罗汉果[Siraitia g r osv enorii (Sw in g le) C.Jeffre y]为我国传统保健药材,是一种极具开发潜力的天然产物资源,罗汉果甜苷是罗汉果中主要有效成分,具有广泛的生物特性,其中罗汉果苷Ⅴ为罗汉果果实中含量和甜度均较高的成分,其含量约为1%,甜度相当于蔗糖的350倍,是主要的甜味成分[1]。
罗汉果甜苷属于葫芦烷三萜甙类(cucurbitane g l y cosides)型化合物,具有安全,味质好,没有异味;甜度高;热稳定性好;颜色浅;使用简便;使用时不受p H值影响(p H值介于2～10间)等特性。
FDA(美国食品药物管理局)于1995年批准罗汉果甜苷应用于食品上,我国也于1996年7月的全国食品添加剂委员会第十七次会议上批准该产品作为食品添加剂,目前,允许罗汉果甜苷作为食品添加剂的国家和地区有:日本、韩国、台湾、香港、泰国、新加坡和英国等[2]。
本文对1993年以来在罗汉果甜苷提取分离纯化、测定及生物活性等方面的研究进行综述。
1罗汉果甜苷提取分离与测定1.1提取分离如何将有效成分高效率地提取是中药开发和中药现代化研究的关键技术之一。
罗汉果甜苷是罗汉果主要活性成分,随着罗汉果甜苷在食品药品等领域的广泛应用,如何最大限度利用罗汉果资源,提高罗汉果甜苷品质特别引起人们的重视。
李雁群等[3]采用国产材料和较为简单的方法来提取和纯化罗汉果甜苷,以水为溶剂的甜苷得率比乙醇水溶液的得率高,溶剂量以原料重6倍为宜;Ca(OH)2作澄清剂比明矾、AlC l3效果好,而且不会带来很大的甜苷损失,澄清宜在室温下进行;强碱树脂D290和D280比酸性树脂的脱色效果好,脱色宜在25℃下慢速操作;A B-8吸附树脂吸附罗汉果甜苷的操作宜在20℃左右的室温下以SV2的流速操作;用50%乙醇水溶液可以使罗汉果甜苷从A B-8吸附树脂上解吸。
李俊等[4]采用正交试验设计对干罗汉果中罗汉果甜苷的乙醇提取工艺进行了系统研究,优选了工艺参数,为规模化生产提供理论依据,采用最佳工艺:用30倍原料重的30%乙醇,在75～80℃微沸状态下提取3h,得提取物中罗汉果甜苷含量为60%。
朱晓韵等[5]采用了正交试验法考察了微波技术对水提罗汉果甜苷收率的影响,优选出最佳工艺为:鲜罗汉果投料物液比为1∶8、微波输出功率为750W、提取时间15m in,微波提取罗汉果甜苷的效率明显优于常规水煮法,罗汉果甜苷得率达7.346m g/g,比常规水煮法提高21.87%,是一种省时、省能、操作简便的新提取方法。
马少妹等[6]采用超声提取,探索乙醇提取罗汉果甜苷的新工艺,采用超声波辅助提取这一新型提取技术,提高了罗汉果甜苷的提取率,为罗汉果甜苷的工业化提取提供参考依据和方法。
最佳工艺分3次提取。
李军生等[7]认为超声波处理能明显提高罗汉果甜苷的提取率,高频率的超声波对罗汉果甜苷提取的影响要比低频率的明显。
在同一频率下,罗汉果甜苷的提取率随着输出功率的提高而提高,另外值得注意的是使用频率为50kH z的超声波,其输出功率虽然只有80w,但是其提取效果比频率为28kH z输出功率为200W或400W的超声波都好。
说明罗汉果甜苷提取与超声波的频率相关。
1.2分离纯化为获得高纯度的罗汉果甜苷,从20世纪70年代开始,不少学者对罗汉果甜苷纯化工艺进行研究,但所用的分离纯化方法多是采用无机吸附剂和无机脱色剂,如活性炭、氧化镁、硅酸镁等,操作工艺复杂,难以工业化生产。
随着仪器设备技术的发展,不少研究者对罗汉果甜苷精制工艺进行优化研究,李雁群等[8,9]初步研究了大孔吸附树脂A B-8对罗汉果皂甙的吸附性能,比较了15℃和65℃下的吸附速度,获得了在SV2、SV5、SV8三种空速下的穿漏吸附量;并提出用正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶1)的混合溶剂做流动相,硅胶做固定相的层析柱用来分离罗汉果甜苷,效果明显。
刘钟栋[10]提出采用大孔吸附树脂与离子交换树脂联用对罗汉果甜苷Ⅴ的精制工艺,交换树脂对经过吸附处理的罗汉果洗脱液的处理条件为:p H5.0,洗脱液浓度1%,罗汉果甜罗汉果甜苷的提取与药理作用研究概况农毅清广西壮族自治区南宁食品药品检验所530001南宁市明秀东路228号蒋林广西中医学院制药厂530023关键词罗汉果甜苷;提取;药理作用;综述中图分类号:R284.2;R285.5文献标识码:A文章编号:1003-0719(2008)01-0006-03 6・6・(总)广西中医药2008年2月第31卷第1期苷Ⅴ的得率为0.7%。
余丽娟等[11]提出了具有操作简便、重现性好、产品纯度高等优点的高效液相色谱法制备罗汉果甜苷Ⅴ标准品工艺。
戚向阳等[12]根据罗汉果甜苷的结构及特性,通过改进和优化大孔吸附树脂分离纯化罗汉果皂甙的工艺条件,探讨高纯度罗汉果甜苷提取物制备的新法,为进一步规模制备高纯度罗汉果甜苷及深入研究罗汉果甜苷的生物活性提供新的途径。
其结果罗汉果皂甙中几种主要成分的含量均高于分离前的罗汉果皂甙水提物,其中罗汉果皂甙Ⅴ的含量为69.24%,提高了41.12%。
1.3含量测定为更准确评价罗汉果甜苷的含量和品质,不少学者对罗汉果甜苷定量检测方法进行方法学研究。
目前测定罗汉果皂甙多采用比色法,如李雁群等[9]用香草醛硫酸试剂做显色剂的比色定量测定罗汉果皂甙的含量。
高山林[13]、黎海彬等[14]用香草醛-高氯酸比色法测定罗汉果中皂甙的含量,并提出用香草醛-高氯酸为显色剂的最佳条件。
该方法操作简单,灵敏度高且比较准确。
但分光光度法的稳定性及专属性不是很理想,为建立更好的罗汉果甜苷的检测方法,梁成钦等[15]建立采用薄层扫描法测定罗汉果糖苷Ⅴ含量的方法,点样于硅胶G板上,以正丁醇-乙醇-水(8∶2∶3)为展开剂,10%硫酸乙醇显色,单波长反射法锯扫描,λ=500nm。
罗汉果糖苷Ⅴ在2.0～16.0μg范围内具有良好的线性关系,平均回收率97.62%,RS D为2.59%(n=4)。
陈维军等[16]建立罗汉果甜苷的高效液相色谱分离条件及罗汉果皂苷Ⅴ的HP LC定量分析方法。
该方法可使罗汉果甜苷提取物中的主要皂苷成分达到基级分离,分离度良好,样品前处理过程简单。
李典鹏等[17]采用Z OR BAX S B-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水(25∶75)为流动相,流速1m l/m in,柱温25℃,二极管陈列检测器,检测波长为203nm,以外标法测定了罗汉果中罗汉果苷ⅡE、罗汉果苷Ⅲ的含量,罗汉果苷ⅡE在1.934～25.142μg,罗汉果苷Ⅲ在2.070～26.910μg范围内呈现线性关系,平均加样回收率为96.6%与97.9%。
张云竹等[18]建立一种快速高效的高效液相分析方法,可同时测定罗汉果中主要甜苷成分罗汉果甜苷Ⅴ、11-O-罗汉果甜苷Ⅴ、罗汉果甜苷Ⅳ以及赛门苷Ⅰ的含量。
郑玲等[19]采用高效液相色谱法测定了罗汉果甜苷中的甜蜜素。
结果显示,甜蜜素在样品溶液浓度为011～2m g/L范围内呈良好的线性关系,回收率为8919%～9417%,检出限为5m g/k g,测定结果的相对标准偏差小于5%。
方法操作简便,结果准确可靠。
2罗汉果甜苷药理作用211祛痰作用予罗汉果甜苷(纯度>98%)100m g/k g、200m g/k g灌胃,可明显增加小鼠气管酚红的排泌量,且呈剂量依赖关系;罗汉果甜苷以20m g/m l的浓度加蛙食道015h后,可明显加强其纤毛细胞运动[20]。
罗汉果皂苷(纯度50%)810g/k g剂量显著增加小鼠气管酚红排泌量,也显著增加大鼠排痰量(毛细玻管法)[21]。
罗汉果甜苷(总苷>80%)012g/k g、014g/k g、018g/k g灌胃,014g/k g、018g/k g剂量显著增加大鼠气管分泌物的量[22]。
212镇咳作用罗汉果甜苷(纯度>98%)80m g/k g、160m g/k g、320m g/k g灌胃,对氨水喷雾引咳小鼠均有镇咳作用,当剂量达160m g/k g和320m g/k g时,其表现出明显的镇咳作用且呈剂量依赖关系[20]。
罗汉果甜苷(纯度50%)410g/k g和810g/k g剂量对浓氨水诱发的小鼠咳嗽,有明显减少咳嗽次数的作用,810g/k g剂量对SO2诱发小鼠咳嗽的潜伏期有显著延长的作用[21]。
罗汉果甜苷(总苷>80%)012g/k g、014g/k g、018g/k g剂量对氨水诱发的小鼠咳嗽,均有明显减少小鼠咳嗽次数,但对氨水引咳潜伏期没有显著影响[22]。
213清除自由基及抗氧化活性[23]罗汉果甜苷提取物(总苷≥98%,罗汉果甜苷Ⅴ含量为65120%)对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用,并随着罗汉果甜苷提取物浓度的增加,清除效果逐渐增强,呈一定的剂量效应关系;罗汉果甜苷提取物对大鼠R BC体外温育过程中的氧化溶血反应有显著抑制作用,在0104～1115m g/m l范围内,罗汉果甜苷提取物对红细胞自氧化溶血的抑制率均超过了50%,罗汉果甜苷提取物对R BC自氧化溶血均有较好的保护作用;罗汉果甜苷提取物对R BC自氧化溶血的保护作用不呈剂量-效应关系,以中间剂量0146m g/m l为佳,抑制率为85155%;丙二醛(M DA)是脂质过氧化反应的终产物,可以用来评价脂质过氧化反应的强弱,罗汉果甜苷提取物对大鼠红细胞自氧化溶血时M DA生成有较强的抑制作用;罗汉果甜苷提取物对大鼠肝匀浆自发性生成M DA有较好的抑制作用。
以浓度01875m g/m l时的抑制效果最佳,达到23163%;罗汉果甜苷提取物可抑制大鼠肝组织的脂质过氧化,对Fe2+和H2O2诱导的肝组织过氧化损伤具有保护作用,能减少红细胞溶血的发生;罗汉果甜苷提取物可显著抑制肝线粒体M DA生成,且其抑制率随浓度的增大而增加。
214增强免疫[24]罗汉果甜苷给正常和环磷酰胺(CT X)抑制小鼠灌胃,对正常小鼠免疫功能无明显作用,但能显著提高CT X免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬功能和T细胞7・7・(总)广西中医药2008年2月第31卷第1期的增殖作用。
表明罗汉果甜苷对CT X免疫抑制小鼠的细胞免疫功能具有一定的正调节作用。
215对血糖的影响罗汉果甜苷(总苷>80%)011g/k g、012g/k g、014g/k g剂量对糖尿病小鼠模型,既没有降低也没有升高糖尿病小鼠已升高的血糖值;高剂量(014g/ k g)罗汉果甜苷没有显著升高正常小鼠的血糖值[22]。
一次性口服30%罗汉果甜苷200m g/k g,对健康成人的血糖含量与肝酶活性无明显影响。
罗汉果甜苷Ⅴ是一种不影响正常人血糖含量且安全的甜味剂[25]。
