酱油中氨基酸态氮含量的测定

实验三酱油中氨基酸态氮的测定一、实验原理氨基酸态氮是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是酱油的营养指标，也是酱油中含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。

氨基酸态氮的测定是通过氨基酸羧基的酸度来测定样品中氨基酸态氮的含量。

而氨基酸含有羧基和氨基，在一般情况下呈中性，故需加入甲醛与氨基结合，固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后进行定量，用酸度计测定终点。

R－CH－COOH ＋HCHO= R－CH－COOHNH2NH－CH2OHR－CH－COOH R－CH－COONa＋NaOH= ＋H2ONH－CH2OH NH－CH2OH二、仪器与试剂1. 仪器酸度计、磁力搅拌器，碱式滴定管、100ml烧杯2. 试剂甲醛溶液（36%）、氢氧化钠标准溶液（0.05mol/L）三、实验步骤1. 准确吸取酱油5.0ml置于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀后吸取20.0ml 置于100ml烧杯中，加水60ml，插入酸度计，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH 标准溶液滴定酸度计指示pH=8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）（按总酸计算公式可以计算出酱油的总酸含量）。

2. 向上述溶液中准确加入甲醛溶液10.0ml，摇匀，继续用0.05mol/LNaOH 标准溶液滴定至pH=9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml），供计算氨基酸态氮含量用。

3. 试剂空白试验：取蒸馏水80ml置于另一200ml洁净烧杯中，先用0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至pH=8.2（此时不计碱消耗量）。

再加入10.0ml甲醛溶液，继续用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定酸度计指示pH=9.2，第二次所用的氢氧化钠标准溶液的体积为测定氨基酸态氮的试剂空白试验。

式中；V——测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0——试剂空白试验中加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；20——样品稀释液取用量，mL；c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；0.014——1.00ml氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当于氮的质量(g)，g/mmol。

实验三酱油中氨基酸态氮的测定前言一、实验原理氨基酸态氮是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是酱油的营养指标，也是酱油中含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。

酱油分为两种：1、酿造酱油（fermented soy sauce）:以大豆和/或脱脂大豆，小麦和麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色香味的液体调味品。

要求其理化指标应符合表1的规定2，配制酱油（blended soy sauce）以酿造酱油为主体，与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品。

要求其理化指标应符合表2的规定体调味品。

蛋白质是一类含氮的高分子化合物，基本组成是氨基酸。

参加蛋白质合成的氨基酸共有二十中其中有9中（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、蛋氨酸和缬氨酸）人体自身不能合成，必须由食物中供给，否则人体就不能维持正常代谢的进行，成为必需氨基酸。

蛋白质是生命的基础，生命现象是通过蛋白质来实现的。

蛋白质是人体组织细胞的重要组成部分，人体重量的18%由蛋白质构成。

食品中的氨基酸组成十分复杂，在一般的常规检查中，多测定食品中氨基酸的总量，即氨基酸态氮的总量，通常采用碱滴定法进行简单测定。

氨基酸态氮的测定是通过氨基酸羧基的酸度来测定样品中氨基酸态氮的含量。

而氨基酸含有羧基和氨基，在一般情况下呈中性，故需加入甲醛与氨基结合，固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后进行定量，用酸度计测定终点。

R－CH－COOH ＋HCHO= R－CH－COOHNH2NH－CH2OHR－CH－COOH R－CH－COONa＋NaOH= ＋H2ONH－CH2OH NH－CH2OH二实验目的1、掌握氨基酸态氮的测定原理，基本过程和操作关键。

2、熟练称重、过滤、定容、滴定等基本操作技术。

3、掌握pHS--25型酸度计的操作方法。

4、掌握数据处理和结果计算技术。

二、仪器与试剂1. 仪器pHS--25型酸度计：包括标准缓冲溶液和KCL饱和溶液；磁力搅拌器；碱式滴定管；20mL移液管；10mL 微量滴定管；100mL容量瓶；200mL烧杯2. 试剂甲醛溶液（36%）、氢氧化钠标准溶液（0.05mol/L）三、实验操作步骤1. 准确吸取酱油5.0ml置于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加水60ml，插入酸度计，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定酸度计指示pH=8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）（按总酸计算公式可以计算出酱油的总酸含量）。

酱油中氨基酸态氮的测定酱油，这个神奇的小瓶子里藏着多少美味的秘密啊！谁能想到，它不仅仅是调味品，更是厨房里的魔法师。

你看看，咱们做菜的时候，酱油简直是必不可少的主角。

无论是煮个面，还是炒个菜，少了它，味道都差了那么一点点。

说到酱油，很多人可能会想到它的颜色、味道，但其实它的成分中，有一样东西特别重要，那就是氨基酸态氮。

嘿，这名字听起来挺高大上的，但其实就是咱们菜里味道的秘密武器！咱们就聊聊这氨基酸态氮是怎么在酱油里“混”出来的。

氨基酸态氮是咱们品尝到的鲜味来源。

没错，就是那种让你一口吃下去就想再来一口的感觉。

你在家里做菜，随便加一点酱油，哇，那滋味瞬间就提升了几个档次。

这背后有着一套复杂的“化学”游戏。

酱油在发酵过程中，蛋白质被分解成氨基酸，氨基酸再进一步转化成氨基酸态氮。

听起来是不是有点复杂？别担心，咱们不是要当科学家，只要知道这个“过程”就好。

说到测定氨基酸态氮，想想吧，就像是做一道数学题，得用对方法，才能算出结果。

一般情况下，实验室里会用一种叫做凯氏定氮法的技术。

这可不是随便搞搞就能成的，得有点专业的设备和技巧。

把酱油样品准备好，别小看这一步，选对酱油可是至关重要的。

要知道，好的酱油能让结果更“准确”。

把样品加入到特定的试剂里，开始加热、反应，这就像是在厨房里做菜，慢慢地，酱油里的氨基酸态氮就被提取出来了。

等到实验进行到一半的时候，眼看着酱油的颜色在变化，心里那个期待啊，简直无法言表。

要是能一眼看出氨基酸态氮的含量，那可真是牛逼了。

不过，实验可没那么简单，咱们还得通过一些检测手段，比如比色法，来判断最终的浓度。

这时候，氨基酸态氮的含量就会通过颜色的变化来体现。

就像在玩儿猜颜色的游戏，越深的颜色，就说明氨基酸态氮越多，味道也就越浓。

说到这里，大家是不是都迫不及待想去实验室一探究竟？没问题，咱们可以在家里自己来个“简易实验”。

找点酱油，加入一些水，简单搅拌，然后用手头的工具，试试能不能观察到颜色的变化。

实验三酱油中氨基酸态氮含量的测定一、实验原理氨基酸态氮是指氨基酸结构中所含的那些氮元素。

氨基酸是构成蛋白质的基本组成部分，其中氮元素主要以氨基酸态形式存在，通常被认为可以反映食品中蛋白质含量及质量。

因此，测定食品中氨基酸态氮含量，可以间接反映该食品的蛋白质含量及质量。

本实验利用梅氏试剂（含有0.1%甲醛和2%亚硫酸钠水溶液）将氨基酸转化为氨后，利用巴林指示剂定量测定氨的含量，从而测定酱油中氨基酸态氮含量。

二、实验操作1、仪器与试剂氨基酸态氮测定仪、巴林指示剂（0.5%硫酸水溶液）、氯仿、醋酸、乙醇、氢氧化钠、梅氏试剂。

2、样品制备取醇提酱油10mL，加氢氧化钠1.0 g溶解，并加入2 mL的氯仿，瓶口用聚四氟乙烯膜封口，用搅拌混合器低速搅拌30min，离心（4000 rpm, 10min），取沉淀，再加2 ml的氯仿，瓶口用聚四氟乙烯膜封口，再次搅拌30 min，离心，取沉淀。

沉淀用甲醇洗涤后挥除甲醇，取干的氨基酸，称重记录净重。

3、氨基酸态氮测定称取试样0.5 g，加入150 mL三角瓶中，加10 mL梅氏试剂和5 mL乙醇。

瓶口用聚四氟乙烯膜封口，用搅拌混合器低速搅拌30min，倒入250 mL锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水并立即气密封口，用水浴恒温30 min，使氨完全释放，冷却至室温。

然后取10 mL溶液，用标准盐酸溶液进行巴林指示剂定量，得到氨的含量。

4、结果计算样品中氨基酸态氮含量 = （巴林指示剂滴定时标准盐酸产生的酸量 - 空白的酸量）×10×10/mg样品，单位为mg/100g。

四、注意事项1、梅氏试剂中含有甲醛，有毒，禁止直接接触，尽量避免吸入散发的气味；2、从样品制备开始到测定完成期间尽可能防止样品污染，避免摄入外源氨基酸；3、使用实验仪器时，应严格按照操作规程操作，保证实验安全；4、实验过程中如有任何异常情况或问题，应及时向实验室管理人员和指导老师报告。

实验九 电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量一、实验原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定终点。

二、仪器与试剂1、仪器 电位滴定仪 磁力搅拌器 烧杯（250mL ） 微量滴定管2、试剂 pH=6.18标准缓冲溶液；20%中性甲醛溶液；0.05mol/L 左右的NaOH 标准溶液三、实验操作方法（1）样品处理先根据实验四测出待测酱油的比重，然后吸取酱油10.00mL 于100mL 容量瓶中,加水定容。

吸取定容液20.00mL 于250mL 烧杯中,加水60mL ，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。

用pH6.18的标准缓冲液校正好仪器，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗的NaOH 溶液体积。

（2）氨基酸的滴定在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00 mL 的中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH 溶液体积V 1。

（3）空白滴定吸取80mL 蒸馏水于250mL 的烧杯中，用NaOH 标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL 中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH 溶液体积V 2。

四、实验计算式中：V 1——酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH 标准溶液的10010020V 014.0C V V %21⨯÷⨯⨯⨯-=酱油）（氨基酸态氮体积mL；V2——空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积mLC ——NaOH标准溶液的浓度mol/LV——吸取的酱油的体积mL0.014——氮的毫摩尔质量g/m mol。

实验九电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量一、实验原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。

二、仪器与试剂1、仪器：电位电动滴定仪烧杯（250mL）20ml移液管2、试剂：pH=6.18标准缓冲溶液，pH=4.00标准缓冲溶液，20%中性甲醛溶液；0.1mol/L左右的NaOH标准溶液三、实验操作方法（1）清洗和润洗管路开机，按“F3”清洗键，用蒸馏水清洗3次滴定管路，随后用滴定剂清洗3次滴定管路，使溶液充满整个滴定管道。

（2）PH标定选择合适的缓冲溶液进行两点标定。

（3）滴定模式选择和参数设置选择预控滴定模式，设置第一滴定终点为PH8.2，第二滴定终点为PH9.2。

（4）酱油中总酸测定吸取酱油稀释液10.00ml（酱油稀释5倍）于250mL烧杯中,加水30mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。

选择预控滴定模式，滴定至PH8.2，记录消耗的NaOH体积V1，计算酱油中总酸含量。

（5）氨基酸的滴定在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH溶液体积V2,计算氨基酸态氮含量。

（6）空白滴定吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，选择空白滴定模式，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积V。

空白结果表示酱油中总酸含量以mol/L表示酱油中氨基酸总量以氨基酸态氮含量表示(g/100g）对比：酱油中氨基酸态氮含量的测定-双指示剂甲醛法实验步骤1、移取1份10ml酱油稀释液分别加入250ml锥形瓶中，加入30ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用NaOH标液滴定至溶液由红色变为琥珀色为终点，记录体积为V1，用于计算酱油中总酸含量。

实验九电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量
一、实验原理
根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。

二、仪器与试剂
1、仪器：电位电动滴定仪烧杯（250mL）20ml移液管
2、试剂：pH=6.18标准缓冲溶液，pH=4.00标准缓冲溶液，20%中性甲醛溶液；0.1mol/L左右的NaOH标准溶液
三、实验操作方法
（1）清洗和润洗管路
开机，按“F3”清洗键，用蒸馏水清洗3次滴定管路，随后用滴定剂清洗3次滴定管路，使溶液充满整个滴定管道。

（2）PH标定
选择合适的缓冲溶液进行两点标定。

（3）滴定模式选择和参数设置
选择预设终点滴定模式，设置第一滴定终点为PH8.2，第一预控点待定。

第二滴定终点为PH9.2，第二预控点待定。

（4）酱油中总酸测定
吸取酱油稀释液10.00ml（酱油稀释5倍）于50mL烧杯中,加水30mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。

选择预控滴定模式，滴定至PH8.2，记录消耗的NaOH体积V1，计算酱油中总酸含量。

（5）氨基酸的滴定
在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH溶液体积V2,计算氨基酸态氮含量。

四、原始数据记录
五、结果表示
酱油中总酸含量以mol/L表示
酱油中氨基酸总量以氨基酸态氮含量表示(g/100g）
六、思考题
自动电位滴定法与手动滴定法有何区别？。

酱油中氨基酸态氮的测定氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮，其含量是酱油产品分级的重要指标。

本实训采纳甲醛值法(依据《GB/T5009.39-2003酱油卫生标准的分析办法》)。

1.目的要求 (1)了解氨基酸和氨基酸态氮的概念。

(2)明确甲醛值法的基本原理与计算办法。

(3)把握甲醛值法测定酱油中氨基酸态氮的操作要领。

(4)能娴熟用法磁力搅拌器、酸度计、微量滴定管等仪器设备。

2.测定原理氨基酸具有酸性的—COOH基和碱性的—NH2基，它们互相作用而使氨基酸成为中性的内盐。

当加入甲醛溶液时，—NH2基与甲醛结合使其碱性消逝。

然后以强碱标准溶液来滴定—COOH基，用酸度计确定尽头，用间接的办法确定氨基酸总量。

3.实训用品 (1)酸度计。

(2)磁力搅拌器。

(3)微量滴定管(10mL)。

(4)溶液(36%)：不含聚合物。

(5)标准溶液(0.0500mol/L)。

4.平安提醒甲醛有毒易挥发，试验时要佩戴口罩，在通风橱中操作，保持试验室通风良好。

5.操作步骤 (1)采样及样品处理①采样：瓶装酱油：随机抽取1瓶。

散装酱油：混匀后抽取约500mL于洁净、干燥的密封容器中。

②试样稀释：吸取5.0mL试样，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀定容待用。

(2)装置预备按要求安装好滴定装置并校正pH计。

(3)测定①试样滴定：吸取20.0mL试样稀释液，置于200mL烧杯中，加水60mL，放入搅拌棒，置于磁力搅拌器上，插入电极，开动磁力搅拌器。

用0.0500mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，登记消耗标准溶液的体积(据此可计算总酸含量)。

再加入10.0mL溶液，混匀，用0.0500mol/L NaOH 标准溶液继续滴定至pH9.2，登记消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

②空白滴定：取80mL水，用0.0500mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混匀，用0.0500mol/L NaOH标准溶液继续滴定至pH9.2，登记消耗标准溶液的体积。

酱油酸度滴定法本法适用于以粮和豆饼、麸皮为原料发酵生产的酱和酱油的测定。

1.原理根据氨基酸的双性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性。

用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计定终点。

—COOH被完全中和时，PH值约为8.5~9.5。

本法准备快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。

2.仪器①酸度计②磁力搅拌器③微量滴定管（10ml）3.试剂①36%甲醛溶液②0.05mol/L氢氧化钠标准溶液，标定后使用。

4.操作步骤①准确吸取5.0mL液体样品，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀。

②吸取20.0mL上述样品稀释于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示为pH=8.2（记下消耗氢氧化钠溶液的体积，可用于计算总酸含量）。

③加入10.0mL甲醛溶液，混匀。

再用0.05mol/LNaOH标准溶液继续滴定至pH=9.2，记录消耗标准溶液的体积（V1）。

取80mL水，在同样条件下做试剂空白试验，记录消耗标准溶液的体积（V0）。

5.计算X=〔（V1—V0）*c*0.014*100〕/〔5*(V/100)〕式中：X——样品中氨基酸态氮的质量分数，%V1——样品稀释夜在加入甲醛后滴定至终点（pH=9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积；V0——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积；V——滴定时吸取样品稀释溶液体积；mL；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L。

5——测定用液体样品毫升数。

6. 说明①加入甲醛后应立即滴定，不宜放置时间过长，以免甲醛聚合，影响测定结果。

②样品中若含有铵盐，由于铵离子也能与甲醛作用，将使测定结果偏高。

③对于浑浊和色深样液可不必经处理而直接测定。

实验九、酱油中氨基酸态氮含量的测定教学目的要求：基本知识点1、掌握氨基酸态氮的测定原理、基本过程和操作关键。

2、熟练称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。

3、掌握pHS—25型酸度计的操作方法4、掌数据处理和结果计算技术。

重点：1、PHS—25型酸度计的操作方法。

2、熟练称量、过滤、定容、滴定等基本操技术难点：氨基酸态氮的测定原理、基本过程和操作关键课时教学方案：复习与提问：1、检查实验准备情况，（1）实验内容；（2）实验仪器与试剂有哪些？（3）氨基酸态氮的测定程序。

2、氨基酸态氮的测定的原理、基本过程和操作关键。

3、pHS—25型酸度计的工作原理和操作方法。

【引入新课】酱油中的氨基酸态氮是氨基酸含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。

酱油分两种：1、酿造酱油（Fermented soy sauce）：以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品。

按GB 18186—2000要求其理化指标应符合表1的规定。

2、配制酱油（Blended soy sauce）以酿造酱油为主体，与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品。

按SB 10336-2000（国家国内贸易局行业标准）要求其理化指标应符合表2的规定。

在所有酱油的卫生指标中，总酸（以乳酸计）含量每100ml中应≦2.5g。

实验八：酱油中氨基酸态氮的测定蛋白质是一类含氮的高分子化合物，基本组成单位是氨基酸。

参加蛋白质合成的氨基酸共有二十多种，其中有9种（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、蛋氨酸和缬氨酸）人体自身不能合成，必须由食物中供给，否则人体就不能维持正常代谢的进行，称为必需氨基酸。

蛋白质是生命的基础，生命现象是通过蛋白质来体现的。

蛋白质是人体组织细胞的重要组成部分，人体重量的18%由蛋白质构成。

食品中的氨基酸组成十分复杂，在一般的常规检验中，多测定食品中氨基酸的总量，即氨基酸态氮的总量，通常采用碱滴定法进行简易测定。