核-胞浆蛋白提取方法

WB二抗稀释液Cat Number：KGP107For Research Use OnlyStore at4℃for one yearExpire date：20130105一、试剂盒说明WB二抗稀释液是蛋白印迹(Western Blot，WB)等实验中最常用的蛋白类生物试剂，为保证抗体标记物具有较高的生物活性，厂家在生产运输过程中一般都以较高的浓度分装保存。

在蛋白印迹等实验中，为获得较好的染色结果，降低实验成本，二抗在使用前都需要适当稀释。

本产品仅用于WB实验中二抗的稀释。

二、试剂盒组份WB二抗稀释溶解液100mlBSA3g说明书一份三、使用说明1、WB二抗稀释液的配制：按照需求的量配制含3％BSA的WB二抗稀释溶解液，比如称取0.3gBSA溶于10ml的WB二抗稀释溶解液，现配现用。

2、用时取适量用于二抗稀释。

二抗的稀释倍数请参照抗体生产厂家使用说明。

四、注意事项1．本产品属蛋白制剂，室温放置过久易导致蛋白的降解和活性丧失。

2．反复冻融亦会导致蛋白活性的丧失。

3．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4．WB二抗稀释液现配现用。

五、凯基相关产品（详见凯基网站）1、蛋白提取核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒全蛋白提取试剂盒膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒（简易型）活性蛋白提取试剂盒红细胞裂解液细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒蛋白裂解液系列2、蛋白定量BCA法蛋白定量检测试剂盒Bradford法蛋白定量检测试剂盒Lowry法蛋白定量检测试剂盒3、蛋白染色蛋白质银染检测试剂盒蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒考马斯亮蓝蛋白快速染液4、蛋白分子量Marker蛋白分子量Marker（14KD-116KD）蛋白分子量Marker（10KD-200KD）预染蛋白分子量Marker（20KD-118KD）预染彩色蛋白分子量Marker（11KD-250KD）5、Western bloting组装试剂盒凯基蛋白提取和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒凯基Western bloting检测试剂盒6、Western bloting化学发光试剂盒ECL检测试剂盒加强型ECL检测试剂盒。

高中生物用到离心的实验
1. 分离细胞核和胞浆：将细胞悬液加入到离心管中，进行离心，使细胞核沉淀到管底，胞浆上清液悬于管顶，然后通过分离液层，得到细胞核和胞浆。

这可以用于细胞质和细胞核的分离研究以及推导细胞核DNA含量的研究。

2. 离心分离蛋白质：将细胞悬液加入到离心管中，进行适当的离心，使蛋白质沉淀到管底。

然后可以用各种方法对分离的蛋白质进行进一步的鉴定和分析，包括酶学分析、免疫学检测等。

3. 分离膜蛋白和溶解蛋白：用离心法可以分离细胞膜上的膜蛋白和溶解在细胞液中的溶解蛋白。

这可以用于研究细胞膜结构和功能。

4. 分离细胞器：用离心法可以分离不同细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体等。

这可以用于研究不同细胞器的结构和功能。

5. 分离DNA和RNA：用离心法可以分离DNA和RNA，这可以用于研究基因结构和功能，以及编制DNA和RNA文库等。

6. 血浆分离：用离心法可以分离血浆中的白细胞、红细胞和血小板，这可以用于研究血液成分、疾病诊断等。

7. 微生物培养液分离：用离心法可以分离微生物培养液中的细胞、孢子等，这可以用于研究微生物生长行为、菌株鉴定、药物研发等。

核蛋白提取试剂盒说明书货号：R0050规格：50T/100T 产品内容：保存：核/浆蛋白抽提试剂2-8℃保存，PMSF 于-20℃保存。

产品简介：本试剂盒提供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白的方法。

整个过程只需约60分钟就可以将核蛋白和浆蛋白从细胞中分离出来。

得到的蛋白可以用于Western blot 等实验。

本试剂盒通过浆蛋白抽提试剂使细胞膨胀破裂，释放出胞浆蛋白，再通过离心得到细胞核。

然后通过核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

本试剂盒可以抽提50/100个样品（每个样品约2×106个Hela 细胞或40mg 组织）。

操作方法（仅供参考）：*裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

一、对于体外培养细胞：1．根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF ，使PMSF 的最终浓度为1mM 。

PMSF 需现用现加，若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸，可以在两种蛋白抽提液中加入DTT 至终浓度0.5mM 。

2．对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS 洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA 消化后吹打下细胞（最好不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。

500g 离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清留下沉淀备用。

3．对于悬浮细胞：用PBS 洗一遍，500g 离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

4．每20μL 细胞沉淀加入200μL 浆蛋白抽提试剂（2×106个细胞沉淀的体积约20μL 或40mg ）。

5．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长），必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。

细胞沉淀分散不完全会导致蛋白产量降低。

6．冰浴10分钟。

7．最高转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g 离心10分钟。

8．上清即为抽提得到的细胞浆蛋白，立即吸取上清至预冷的样品管中备用，进行后续的PAGE 、Western 等实验，但蛋白浓度较低，可根据需要进行相应浓缩。

RIP试剂配方及操作步骤所有试剂需用DEPC水配置，临用前加入终浓度1 mM PMSF，1×Protease inhibitors (PIC)和100 U/ml RNase inhibitor！！！1、胞浆和核蛋白提取(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100)(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100, 0.5% NP40)也可以直接用RIP buffer。

2、膜蛋白提取(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA)，相当于碧云天的中强裂解液。

3、RIP Buffer(150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 25mM Tris PH7.5, 5 mM EDTA, 0.5% NP40)4、Wash buffer I（低盐）(20 mM Tris-Hcl pH 8.1, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 and 0.1% SDS)5、Wash buffer II（高盐）(20 mMTris-Hcl pH 8.1, 500 Mm NaCl, 1% TritonX-100 and 0.1% SDS)6、PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4）7、Nuclear isolation buffer（1.28 M sucrose，40 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM MgCl 2，4% Triton X-100）步骤：蛋白的制备1、睾丸组织样本用预冷的PBS洗三次，加入PBS冰浴匀浆为单细胞。

动物固体组织蛋白提取1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。

2、裂解液配制：：100：1，现配现用。

（100010）。

置入4℃冰上。

3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。

一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、1 。

b、匀浆。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

c、将组织匀浆转入1.5的管中（管、离心管）。

12000 4°C 离心15。

d、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a、配工作液：溶液A：溶液50：1（200：4）。

*200；2*（1+1）*4。

需测试复孔。

标本X，则需Ac、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O，混匀。

即10倍稀释。

d、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃30。

注：应现加蛋白样本，再加工作液。

胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒产品编号产品名称包装SINP001 胞浆－核蛋白抽提试剂盒50×产品简介：细胞核和细胞浆目前成为研究细胞组分的两个热点，获得高浓度的细胞核蛋白和细胞浆蛋白成为得到好的研究结果的重要实验过程。

本试剂盒主要原理是在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，离心得到细胞核沉淀。

最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

本试剂盒是本公司非放射性EMSA试剂盒（cat; SIDET001, SIDET003, SIDET004,）实验成功的重要部分，经BCA测定24cm2贴壁细胞(或50ml规格培养瓶养的悬浮细胞)抽提物，核蛋白浓度约为 2.5ug/ul或更高。

抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

本试剂盒可足够您进行50次抽提操作！包装清单：试剂包装总量5X Buffer A 1瓶35ml/瓶2X Buffer B1支 1.5ml/支Solution I（溶液I）1支 1.75ml/支Solution II（溶液II）1支 1.75ml/支Solution III（溶液III）1支 1.5ml/支PMSF Solution 1支0.85ml/支User Manual (说明书)1份1份/Kit保存温度： 4℃保存。

Ⅰ.准备抽提试剂：按照下列方法制备胞浆－核蛋白抽提液：1.制备3ml胞浆蛋白裂解液I ：试剂体积5X Buffer A0.6mlSolution I（溶液I）30ulSolution II（溶液II）30ulPMSF Solution 15uldd-H2O 2.325ml总体积 3.0ml注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

2.制备1.02ml胞浆蛋白裂解液II：试剂体积Solution III（溶液III）20ul胞浆蛋白裂解液I 1.0ml总体积 1.02ml3.制备1ml核裂解液：试剂体积2X Buffer B25ulSolution I（溶液I）0.5ulSolution II（溶液II）0.5ulPMSF Solution0.25uldd-H2O23.75ul总体积 50ul注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。

A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。

蛋白提取制备相关产品蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提, 100 extractions)S1250 100 次提取 700 元概述：实体组织如大脑富含磷脂、神经纤维或血管壁含大量结缔组织、而脂肪则有大量油脂，常规方法难以有效从这些组织提取蛋白。

蛋白抽提试剂盒-I用于从各种实体软组织或细胞快速提取总蛋白。

用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织，或用裂解结合缓冲液振荡重悬培养细胞，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心分离即可得到总蛋白；简便高效，30-60分钟内完成提取。

试剂盒可进行100次提取，可在1.5ml离心管微量提取也可大规模制备。

每次可提取1～100 mg实体组织或1 x 107细胞。

一次从10-100mg实体组织提取的总蛋白的量通常足以进行数十次Western Blot或免疫沉淀。

适用：(1) 各种实体软组织。

如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等。

(2) 各种原代和传代细胞。

组成：(1) 裂解-结合缓冲液100 ml；(2) 抽提试剂100 ml。

每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取100 mg组织或1 x 107细胞。

储存：室温2年。

蛋白抽提试剂盒-II (液体样品蛋白抽提和回收，100 extraction)S1255 100 次提取 480 元200 次提取 780 元概述：蛋白抽提试剂盒-II 用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等。

适用于各种液体样品(10 µl～1000 ml)，如蛋白溶液、胞浆胞核蛋白提取液、细胞或微生物培养基上清液、血液、尿液、脑脊液等各种体液。

蛋白回收率95%，远高于经典的丙酮或三氯醋酸沉淀法，且可有效去除样品中的脂质，不影响后续SDS-PAGE和Western Blot实验。

可用1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，15分钟完成提取，简便高效。

该试剂盒也适于从细胞悬液提取总蛋白。