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猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定王梦婕;张杰;孙杨杨;白娟;刘星;姜平【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2022(54)6【摘要】为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体,将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合,密码子按大肠杆菌偏嗜性优化,构建了大肠杆菌表达质粒,制备获得重组M蛋白。
取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白,将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合,用间接ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。
其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。
单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a,3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。
经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定,4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应,鉴定出2个抗原表位,为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。
【总页数】6页(P91-96)【作者】王梦婕;张杰;孙杨杨;白娟;刘星;姜平【作者单位】南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S852.6【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定2.猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定3.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株GP3单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定4.美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定5.一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体制备及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪呼吸系统发病机理及诊断防治作者：刘树民来源：《农民致富之友（上半月）》 2019年第3期猪呼吸系统的疾病在生猪养殖过程中是常见的疾病，很多养猪场都比较常见，也是兽医在临床上普遍的症候群。
猪的呼吸系统疾病分为两大类型，一类可以使大批猪患病的疾病，具有病情严重持续时间短的特点；一类是在猪群持续存在的，并且持续的程度与疾病的缓急相关。
1、猪繁殖与呼吸综合征1.1 发病机理猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV），单核巨噬细胞系统中常复制这种疾病，其更为明显的现象表现在肺泡巨噬细胞中。
PRRSV疾病会逐渐使巨噬细胞破裂和溶解，猪肺内的巨噬细胞会越来越少，就会缺乏对其它病毒和细菌的免疫力，于此同时，这种疾病会逐渐的转移到其它的淋巴组织中，影响淋巴组织的免疫功能，严重的会造成淋巴组织衰竭。
如果这个疾病持续的扩散，会使得全身的中性粒细胞和巨噬细胞都会受到感染，使得猪的整体免疫力低下，猪的体质逐渐出现了免疫干扰或者抑制的状况，为其它的病原感染提供了机会。
1.2 诊断和治疗这种疾病在猪群中发生就会产生蔓延，全体猪群基本都会感染，并且这种疾病的持续性长，常年都会受到这种疾病的困扰，空气、排泄物、空气都可能是这种疾病的传播媒介。
诊断：猪在感染PRRSV后，身体会出现呼吸困难、不断流泪的症状并且伴有发热的现象。
母猪妊娠后期感染这种疾病，会造成流产，流产猪胎脐眼与脐带之间的连接处有严重的出血现象，这种现象就可以证明这头母猪和流产胎儿都已经携带 PRRSV疾病。
PRRSV 疾病在猪发生后，猪的淋巴结会出现明显的肿大和出血的现象，猪胃底会出现明显的弥漫性出血，并且呈片状；此外，这种病在发生继发性感染会造成多样性的病理变化。
治疗：这种疾病在当前兽医临床中没有特性药物，临床治疗中常采用的办法是：在2000千克的饲料中拌上500克的酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素与400克的替米考星，或者是利用免疫球蛋白、干扰素等一类的抗病毒制剂来治疗PRRSV疾病。
专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽及其应用专利类型：发明专利
发明人：夏春,潘孝成
申请号：CN201210030549.6
申请日：20120210
公开号：CN103242427A
公开日：
20130814
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽及其应用。
本发明所提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
本发明还保护编码所述多肽的核酸分子。
本发明所提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽能够与猪SLA-I分子结合，可用于制备针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，以及制备鸡的CD8+T淋巴细胞增殖剂。
申请人：中国农业大学
地址：100193 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以怀孕母猪流产和不同年龄段猪的呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。
PRRSV具有逃逸宿主体液免疫应答机制等特征,导致现阶段商品化的疫苗不能给猪群提供完全的保护作用,且目前尚未得知有效的治疗方法,该病给我国养猪业带来巨大的经济损失。
前期研究中,本实验室将PRRSV非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗体Nb6基因通过（G<sub>4</sub>S）<sub>3</sub> Linker与细胞穿膜肽TAT基因融合,克隆至pET21b载体,成功构建pET21b-TAT-Nb6表达载体。
原核表达获得的TAT-Nb6重组蛋白具有与Nsp9重组蛋白相互作用的活性,并且能够进入MARC-145细胞和原代细胞PAM中,可以抑制多株PRRSV毒株（包括基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332））在以上两种细胞中的复制（Wang et al.2019）。
因此,TAT-Nb6具有开发为新型抗PRRSV纳米抗体药物的潜力。
基于以上背景,本研究通过对TAT-Nb6诱导表达温度、IPTG添加量和诱导表达时间的摸索,确定最佳的诱导表达条件,从而制备大量TAT-Nb6重组蛋白,对其在猪体内抗PRRSV作用进行验证,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。
主要研究内容及结果如下:1.TAT-Nb6重组蛋白优化表达条件:为了获得TAT-Nb6在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中最大表达量,我们将含有pET-21b-TAT-Nb6表达载体的大肠杆菌在不同条件下进行培养,如不同的诱导温度、诱导剂浓度和时间。
通过SDS-PAGE和western blot分析。
结果显示,TAT-Nb6重组蛋白在IPTG终浓度0.2 mM,37℃诱导6 h条件下诱导表达量最高。
猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建邓碧亮;顾万军;黄毓茂【摘要】本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)GD株的E蛋白基因,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV vector中,构建腺病毒重组表达载体.经过抗性筛选、PCR扩增、单酶切等方法对其进行鉴定,确定得到了含有目的基因的阳性克隆,成功构建了腺病毒表达载体pad-E.同时转染293细胞并进行了初步鉴定,进一步的研究还在继续.本研究为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2010(035)002【总页数】3页(P28-30)【关键词】PRRSV;基因克隆;重组腺病毒【作者】邓碧亮;顾万军;黄毓茂【作者单位】河源市动物疫病预防控制中心,广东,河源,517000;佛山科学技术学院生命科学学院,广东,佛山,528231:;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S856猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine Reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）主要引起母猪的繁殖障碍和仔猪的严重呼吸障碍。
自从1996年我国首次证实存在该病之后[1]，因其高度传染性迅速遍及全国各地，给我国养猪业造成了很大的经济损失。
2006年上半年以来全国各地发生的疫情更使此病的控制难度加大。
由于目前的常规疫苗都不太理想[2]，因此，新的PRRSV基因工程疫苗的研制一直都是该病研究的热点之一。
PRRSV为单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科Arterividae成员，基因组全长约15 kb，包括8个开放阅读框[3]。
PRRSV的ORF5基因编码的糖基化囊膜蛋白（E蛋白）具有较好的免疫原性，能够诱导产生中和抗体，且中和抗体出现之后，抗血清主要识别E蛋白[4]。
此外，E蛋白还具有诱导细胞凋亡、参与病毒粒子与病毒受体结合等过程的作用[5]。
细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体
Nb6抗病毒感染的研究
猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种以猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征的病毒性传染病,是目前造成全球养猪业巨大经济损失的重要传染病之一。
该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。
PRRSV以高变性、免疫抑制、持续性感染及抗体依赖性增强为特征,现有疫苗的群体保护力较低,尚无有效的抗病毒药物。
PRRSV非结构蛋白Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶,在不同毒株间高度保守,被认为是抗PRRSV药物的一个重要靶标。
在先前的研究中,本实验室成功制备出一株PRRSV Nsp9特异性纳米抗体Nb6,并且证明细胞内表达的Nb6可以显著抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。
然而,由于纳米抗体不能有效穿过细胞膜,因此不能进入细胞达到抗病毒的作用。
因此,制备安全、有效和无细胞毒性的细胞内递送系统对于提高Nb6的抗病毒活性至关重要。
细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是一类含有约5-30个氨基酸的短肽,可以通过直接易位或内吞作用等方式进入细胞内,且不会引起细胞毒性。
目前,CPPs已经被用作向细胞内递送各种货物的工具,例如质粒DNA,siRNA,蛋白质,病毒,成像剂和其他各种纳米颗粒等。
TAT蛋白（HIV-1 trans-activator）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反式激活因子,是最早被报道的CPPs。
目前已有关于TAT与纳米抗体融合蛋白在癌症治疗中的研究报道,结果表明其具有显著的抗癌效果,并有望被开发为新型抗癌药物。
然而,关于CPPs在PRRSV防控中的应用尚未有研究报道。
基于以上背景,本研究利用原核表达系统成功表达TAT-Nb6融合蛋白,对其穿膜及抗PRRSV功能进行验证,并对Nb6的抗病毒机制进行初步探索,为抗PRRSV
纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。
主要研究内容及结果如下:1.细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体穿膜的研究本研究首先利用原核表达表达系统获得
TAT-Nb6融合蛋白。
通过Overlap PCR扩增获得TAT-Nb6基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-21b中,构建pET-21b-TAT-Nb6重组表达质粒。
该重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导后,获得以包涵体形式表达的TAT-Nb6融合蛋白。
经Ni-NTA亲和层析柱纯化、复性和浓缩得到高纯度的TAT-Nb6,并通过ELISA方法验证了TAT-Nb6与PRRSV Nsp9重组蛋白具有很强的结合力。
然后将TAT-Nb6分别加入到MARC-145细胞和PAMs细胞的培养基中,与细胞进行共孵育,并利用Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测两种细胞内TAT-Nb6的量。
实验结果表明,TAT能够介导纳米抗体Nb6进入两种细胞,并且呈时间和剂量依赖性。
随后对细胞活性进行检测,发现TAT-Nb6浓度≤30μM时对两种细胞均没有细胞毒性。
我们进一步验证了TAT-Nb6在猪体内的穿膜能力,免疫组织化学实验结果表明,TAT-Nb6在所有的收集的组织中都有分布。
本部分研究结果表明,原核表达的TAT-Nb6融合蛋白不仅可以与PRRSV Nsp9重组蛋白发生互作,同时具有进入细胞的能力。
2.TAT-Nb6抗PRRSV的研究本研究通过病毒感染实验来研究TAT-Nb6的抗PRRSV功能。
结果表明,TAT-Nb6可以抑制PRRSV基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）毒株在MARC-145细胞系或原代PAM细胞上的增殖,并且呈剂量依赖性。
同时发现TAT-Nb6对PRRSV的抑制效果在不同毒株间存在差异。
为了初步探索Nb6抗PRRSV的机制,我们利用酵母双杂交技术寻找Nb6与Nsp9的结合区域。
结果表明,Nb6与Nsp9互作位点位于Nsp9羧基端的两个不连续区
域:Nsp9<sub>aa454-551</sub>和Nsp9<sub>aa599-646</sub>。
进一步对Nsp9 <sub>aa 454-646</sub>氨基酸同源性进行分析,结果发现基因1型不同毒株间同源性达到92.2%-100%,2型毒株间达到92.7%-100%,而两种基因型之间同源性只有77.7-81.3%。
综上所述,本研究成功表达了TAT-Nb6融合蛋白,该蛋白能够进入到PRRSV感染的细胞内,并发挥抗病毒作用,具有开发为抗PRRSV新型药物的潜力。
同时对Nb6抗PRRSV的机制进行初步探索,为抗PRRSV 纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。
