植物核蛋白提取(蛋白组实验,质谱适用)

一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度2个小时(必要时过夜)，4度25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。

2．苯酚（phenol）提取法花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。

将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度 25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度 25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。

3．直接IEF buffer提取蛋白质直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。

植物细胞核蛋白质组学研究进展摘要细胞核储藏有植物体的主要遗传信息。

植物细胞核蛋白质组的动态变化直接影响植物基因表达调控，进而调节植物生长发育与环境应答过程。

细胞核蛋白质组学研究为解析植物发育与逆境应答的分子机制提供了重要信息。

综述了近年来植物细胞核蛋白质组学研究的进展，以促进其进一步研究。

关键词植物；细胞核；蛋白质组学中图分类号 q942.6 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）05-0225-02在高等植物中，除韧皮部成熟的筛管等极少数细胞外，其他细胞都具有细胞核。

细胞核是遗传信息的储存场所，承担着基因复制、转录和转录产物加工等功能，也是细胞遗传与代谢活动的调控中心。

研究细胞核的蛋白质组成与动态变化，对于深入解析植物发育与逆境应答过程中的基因表达调控的分子机制具有重要意义。

近年来，不断发展的高通量蛋白质组学技术平台为全面解析植物细胞核蛋白质表达谱与动态特征提供了良好的技术平台。

人们已经将双向电泳、色谱技术与生物质谱技术相结合，初步研究了水稻（oryza sativa）、维柯萨（xerophyta viscosa）、洋葱（allium cepa）、拟南芥（arabidopsis thaliana）、鹰嘴豆（cicer arietinum）和大豆（glycine max）等植物细胞核的蛋白质组特征。

本文综述了近年来植物细胞核蛋白质组学研究进展。

1 植物细胞核与核蛋白质的制备目前的植物细胞核蛋白质组学研究，主要是从植物幼苗或悬浮培养细胞中提取细胞核。

从幼苗中提取细胞核，首先在低温条件下将幼苗研磨成粉末，进而通过以percoll为介质的密度梯度离心富集细胞核[1]。

从悬浮培养细胞中提取细胞核，利用匀浆机破碎或细胞壁水解酶除去细胞壁，然后通过改变细胞内外渗透压破碎原生质体，并利用密度梯度离心富集细胞核[1]。

获得细胞核以后，通常利用dapi染色后的显微观察，或通过测定细胞核制备液中叶绿素含量等方法来评价细胞核的纯度。

植物提取蛋白质的方法植物提取蛋白质是一项关键的实验技术，它可以用于分离纯化和研究各种不同的植物蛋白质。

在这篇文章中，我将介绍一些常见的植物提取蛋白质的方法。

一、机械法提取蛋白质机械法提取蛋白质是最常见的提取方法之一。

机械方法能够充分破碎植物细胞壁，释放细胞液中的蛋白质。

这一方法相对简单，并且适用于大多数植物材料。

首先，将植物样品切碎，例如使用搅拌器或切割机。

然后，将样品置于高速搅拌器中，加入一定量的提取缓冲液。

提取缓冲液的选择会因不同植物而异，常见的包括Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。

随后，搅拌样品，使其充分混合，一般搅拌时间为30分钟到1小时。

搅拌完成后，使用离心机将混合液离心，离心时间和速度会因样品的不同而有所变化。

离心完成后，上清液中富含蛋白质，可以用于进一步的分离纯化。

二、化学法提取蛋白质化学法提取蛋白质是一种革命性的方法，它可以应用于很多不同类型的植物材料。

化学法提取蛋白质通常使用表面活性剂来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。

一个常用的化学法是使用Tween-20。

首先，将植物样品切碎，然后将样品与一定量的提取缓冲液一起加入离心管中。

提取缓冲液中含有Tween-20等表面活性剂，作用是破坏细胞膜结构。

然后，使用离心机将混合液离心，离心时间和速度的选择会因样品的不同而有所不同。

离心完成后，上清液中富含蛋白质，可以用于进一步的分离纯化。

化学法提取蛋白质相比机械法来说，可以更彻底地破坏细胞膜，更有效地释放蛋白质。

但是，使用化学方法也要注意表面活性剂的种类和浓度，过高的浓度可能会使得蛋白质变性。

三、酶解法提取蛋白质酶解法提取蛋白质是一种选择性高、过程温和的方法。

它利用酶的特异性作用，选择性地降解植物组织中的细胞壁，从而释放蛋白质。

酶解法的步骤较为简单。

首先，将植物样品切碎，然后加入适量的酶解缓冲液和适当浓度的酶。

酶解缓冲液的选择会因不同酶而异，常见的包括PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液等。

1、根据样品重量(1g样品加进3.5ml提取液，可根据材料不同适当加进)，预备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加进提取液中在冰上静置(3-4小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl(PH8)45ml2、甘油(Glycerol)75ml3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加进样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

3、加进等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加进裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放进-80℃备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。

裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的往离子水中(终体积为5ml)，使用前再加进1M 的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加进异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min离心：12000g，10min，4度，弃上清加进0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)振荡，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加进100％乙醇2ml充分振荡混匀，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)存在的题目：加进1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

植物蛋白提取概述植物蛋白提取是一种将植物中的蛋白质分离和提纯的过程。

植物蛋白具有许多重要的生理功能和营养价值，因此植物蛋白提取技术在食品、药品、化妆品等领域得到广泛应用。

本文将介绍植物蛋白提取的原理、方法和应用。

原理植物蛋白提取的原理是基于蛋白质的溶解性差异。

植物细胞壁中的蛋白质一般以自由态和结合态存在，其中自由态蛋白质溶解性较好，而结合态蛋白质溶解性较差。

利用不同提取剂可以改变蛋白质的溶解性，从而实现蛋白质的分离和提纯。

方法材料准备•植物样品：可以选择各类植物，如大豆、绿豆、花生等。

•提取剂：提取剂的选择与植物样品有关，常用的提取剂包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、甲醇、乙醇等。

•辅助试剂：可以根据需要选择添加一些辅助试剂，如酶解酶、蛋白酶抑制剂等。

提取步骤1.样品准备：将植物样品收集并洗净，去除杂质和残存的表面蛋白质。

2.研磨样品：将植物样品切碎或研磨，以增加溶解的效果。

3.提取液配置：根据实验需要选择合适的提取液，可以根据实验室的经验或相关文献进行选择和调配。

4.溶解与搅拌：将研磨的植物样品与提取液混合，在适当的温度和pH条件下进行溶解和搅拌一段时间，促使蛋白质溶解。

5.澄清和分离：通过离心、过滤等方法将植物样品中的残渣和杂质分离出去，得到含有蛋白质的澄清液。

6.浓缩和纯化：通过浓缩和纯化技术，将澄清液中的蛋白质进行富集和纯化，得到纯净的植物蛋白。

应用植物蛋白提取技术广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。

以下是一些常见的应用： 1. 食品加工：植物蛋白是一种重要的食品成分，可以用于调制各种食品，如豆腐、豆浆、植物肉等。

2. 药品制造：植物蛋白可以作为药物的原料，用于制备各种药品，如生物药物、保健品等。

3. 化妆品生产：植物蛋白可以用于制造各类面膜、护肤品、洗发水等化妆品，具有良好的保湿和滋养效果。

4. 农业应用：植物蛋白可以用作植物肥料、植物抗病等农业应用，促进植物生长和抗逆能力。

结论植物蛋白提取是一项重要的技术，可以将植物中的蛋白质分离和提纯，为食品、药品、化妆品等领域的生产和研发提供了重要的原料和支持。

一、实验目的1. 了解植物蛋白质提取的基本原理和方法。

2. 掌握三氯乙酸-丙酮法提取植物全蛋白的操作步骤。

3. 学习蛋白质含量测定的方法。

二、实验原理植物蛋白质是植物细胞内的重要组成部分，具有多种生物学功能。

本实验采用三氯乙酸-丙酮法提取植物全蛋白，该方法能够有效地使蛋白质变性并沉淀，同时阻止多酚氧化酶和其他氧化酶类失活，防止蛋白质互相结合形成难溶的复合体。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：新鲜植物叶片（如菠菜、甘蓝等）。

2. 试剂：三氯乙酸、巯基乙醇、丙酮、R2D2 蛋白质溶解缓冲液、UKS 蛋白质溶解缓冲液、IPG 胶条水化液。

3. 仪器：研钵和研槌、离心机、液氮、冰箱、电子天平。

四、实验步骤1. 植物材料处理- 将新鲜植物叶片洗净，用液氮快速冷冻，然后研磨成细小的粉末。

- 将约200 μl 粉末转移到 2 ml 的离心管中。

2. 蛋白质沉淀与变性- 加入 1.8 ml 预冷的三氯乙酸-2ME-丙酮溶液，混合后置于 -20℃ 冰箱中沉淀 1 小时。

- 三氯乙酸和丙酮可以使蛋白质变性并沉淀，同时阻止多酚氧化酶和其他氧化酶类失活。

3. 离心分离- 将混合液在4℃、48000 rpm 下离心 1 小时，弃去上清液。

- 加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07% 的巯基乙醇），摇匀后再次离心 1 小时。

- 弃去上清液，将沉淀用真空干燥箱干燥，备用。

4. 蛋白质溶解- 将干燥的沉淀加入适量的 R2D2 蛋白质溶解缓冲液，室温下放置 30 分钟，使蛋白充分溶于缓冲液中。

- 再次离心 1 小时，弃去上清液。

5. 蛋白质含量测定- 采用 Brandford 法测定蛋白质含量。

五、实验结果与分析1. 通过三氯乙酸-丙酮法提取植物全蛋白，实验成功得到了较高纯度的蛋白质。

2. 蛋白质含量测定结果显示，提取的蛋白质含量符合预期。

六、实验讨论1. 三氯乙酸-丙酮法是一种高效、简便的植物全蛋白提取方法，适用于多种植物组织。

2. 在实验过程中，需要注意以下几点：- 严格控制实验条件，如温度、pH 值等。

植物蛋白提取实验的意义
植物蛋白提取实验的意义
植物蛋白提取实验是一种使用植物组织的方法，用于从植物细胞中提取植物蛋白质。

它是植物蛋白质组学方法的重要组成部分，可以用于提取多种植物的蛋白质。

蛋白质提取实验不仅可以识别植物蛋白质的种类，而且还可以分析植物蛋白质的性质。

这在了解植物蛋白质生理活性和其他生物学功能方面具有重要意义。

植物蛋白提取实验具有多种功能。

例如，它可以用于发现新的植物蛋白质，以及研究其在植物体内的功能。

它还可以用于研究植物蛋白质的结构、生物化学属性和功能。

另外，它还可以用于测定植物蛋白质的表达水平，从而了解植物代谢的情况。

植物蛋白提取实验还可以用于开发新型植物蛋白质分离技术，以及研究植物的发育过程和环境因子的影响。

总之，植物蛋白提取实验具有重要的研究价值，可以为植物蛋白质的结构、功能和表达水平提供有益的信息，有助于研究和发展植物细胞和植物基因组学。

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植物蛋白质提取方法总汇1.机械破碎法机械破碎法是最常用的植物蛋白质提取方法之一、该方法通过机械破碎将植物细胞壁破碎，释放出细胞质中的蛋白质。

常用的机械破碎设备有研钵研磨器、研钵超声波破碎器等。

将植物样品与一定的溶液混合，使用机械设备进行研磨或超声处理，破坏细胞结构，使蛋白质溶于溶液中。

然后对提取的植物蛋白质进行离心、过滤等操作，得到纯化的蛋白质。

2.离心沉淀法离心沉淀法是一种将植物细胞破碎后进行离心来分离蛋白质的方法。

通过高速离心，植物细胞组分根据密度的差异分层沉淀，蛋白质可在上清液中得到。

常用的离心设备有高速离心机。

将植物样品与一定的溶液混合，通过高速离心将蛋白质与其他组分分离。

然后对上清液进行过滤、浓缩等操作，得到纯化的蛋白质。

3.溶剂提取法溶剂提取法是一种利用溶剂将植物蛋白质从细胞中提取的方法。

常用的溶剂有酸、碱、有机溶剂等。

将植物样品与溶剂混合，使用搅拌或超声处理进行提取。

然后对溶液进行过滤、浓缩等操作，得到纯化的蛋白质。

4.酶解法酶解法是一种利用酶对植物样品进行消化，将蛋白质释放出来的方法。

常用的酶有蛋白酶、细胞酶等。

将植物样品与酶混合，进行一定条件下的酶解反应。

然后对溶液进行离心、过滤等操作，得到纯化的蛋白质。

5.离子交换法离子交换法是一种利用离子交换树脂分离蛋白质的方法。

将植物样品与经过离子交换树脂平衡的缓冲液混合，在一定条件下，树脂上的蛋白质会与缓冲液中的其他组分进行离子交换，使蛋白质溶液净化。

然后对树脂进行洗脱等操作，得到纯化的蛋白质。

在植物蛋白质提取过程中，需要注意以下几个问题。

首先，应根据不同植物的特点选择合适的提取方法。

其次，提取条件的选择对提取效果有很大影响，包括提取溶剂的选择、激酶浓度和反应时间的控制等。

此外，还需对提取的蛋白质进行纯化和测定等后续处理。

总的来说，植物蛋白质提取方法有许多种，具体的选择应根据实际情况来确定。

不同的提取方法有其优缺点，需要综合考虑提取效率、纯度和操作等方面的因素。

提取植物蛋白的试剂及用途植物蛋白提取试剂是用于从植物细胞中提取和纯化蛋白质的化学试剂。

它们被广泛应用于生物医学研究、农业科学和食品工业等领域。

植物蛋白提取试剂可以通过多种方法提取蛋白质，包括化学方法、物理方法和生物化学方法。

以下是一些常用的植物蛋白提取试剂及其用途的举例。

1. 植物蛋白提取缓冲液：这种试剂是最基本的植物蛋白提取试剂之一。

它通常包含有盐类、缓冲剂和表面活性剂等成分，可以有效地破坏细胞壁，并使蛋白质从细胞中释放出来。

这种缓冲液通常用于提取植物细胞质蛋白，用途广泛，可以用于分析蛋白质结构和功能、实现酶的纯化和鉴定、探究植物蛋白质在生物学过程中的作用等。

2. 细胞壁分解酶：植物细胞壁是坚硬而复杂的结构，妨碍了蛋白质的提取。

细胞壁分解酶可以破坏细胞壁，促进蛋白质的释放。

例如，纤维素酶可以催化纤维素降解，木质素酶可以降解植物木质素等。

这些酶可以用于研究植物细胞壁的组成和结构，并提取特定类型的细胞壁相关蛋白质。

3. 蛋白质保护剂：这类试剂可以阻止蛋白质的降解和凝聚，保持蛋白质的活性和稳定性。

例如，EDTA可以螯合金属离子，抑制金属离子催化的蛋白质降解酶的活性。

DTT和β-巯基乙醇可以还原蛋白质的二硫键，防止蛋白质的降解。

这些保护剂在蛋白质提取和制备过程中使用，有助于保持蛋白质的完整性和活性。

4. 蛋白质沉淀试剂：植物蛋白质提取后常常需要进行纯化。

沉淀试剂可以使蛋白质与溶液中的其他物质分离出来，实现蛋白质的纯化和富集。

常用的蛋白质沉淀试剂有：盐类（如氯化铵）、有机溶剂（如酒精、醋酸等）和多聚物（如聚乙二醇），它们能够沉淀蛋白质并与其结合。

这些沉淀试剂可以用于蛋白质的分离纯化、富集高丰度蛋白质等。

5. 蛋白质柱层析试剂：层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术。

蛋白质柱层析试剂主要是指各种色谱介质和绑定亲和试剂。

色谱介质如离子交换柱、凝胶过滤柱、亲和柱等，能够通过其独特的理化性质分离蛋白质。

例如，离子交换柱可以根据蛋白质的电荷差异进行分离，凝胶过滤柱可以根据蛋白质的分子大小进行分离。

植物全蛋白提取方法：TCA丙酮沉淀法、Tris-HCl法、Trizol沉淀法提取法。

1TCA丙酮沉淀法基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。

具有降低次生代物质的干扰、减少蛋白降解等优点。

TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。

然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。

在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP )或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP )用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。

它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。

然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。

在提取的过程中同时加入了TCA、B-巯基乙醇及DTT 3种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。

TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。

但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。

草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。

TCA protein precipitation protocolStock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA) recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT. Precipitation Protocol:1.Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample.1. e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250讥TCA to 1.0ml sample.2.Incubate 10 min at 4°C.3.Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min.4.Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt.5.Wash pellet with 200^l cold acetone.6.Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min.7.Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes.8.Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone.9.For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel.2Trizol沉淀法与TCA丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/ 加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO)。

第1页，共1页植物蛋白提取试剂盒
货号：BC3720
规格：50T /100T
有效期：至少1年。

产品内容：名称
50T 100T Storage 裂解液
50ml 100ml 2-8℃蛋白酶抑制剂（100×）
0.5ml 1ml -20o C
PMSF （100×）0.5ml 1ml 产品说明：
本试剂盒用于植物组织中提取总蛋白，试剂盒中的裂解液含有蛋白酶抑制剂，作用温和，可快速获得总蛋白，可用于免疫印迹实验等基础研究实验，由于含有上述的酶抑制剂，不能用于研究蛋白激酶的研究。

本品仅用于科研。

操作步骤：
1、植物组织蛋白的提取
1)取100-200mg 的植物组织放入液氮中（最好过夜），在液氮环境中将植物组织碾碎（越碎越好）；
2)加入1ml 的裂解液（加入10µL 蛋白酶抑制剂和10µL PMSF ），4o C 裂解
20min ，期间每隔5min 震荡1次；3)4o C ，14000转离心30min ；4)吸取上清至新的管中；2、进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。

（提取好的蛋白建议保存于-80o C ，即用即取，避免反复冻融，避免长时间储存。

)注意事项：1.实验过程，所有试剂都要需要预冷或者即融，保证操作过程中的低温环境；2.PSMF （有毒）现用现加，因为PMSF 在水溶液中会快速降解；Solarbio。

植物蛋白质含量的测定一、原理查询资料，得知玉米蛋白质含量较高。

再经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后，得可溶性蛋白质于上清液中，将沉淀用碱水解则得到非可溶性蛋白质的提取液，将提取液与卡马斯亮蓝溶液反应呈蓝色，在595nm处有最大吸收峰。

在一定范围内，蛋白质含量与反应液在595nm 波光的吸收度呈正比，由此可求出蛋白质的含量二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：玉米粒（二）仪器设备：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；离心管；刻度移液管；微量滴定管；试管等（三）试剂：100μg／ml牛血清标准蛋白质溶液；0.15mol/L NaCl; 1mol/LNaOH;50mmol/L Tris-HCl提取液、卡马斯亮蓝溶液三、实验步骤（一）标准曲线的绘制编号 0 1 2 3 4 5标准蛋白（ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1Tris-HCl提取液(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0卡马斯亮蓝溶液(ml) 5 5 5 5 5 5每管牛血清蛋白含量(ml) 0 20 40 60 80 100加入表中的试剂，摇匀，室温放置4分钟，以不加标准蛋白的0号管为空白，在595nm波长处测定吸光度。

以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定称取鲜样0.5g，加提取液6ml，研磨成匀浆后，在10000r/min,4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。

沉淀加3ml1mol/L NaOH溶液，在90℃恒温水浴锅中加热20min，在4000r/min，4℃条件下离心10min，上清液为非可溶性蛋白质提取液。

取上清液各0.1ml，分别加入Tris-HCl提取液0.9ml，然后再分别加入卡马斯亮蓝溶液5ml，摇匀，于595nm 波长处测定吸光值。

根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

四、结果计算：样品中蛋白的含量（μg/g）＝查标准曲线值（μg）×提取液总体积（ml）/(样品鲜重（g）×测定时加样量（ml）)粗蛋白量（％）＝蛋白氮含量×6.2。

植物蛋白的提取实验报告碱溶酸沉
一、实验目的
熟悉植物蛋自提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。

二、实验原理
植物蛋白提取一般遵循如下基本原则，尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失，减少对蛋白质的人为修饰：破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据该原则，植物蛋白制备过程中。

一般需要有四种试剂①离液剂：尿素和硫脲等；②表面活性剂：SDS、胆酸钠、CHAPS 等；③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base等；④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.1-5mmo/L EDTA，同时使金属蛋白酶失活。

三、仪器和试剂
仪器：离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱、分光光度计；三角瓶；试管：试管架；移液管；记时器；水浴锅。

植物蛋白质提取方法总汇一、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g 样品加入3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4 C或11100rpm20min4 °C4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml1 、1Mtris-HCl （PH8）45ml2、甘油（Glycerol ）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g这种方法针对SDS-PAGE垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法氯醋酸—丙酮沉淀法1 、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1 小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C 8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4 C待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜目的：WESTERN BLO检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每ImITRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4 度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95 %乙醇：（2ml每ImITRIPURE用量）振荡，置室温20min离心：7500g ，5 min ，4 度，弃上清重复0.3M 盐酸胍/95 %乙醇步2 次沉淀中加入100%乙醇2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心：7500g ，5min，4 度，弃上清吹干沉淀1 % SDS溶解沉淀离心：10000g，10min ，4 度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLO）T存在的问题：加入1%SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

植物ip-ms原理
植物IP-MS（Interaction Partner-Mass Spectrometry）技术是一种用于研究植物分子互作的实验方法。

IP-MS原理主要包括以下几个步骤：
1. 表达载体构建：将目标基因与荧光标签（如GFP）融合，构建表达载体。

将构建好的载体转化到植物材料中，使目标基因表达并产生荧光信号。

2. 植物材料处理：将转化后的植物材料进行适当处理，如切片、破碎等，使细胞内的目标蛋白暴露出来。

3. 蛋白提取：利用蛋白提取试剂盒从植物材料中提取目标蛋白。

提取过程中，要注意保持蛋白的完整性，以便后续实验。

4. 免疫沉淀：利用特异性抗体与目标蛋白结合，将其沉淀下来。

此步骤可用于筛选与目标蛋白相互作用的蛋白。

5. 质谱分析：将沉淀下来的蛋白进行质谱分析，获取蛋白质组分及其相对丰度信息。

6. 数据处理与分析：通过质谱数据分析，找出与目标蛋白相互作用的蛋白，并建立分子互作网络。

IP-MS技术具有较高的准确性，可以同时研究多个基因之间的相互作用。

与其他分子互作技术相结合，IP-MS技术有助于深入了解植物分子互作的机制，为研究植物生长发育、抗病性、逆境响应等生物学问题提供重要线索。