真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程

蛋白质提取操作流程(细胞裂解)蛋白质提取操作流程（细胞裂解）
概述
细胞裂解是一种常用的方法，用于从生物样本中提取蛋白质。

本文档介绍了蛋白质提取的操作流程。

材料
- 细胞样品
- 细胞裂解缓冲液
- 蛋白酶抑制剂
- 蛋白质稳定剂
- 超声波处理设备
- 冷冻离心机
步骤
1. 将冷冻的细胞样品取出并迅速转移到冰上。

2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，并配制成细胞样品的适当浓度。

3. 加入蛋白酶抑制剂和蛋白质稳定剂，以保护蛋白质的完整性
和稳定性。

4. 将样品放入超声波处理设备中，进行超声波处理，用于破碎
细胞并释放蛋白质。

5. 将超声波处理后的样品置于冷冻离心机中，以去除细胞碎片
和残余的细胞组分。

6. 将离心后的上清液收集，并继续进行后续的蛋白质提取实验。

7. 根据实验需要可以进一步对蛋白质进行纯化、浓缩和分析等
处理。

注意事项
- 在细胞裂解过程中，应确保样品保持在低温环境下，以避免
蛋白质的降解和失活。

- 在超声波处理过程中，应注意操作时间和功率，以免对蛋白
质造成过度破坏。

- 细胞裂解缓冲液的选择应根据实验需求和细胞类型进行优化。

- 在蛋白质提取过程中，应避免受到外部污染和杂质的影响，
以保证提取到高质量的蛋白质样品。

总结
本文档介绍了蛋白质提取的操作流程，包括细胞裂解、超声波
处理和离心等步骤。

正确的操作方法和注意事项对于获得高质量的
蛋白质样品至关重要。

提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。

下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。

1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。

样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。

在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。

2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。

通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。

常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。

3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。

裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。

常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。

4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。

常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。

5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。

常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。

6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。

常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。

以上就是提取蛋白质的具体步骤。

通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。

希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。

提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。

下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。

1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。

样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。

2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。

常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。

3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。

细胞提取蛋白步骤细胞提取蛋白是生物学研究中常用的实验方法之一，通过提取细胞内的蛋白质，可以进一步进行蛋白质分析、鉴定和功能研究。

下面将详细介绍细胞提取蛋白的步骤。

一、细胞培养和采集在进行细胞提取蛋白实验之前，首先需要进行细胞培养。

常用的细胞培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据实验需要选择合适的培养基。

将细胞培养在含有适宜浓度的培养基中，放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。

当细胞生长到适当密度时，可以进行下一步的细胞采集。

二、细胞裂解将培养好的细胞放入离心管中，用PBS或生理盐水进行洗涤，去除细胞外的干扰物。

然后加入裂解缓冲液，常用的裂解缓冲液有RIPA 缓冲液、NP-40缓冲液等。

裂解缓冲液中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂等，可以保护蛋白质不被降解。

将细胞裂解液置于冰上，用超声波仪或搅拌器进行充分裂解，直至细胞完全破碎。

三、离心分离将裂解后的细胞溶液离心，以去除细胞碎片、细胞核和细胞膜等残渣。

离心分离的条件根据实验需要进行调整，一般在12000×g的条件下离心10-15分钟。

离心后，上清液即为含有目标蛋白质的提取液。

四、蛋白质浓度测定使用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法，测定蛋白质的浓度。

根据实验需要，可以使用不同的测定方法。

五、蛋白质保存和分析将提取的蛋白质分装到离心管中，并存储在-80摄氏度的冰箱中。

根据实验需要，可以进行蛋白质的分析和鉴定。

常用的方法有SDS-PAGE电泳、Western blotting、质谱分析等。

这些方法可以用来确定蛋白质的分子量、表达量以及与其他蛋白质的相互作用等。

细胞提取蛋白是一项复杂的实验技术，需要注意以下几点：1. 实验前要准备好所需的试剂和设备，确保实验过程的顺利进行。

2. 在细胞裂解过程中，要注意避免蛋白质的降解和氧化，可以添加蛋白酶抑制剂和抗氧化剂等。

3. 细胞裂解后的提取液要尽量避免冻融，以免对蛋白质的活性造成影响。

组织总蛋白提取步骤
总蛋白提取是从细胞或组织中提取出的所有蛋白质的混合物。

总蛋白
的提取对于生物学研究和许多实验室技术都至关重要。

以下是一般的总蛋
白提取步骤：
1.组织的收集和处理：
a.收集需要提取总蛋白的组织样品，并尽快处理以防止蛋白质降解。

b.使用冰凉的无菌生理盐水将组织样品洗涤以去除任何外部污染物。

c.如有必要，将组织样品研磨成细小的粉末状，以提高蛋白质的释放。

2.细胞破碎和裂解：
a.使用合适的细胞破碎方法（如液氮研磨、机械破碎器或超声波处理）破碎细胞膜，释放细胞中的蛋白质。

b.加入破碎缓冲液（通常是一种含有盐和蛋白质保护剂的缓冲液），
并将样品在低温下裂解，以避免蛋白质的降解。

3.离心：
a.将处理后的样品进行高速离心，以去除细胞碎片和其他杂质。

b.将上清液（含有总蛋白）转移到干净的离心管中。

4.测定蛋白质浓度：
a. 使用适当的蛋白质浓度测定方法（如二维凝胶电泳、BCA法、Bicinchoninic Acid法）测定总蛋白的浓度。

b.根据测定的浓度进行相应的稀释或浓缩。

5.进一步处理或分析：
a.根据具体实验目的，可以进一步处理总蛋白提取物，如进行蛋白酶消化、亲和层析或其他分离纯化方法。

b. 可以使用各种蛋白质分析技术（如SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱等）对总蛋白进行定性和定量分析。

总蛋白的提取步骤中，诸如细胞破碎方法、破碎缓冲液的配制、离心条件和测定蛋白质浓度的方法等，都需要根据具体需求和实验目的进行优化和调整。

同时，注意使用无菌操作和低温条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。

WB实验组织总蛋白提取方法总蛋白提取是生物学实验中常用的一种方法，主要用于从细胞或组织中提取所有蛋白质。

提取总蛋白的目的是为了进一步分析蛋白质的功能和结构，例如Western blot分析等。

下面是一种常用的总蛋白提取方法。

实验材料和试剂：1.已培养的细胞或组织样品2. RIPA裂解液：含有非离子界面活性剂（Tween-20或Triton X-100）、蛋白酶抑制剂（如苯甲砜）和磷酸酯酶抑制剂（如磷酸酯酶）3.低温高速离心管4.超声波细胞破碎仪或机械研磨器5.10%SDS-凝胶电泳试剂6.蛋白加载缓冲液7.高压电泳设备实验步骤：1.将细胞样品从培养皿中用PBS缓冲液洗涤一次，用PBS轻轻冲洗组织样品。

2.吸去PBS缓冲液，加入足够的RIPA裂解液使细胞或组织完全浸没。

注意：RIPA裂解液的加入量需根据样品的大小进行调整。

3.将细胞或组织样品转移到低温高速离心管中。

4.使用超声波仪器或机械研磨器对样品进行破碎。

这一步旨在使细胞或组织的细胞膜破裂，释放出胞浆中的蛋白质。

5.离心样品以除去细胞碎片和细胞核等大颗粒。

将离心管置于低温离心机中进行离心，离心条件需根据实验需要进行调整。

6. 将上清液转移至新的离心管中，得到总蛋白提取物。

可以根据需要进行蛋白质浓度的测定，常用的方法有BCA法、Lowry法等。

7.将总蛋白提取物加入相应的蛋白加载缓冲液，并在沸水中加热变性。

8.蛋白质经过热变性后，将其进行SDS-凝胶电泳分离。

9. 将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或NC膜上，通过Western blot分析来检测目标蛋白质。

总蛋白提取方法的关键是裂解液的配方和破碎细胞或组织的方式。

裂解液中的各种成分旨在破坏细胞膜、解离蛋白质和保护蛋白质不被降解。

破碎细胞或组织的方式可以选择超声波破碎、机械研磨或冷冻-解冻法等。

总蛋白提取方法的优化可根据实验需要进行调整。

例如，在一些情况下，可以添加磷酸酯酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或还原剂等成分来保护蛋白质的完整性。

生物化学实验操作指南一、实验前的准备工作在进行生物化学实验之前，我们需要做一些准备工作，以确保实验的顺利进行。

首先，我们需要检查实验室的安全设施是否完备，如灭火器、安全眼镜、实验台等。

其次，我们需要准备实验所需的试剂和设备，包括试管、移液器、天平等。

同时，我们还需要检查这些试剂和设备的质量和完整性，以免对实验结果产生干扰。

最后，我们需要阅读实验操作指南，了解实验的目的、步骤和注意事项。

二、实验步骤1. 实验前的样品处理在进行生物化学实验之前，我们通常需要对样品进行处理。

例如，如果我们要提取蛋白质，我们需要将样品细胞破碎，并使用离心机将细胞碎片和细胞核分离。

如果我们要提取核酸，我们需要使用酶来消化细胞壁，并使用离心机将细胞碎片和细胞核分离。

2. 试剂的配制与标定在进行生物化学实验中，我们通常需要配制一些试剂。

例如，我们可以配制缓冲液、酶液等。

在配制试剂之前，我们需要准确称取所需的化学品，并按照实验操作指南中的比例配制。

同时，我们还需要标定试剂的浓度，以确保实验结果的准确性。

3. 实验操作在进行生物化学实验时，我们需要按照实验操作指南中的步骤进行操作。

例如，如果我们要进行酶活性测定实验，我们首先需要将样品和试剂加入试管中，然后在适当的温度和pH下进行反应。

在反应过程中，我们需要定时取样，并使用分光光度计等设备测定反应的吸光度。

最后，我们需要根据实验数据计算出酶的活性。

4. 数据处理与分析在完成实验后，我们需要对实验数据进行处理和分析。

例如，我们可以使用统计学方法对数据进行统计分析，并绘制图表来展示实验结果。

同时，我们还可以使用生物信息学工具对实验数据进行进一步的分析，如序列比对、结构预测等。

三、实验注意事项在进行生物化学实验时，我们需要注意以下几点：1. 实验操作要规范，遵守实验室的安全操作规程，如佩戴实验服和手套，避免接触有害物质等。

2. 试剂的使用要准确，按照实验操作指南中的比例使用，避免使用过量或不足。

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。

10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)：0.07882g150 mmol/L NaCl：0.08775g0.2 g/L叠氮钠：0.002g1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g5 g/L去氧胆酸钠0.05g100 mg/L 苯甲基磺酰氟(PMSF) 0.001g总蛋白抽提程序：1.PBS洗细胞3 次2.加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100µL 裂解液，或100ml细胞瓶中加入100µL 裂解液），冰上放置20min3.收集裂解液4.离心，12000转，2~10min5.吸取上清，蛋白定量，分装，保存在-80度备用裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。

化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。

这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法。

机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。

机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

一、机械裂解法主要有以下两中：1、热休克（Thermal shock），既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,。

原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。

2、超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。

但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。

细胞的总蛋白质提取全过程及经验Hessen was revised in January 2021细胞的总蛋白质提取全过程及经验如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。

一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。

也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。

一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。

PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。

3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。

裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。

在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。

一般我加的是裂解液体积的5 倍。

沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。

细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。

这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。

Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。

之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所以buffer 的体积也会比较的大。

蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。

如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。

B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。

最后一次彻底吸干残留液。

b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。

期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。

c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。

C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。

加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。

如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。

B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。

冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。

2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。

3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

1 / 24、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。

5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。

-----精心整理，希望对您有所帮助!。

组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400 μ 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。

然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。

以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。

弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、用枪洗干上清后，加100 μ 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清即为蛋白。

留取小量蛋白侧浓度。

最好马上用上样缓冲液和蛋白混合变性，分装于小管里，不能反复解冻，容易导致蛋白降解。

第1篇一、目的为确保蛋白质实验的顺利进行，保证实验结果的准确性和安全性，特制定本操作规程。

二、适用范围本规程适用于蛋白质的提取、纯化、鉴定、分析等实验操作。

三、操作步骤1. 实验准备（1）实验前应仔细阅读实验方案，了解实验原理、目的、步骤及注意事项。

（2）准备实验所需试剂、仪器和设备，确保其处于正常工作状态。

（3）实验前应佩戴防护眼镜、手套和口罩，避免接触有害物质。

2. 蛋白质提取（1）取适量组织或细胞，用组织匀浆器或超声波破碎器破碎。

（2）加入适量裂解液，充分搅拌，使蛋白质溶解。

（3）低温离心，收集上清液，即为蛋白质粗提液。

3. 蛋白质纯化（1）根据蛋白质的性质，选择合适的纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。

（2）将蛋白质粗提液按照纯化方法进行操作，如加入缓冲液、平衡液、洗脱液等。

（3）收集纯化后的蛋白质，低温保存。

4. 蛋白质鉴定（1）采用SDS-PAGE电泳对蛋白质进行初步鉴定。

（2）通过Western blot技术检测蛋白质的特异性抗体。

（3）通过质谱分析等技术对蛋白质进行结构鉴定。

5. 蛋白质分析（1）采用紫外分光光度计测定蛋白质浓度。

（2）采用凝胶过滤色谱、动态光散射等技术研究蛋白质的分子量。

（3）通过酶活性、底物消耗等方法研究蛋白质的生物活性。

四、注意事项1. 实验过程中应严格遵守无菌操作原则，防止污染。

2. 实验操作应规范，避免人为误差。

3. 试剂、仪器和设备应定期校准、维护，确保实验结果的准确性。

4. 实验过程中产生的废弃物应按照相关规定进行处理。

5. 实验过程中应关注自身安全，防止化学品、生物制品等对人体的危害。

五、实验记录1. 实验记录应详细记录实验时间、试剂、仪器、操作步骤、实验结果等。

2. 实验记录应真实、准确、完整，便于实验结果的追溯和分析。

六、附则本规程由实验室负责解释和修订，自发布之日起实施。

第2篇一、前言蛋白质是生命活动的重要物质基础，广泛应用于生物学、医学、农业等领域。

1.总蛋白（细胞）提取Protocal物品准备：物品：冰盒、EP管架及EP管，移液枪及枪头，废液缸试剂：RIPA蛋白裂解液（4℃冰箱），磷酸酶抑制剂A、B液（4℃冰箱），cocktail（现领,置于常温）;操作步骤：（1）配置总蛋白提取裂解液：准备冰盒，取一EP管，配置蛋白裂解液，体系为：RIPA+A+B+cocktail，其具体比例为：RIPA:A:B:cocktail=100:1:1:1,裂解液体系可提前配置，置于-40℃或-80℃保存，亦可现用现配，总量依据所要提取的孔板决定，一般12孔板每孔需80μL,6孔板每孔需160μL，适量多配，置于冰上。

（2）准备EP管备用：按照需要提取的细胞孔板数目取一定数量EP管，并按照细胞处理方式标记好EP 管。

（3）取细胞孔板、洗细胞：于培养箱中取出细胞孔板，置于显微镜下观察每孔细胞生长情况及密度，置于冰上，倒去培养基，用1XPBS洗涤2-3次，洗涤后倒去，最后一次清洗后用枪头吸干净残余PBS。

（4）刮取细胞并裂解：将蛋白裂解液按照常规用量加入每孔中，一般12孔板每孔加80μL,6孔板每孔加160μL，用中号枪头倒扣置于孔中，蘸取裂解液在孔中划线摩擦，无需太用力，将细胞刮下来。

注意在此过程中，要尽量刮到孔的每一处，枪头不要离开底面或突然停顿以免细胞被冲起来造成损失，每孔刮完要换枪头。

（5）收集细胞及蛋白：将孔板倾斜放置使液体聚于管底，每孔用移液枪吸取液体将上方区域吹洗一遍，注意更换枪头，在冰上静置15min，用枪将每孔液体吸取至相应的EP管中，注意全部吸取，包括产生的泡沫。

（6）离心取上清蛋白：取EP管于低温高速离心机中进行离心，注意统一将管帽外端朝外放置，便于离心后观察沉淀及取上清，离心条件：4℃，15000g X 15min，离心后，吸取少于加入裂解液体积的上清，把枪头置于管底内端以免吸到外端的沉淀影响蛋白纯度，一般裂解液与取上清量对应关系为：80μlRIPA取60μl上清，160μlRIPA取120μl上清，取到的上清即为提取出来的总蛋白。

蛋白质提取操作流程(细胞裂解)1. 引言在生物学和生物化学研究中，蛋白质提取是一项重要的实验操作。

细胞裂解是蛋白质提取的第一步，它是将细胞破坏并释放细胞内的蛋白质。

本文档旨在说明细胞裂解的操作流程，以帮助研究人员正确、高效地执行该实验步骤。

2. 实验材料- 细胞悬液- 低渗盐溶液 (如PBS)- 细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）- 离心管- 超声细胞破碎仪或高压胞破机3. 实验步骤3.1 样品制备将培养的细胞收集到离心管中，尽量避免细胞沉积。

3.2 细胞洗涤使用低渗盐溶液（如PBS）洗涤细胞，去除培养基中的蛋白质、代谢产物和细胞碎片。

3.3 细胞裂解缓冲液添加将细胞沉淀洗涤后，用适量的细胞裂解缓冲液悬浊细胞。

细胞裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂，以防止蛋白质被降解。

3.4 细胞破碎将细胞裂解液置于超声细胞破碎仪或高压胞破机中，进行细胞破碎。

超声细胞破碎仪可通过高频声波震荡来破坏细胞膜，释放蛋白质。

高压胞破机通过高压力将细胞挤压破碎。

3.5 细胞碎屑去除使用离心机离心细胞裂解液，去除其中的细胞碎屑和细胞核，以获取纯净的蛋白质溶液。

3.6 蛋白质收集收集上一步离心后的上清液，其中包含提取的蛋白质。

将上清液转移至新的离心管中，即得到蛋白质溶液。

3.7 蛋白质浓度测定使用比色法、BCA法等方法对蛋白质溶液进行浓度测定，以获得蛋白质提取的量和浓度信息。

4. 结论通过细胞裂解的操作流程，可以高效地破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

正确的细胞裂解步骤可以确保蛋白质提取的质量和数量。

然而，在实验中需要注意的是，不同类型的细胞可能需要不同的裂解条件。

因此，在进行蛋白质提取实验时，需要根据具体情况优化裂解缓冲液的成分和细胞破碎的方法。

希望本文档能为您的实验提供有价值的指导和参考。

肝组织总蛋白提取的标准操作规程肝组织总蛋白提取的标准操作规程（编号：025）1、目的及适用范围该SOP用来规范肝组织总蛋白提取的操作。

2、主要仪器及试剂均质仪、铁架台、冷冻台式离心机、微量移液器、单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/mL PMSF）3、相关器皿的预处理剪刀和均质仪的转头需彻底清洗后高压灭菌。

4、操作步骤4.1 将少量肝组织块置于玻璃平皿中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，同时去除结缔组织。

4.2 每100mg组织加400μL单去污剂裂解液（含PMSF）于15mL离心管中，使用均质仪进行匀浆，冰上操作。

4.3保持组织块低温状态，均质仪运行3s，停顿2s，直至组织完全碾碎成浆。

4.4 用微量移液器将裂解液移至1.5mL 离心管中，然后在4℃ 12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存。

5、问题向导蛋白得率低可能原因：5.1 组织裂解不彻底5.2 提取过程中的蛋白降解6、注意事项注意初始组织块的处理，尽量剪碎，尽量去除结缔组织。

匀浆彻底，同时保证匀浆过程低温，防止蛋白降解。

根据提取效果，适当调整Detergent的成分。

附：单去污剂裂解液配制方法单去污剂裂解液：50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100μg/ml PMSF 1moL/L Tris·HCl（pH8.0）2.5mLNaCl 0.438g50。

真核生物DNA的分离提取主要设备、仪器：水浴锅、离心机(10ml),玻璃离心管10ml，塑料离心管10ml各一主要试剂：悬浮buffer 200 mmol/L NaCl, 25 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/Na2EDTA PH8.0 TE buffer: 10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 1mmol/L EDTA, 每组10ml裂解缓冲液：100mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 50 mmol/Na2EDTA,200 mmol/L NaCl, 1%SDS, 100ug/ml蛋白酶K每组5 ml酚-氯仿: TE饱和重蒸酚pH8.0: 氯仿=1:1 每组10ml3M NaAc 每组2ml异丙醇每组5mlRNA酶溶液：100ug/ml的RNA酶的TE溶液，煮沸5min备用不分装100ml. 储于0~4度95%乙醇每组10ml70%乙醇每组10ml操作步骤：1 将实验三制备物用悬浮buffer 2ml洗涤一次离心2500 rmp5min去掉上清液，加1ml悬浮buffer悬浮。

（在10ml玻璃离心管中）2 加入裂解缓冲液4ml 小心搅拌裂解，50~55水浴1小时。

3 将裂解液转入10m塑料离心管，加入3ml酚-氯仿,温和颠倒数次混合，不能剧烈震荡，在4000rpm离心10分钟（室温），将上层液用大口吸管转入10ml玻璃离心管中，不要吸入白色沉淀。

4 加入1/10体积3M NaAc，再缓缓加入等体积异丙醇，充分混合，观察DNA的沉淀生成。

（沉淀太少时须-20度放置30min）5 将DNA纤维挑入5ml新离心管中，或将溶液转入10m塑料离心管，在4000rpm离心5min。

6用2ml 70%乙醇洗涤沉淀一次，4000rpm离心5min去掉上清液，干燥沉淀10min。

7 加入RNA酶溶液1ml溶解沉淀，在50度（可促进溶解）保温30min，转如5ml离心管加入1/10体积3M NaAc，（100ul）再加入2.5倍体积的预冷95%乙醇，离心10000rpm 5min,去掉上清液，干燥沉淀。

For personal use only in study and research; not for commercial use细胞总蛋白的提取及裂解液一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗（1/100）或(20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF））,离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。

4度离心15000g 20min。

上清液即为全部细胞溶解成分。

二．裂解缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA（现加1ml加10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4钒酸钠1mM (75mM—13.3ul/ml)（用0.2mol/L储存液配制）PMSF苯甲酰氟1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）Aprotinin 抑肽酶10ug/ml（10ul/ml）(Leupeptin 亮肽素10ug/ml 未加) Western blotting三．给你介绍一个裂解液：50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：NaCl 150mM叠氮钠0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。

5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。

第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。

我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。

将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。

上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。

70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。

在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。

建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。

IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。

裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。

用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。