗原抗体特异性结合原理，通过观察抗原在琼脂凝胶中的扩散情况，以定量测定抗原浓度的方法。

实验中，将抗体加入琼脂凝胶制成免疫琼脂板，打孔后加入待测抗原，抗原在琼脂凝胶中向四周扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在两者相遇处形成白色沉淀环。

沉淀环直径与抗原浓度成正比。

四、实验器材与试剂1. 试剂：- 羊抗人IgG血清（兔抗人血清）- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）2. 器材：- 载玻片- 打孔器- 37℃恒温箱- 湿盒- 可调微量加样器五、实验步骤1. 制备抗体琼脂板：将琼脂粉与pH7.4 0.01M PBS缓冲液混合，加热熔化，加入羊抗人IgG血清，搅拌均匀后，倒入载玻片制成琼脂板。

2. 打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为5毫米。

3. 加样：用微量加样器将标准参考血清和待检人血清分别加入中央孔和周围孔中。

4. 置于湿盒中：将加样后的琼脂板放入湿盒中，置于37℃恒温箱中扩散24~48小时。

5. 观察结果：观察琼脂板上的沉淀环直径，分析抗原浓度。

六、结果与分析1. 标准曲线绘制：以标准参考血清的浓度为横坐标，对应的沉淀环直径为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 待检血清抗原浓度测定：将待检血清的沉淀环直径代入标准曲线，求出待检血清的抗原浓度。

3. 结果分析：根据实验结果，分析待检血清中抗原浓度与临床诊断的相关性。

七、结论本实验通过单向扩散试验成功测定了待检血清中抗原浓度，验证了实验原理和操作方法。

实验结果表明，单向扩散试验具有较高的灵敏度和特异性，适用于临床检测和科研工作。

第二十四章免疫诊断免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究。

在临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、发病机制的研究，病情监测与疗效评价等。

如传染病、免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、移植排斥反应、超敏反应等。

随着免疫学理论的进展和相关技术的发展，检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。

本章仅介绍免疫诊断常用技术的原理、基本步骤及其应用。

第一节抗原或抗体的检测一、抗原抗体反应的原理抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在经典的凝集试验及沉淀试验中，有盐离子存在时，多分子聚合，如分子比例恰当出现肉眼可见反应。

（一）抗原抗体反应的特异性一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。

抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。

抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。

此外，反应的条件与抗原抗体的结合力也有关系。

例如适宜的温度、酸碱度、离子强度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子间相互结合。

用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗）。

由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体（简称二抗）。

用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum)。

抗血清在免疫学检测中十分常用。

例如，用某种细菌免疫家兔制备的抗血清含有一抗，而将兔血清Ig免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig血清，即二抗。

在检测标本中的某种细菌时，可单独使用一抗，因为一抗与该细菌的结合是特异的；也可在使用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，来检测一抗所识别的细菌。

单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。

1、试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。

2、平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。

有两种计算方法：l）Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（>48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c/d2=k.（其中c为抗原浓度 d为沉淀环直径 k为常数）
3、单向扩散试验检测时的注意点：
（1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。

（2）每次测定都必须作标准曲线。

（3）每次测定时必须用质控血清作质控。

（4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。

（5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。

免疫应答主要分为哪几个阶段？1）识别阶段2）活化和增值阶段3）免疫效应中枢免疫器官和外周免疫器官有哪些器官组成？各有什么功能？1）中枢免疫器官：免疫细胞发生、分化、成熟的场所，如骨髓，胸腺2)外周免疫器官：免疫细胞产生应答的场所。

如脾脏，淋巴结，黏膜，扁桃体等。

T细胞、B细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？1）T细胞：介导细胞免疫，辅助体液免疫。

2）B细胞：产生体液免疫3）NK细胞：介导天然免疫，发挥细胞毒作用。

根据作用方式及其特点的不同，机体存在两类免疫简述各自的概念和特征？1)先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。

其主要特征是反应迅速，针对外来异物的范围较广，不针对某个特定异物抗原，也称非特异性免疫。

2)适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。

其主要特征是针对某个特定的异物抗原而产生免疫应答，开始的应答过程比较缓慢，一旦建立清除该抗原的效率很高，特异性很强，也称特异性免疫。

简述抗原抗体反应的原理。

答：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的，它们之间的结合是抗原表位与抗体超变区沟槽分子表面的结合简述抗原抗体反应的类型。

答：抗原抗体反应分为五种类型：①颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；②可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；③抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；⑤免疫标记的抗原抗体反应等。

什么是带现象?答：在抗原抗体反应等价带前后，由于抗体或抗原过量(形成前带或后带)，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少，不出现可见反应，这种现象在做血清学试验时称为带现象。

影响抗原抗体反应的环境条件有哪些?在实验中如何控制这些条件因素?答：环境条件包括：电解质，酸碱度和温度。

第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。

二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。

当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。

2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。

同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。

3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。

沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。

当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。

四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。

（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。

稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。