脂肪干细胞分离培养相关资料和仪器

脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。

2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。

3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。

4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。

5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。

6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。

7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。

8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。

9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。

10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。

脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。

取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。

?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。

细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。

2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。

3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。

取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。

镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。

细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。

3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。

由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。

提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。

本文将对这些方法进行介绍和比较。

1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。

接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。

消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。

接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。

最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。

以上提取方法各有优劣。

机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。

为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。

脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。

ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。

大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。

同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。

目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。

为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。

1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。

采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。

采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【摘要】目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性.初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制.方法:剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15％Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养.行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能.通过RT-PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2 (peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和骨桥蛋白mRNA表达情况.结果:通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞.MTT法显示细胞增殖能力强.流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR 低表达.细胞免疫荧光结果与之相符.hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能.在成骨分化过程中同时伴有成脂发生.RT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ-2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ-2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法.获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征.hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用.%Objective:To establish the isolation and culture method of human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADSCs) derived from human adipose in vitro,so as to explore their morphology,identify cell surface markers,observe biological properties,and discuss the possible causes and mechanism ofthe phenomenon of hADSCs' osteogenic differentiation accompanying with synthesis of triglycerides.Methods:Human adipose tissue were obtained from abdominal operation.The hADSCs were isolated from human adipose tissue by 0.15％ collagenase digesting.The cells were applied to do the experiments:MTT method,flowcytometry,immunofluorescence.Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation.The osteogenic and adipogenic related genes:PPARγ-2,osteopontin expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR technique.Results:After isolation and culture,we obtained a large amount of hADSCs,which grew like swirls.MTT revealed high capability for and proliferation.The flow cytometry showed CD29 +,CD31-,CD34-,CD45-,CD73 +,CD105 +,CD166 +,HLA-DR-,which fit the results of immuno fluorescence.Moreover,these cells could be functionally induced into adipocytes and osteoblasts in the presence of appropriate conditioned media.During osteogenic differentiation,we found it accompanying with the synthesis of triglycerides.RT-PCR results proved that during the differention process,osteogenic and adipogenic related genes began to be expressed gradually,which had statistically significant(P ＜0.01).Conclusion:Highly efficient isolation and cultivation methods for hADSCs have been developed.They are a kind of mesenchymal cells with great application prospect,which characterized with adherent growth,high proliferation,stem cell phenotype and multipotent differentiation.During vitro osteogenic differentiation,the triglyceride formation has a certain role in promoting osteogenesis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】6页(P185-190)【关键词】人脂肪间充质干细胞;鉴定;成骨分化;成脂分化【作者】闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【作者单位】江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;镇江市第二人民医院皮肤科,江苏镇江212002;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R329.2对于间充质干细胞的研究，最初的对象是骨髓间充质干细胞，并且已经形成了成熟的分离培养方法［1］。

13BIOTECHWORLD 生物技术世界1 前言间充质干细胞是由一组不同分化潜能的细胞组成的。

MSC存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、皮肤结缔组织、胚胎组织、脐带、脐血及外周血等。

由于MSC具有多向分化潜能,在一定实验条件诱导下可向不同胚层的细胞分化[1]。

2001年,Zuk [2]等从抽脂术废弃的脂肪组织中,分离出脂肪干细胞,并证明这种丰富且能再生的组织可作为未来组织工程的细胞来源。

体外实验显示在特定培养条件下,MSC可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等。

本文通过体外培养的方法从脂肪组织中筛选出ADSCs [3],进一步研究脂肪干细胞体外分离培养的方法,并进行染色和表面抗原鉴定,为ADSCs 相关研究提供参考。

2 材料与方法:2.1 样品来源:人腹部抽脂50ml 2.2 试剂PBS(磷酸盐缓冲液),Hyclone;DMEM/F-12 1:1,Hyclone;0.1% I型胶原酶;Ul troser-G,PALL;L-Glu ,GIBCO;0.25%胰酶,Life;地塞米松, SIGMA;IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤);油红O;异丙醇;75%酒精。

2.3 ADSCs 分离和培养收集脂肪组织后,加入等体积的PBS,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复离心2遍,保留上层脂肪层和下层沉淀细胞。

向含有脂肪层的离心管中加入等体积的0.1%I型胶原酶,37℃,水浴8min,加入等体积PBS 终止消化,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复消化离心3遍,最后弃去上层脂肪层。

将两次收集到的沉淀合并,用PBS洗一次,离心弃上清。

用注射用水裂解红细胞,离心收集沉淀。

取3×106个细胞接种到T175 cm 2 细胞培养瓶中,用含有2% Ul troser-G和1% L-Glu的DMEN/F-12培养,24h,次日收集细胞液,下层贴壁细胞为成纤维细胞,将细胞液重新接种到新的T175 cm 2 细胞培养瓶中,隔三天换液一次,培养期间根据细胞生长情况传代,培养到第14天时收获细胞[4]。

脂肪干细胞原代培养流程
1.将收集到的脂肪组织移入50ml离心管，加入2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗：
清洗完成的指标？
2.1000转/分离心5分钟，是否需要低温？
3.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织，如何操作，为何不吸取
上层黄色组织？
4.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
5.1000转/分离心5分钟
6.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织
7.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
8.……反复重复以上操作3-4次，直至下层液体呈不浑浊，底部无血污（还是弃掉？），
保留上层组织
9.将组织用移液管移入无菌培养皿中，用剪刀将大块组织剪碎，将组织用吸管移入50ml
离心，加入与组织等体积的胶原酶（625U/ml）混匀后放入37℃孵箱，消化2h。

10.消化完将最上层颜色较深的油脂弃掉，注意保留组织，取与消化液等量终止液
（DMEM+10%NBS）终止消化，用弯头吸管吹打混匀数次，过100目筛网，收集滤液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟。

11.弃上清，用培养液（α-MEM+10%NBS）重悬，根据沉淀多少接入培养瓶中（个人估计约
3E6/瓶），每瓶总液量8ml。

12.放入孵箱，24h天镜检，72或96h换液，之后隔天换液，培养12-14d传代。

小鼠脂肪干细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：随着干细胞研究领域的不断深入，小鼠脂肪干细胞作为一种重要的干细胞资源备受关注。

小鼠脂肪干细胞具有较高的分化潜能和增殖能力，可广泛应用于再生医学、组织工程和疾病治疗等领域。

提取小鼠脂肪干细胞是进行相关研究的基础和关键步骤，因此本文将详细介绍小鼠脂肪干细胞的提取方法及其在研究中的应用。

通过深入探讨小鼠脂肪干细胞的重要性和相关提取方法，旨在为读者提供实用的研究参考和启发，促进小鼠脂肪干细胞研究领域的进一步发展。

1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三部分。

在引言部分，将介绍小鼠脂肪干细胞的重要性，并简要阐述文章的结构和目的。

正文部分将详细介绍小鼠脂肪干细胞提取方法，包括提取的步骤、操作注意事项和实验流程。

同时还会探讨小鼠脂肪干细胞在研究中的应用，如在生物医学研究中的作用和潜在应用价值。

在结论部分，将对提取方法的重要性进行总结，并展望小鼠脂肪干细胞研究的未来发展趋势。

最后，对整篇文章进行总结，强调小鼠脂肪干细胞研究的重要性和潜在价值。

1.3 目的小鼠脂肪干细胞作为一种重要的细胞资源，在干细胞研究领域具有广泛的应用价值。

本文旨在探讨小鼠脂肪干细胞的提取方法，为相关研究人员提供可操作的实验指导，推动小鼠脂肪干细胞研究的进展。

同时，通过总结现有提取方法的优缺点，展望未来小鼠脂肪干细胞研究的发展方向，为更深入的研究提供理论基础和实践指导。

通过本文的阐述和分析，旨在促进小鼠脂肪干细胞领域的持续发展，推动干细胞研究的进步。

2.正文2.1 小鼠脂肪干细胞的重要性:小鼠脂肪干细胞是一种来源于小鼠脂肪组织的多能干细胞，具有很高的潜在应用价值。

首先，小鼠脂肪干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化成多种细胞类型，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，这使得它们在再生医学领域具有重要意义。

其次，小鼠脂肪干细胞来源广泛，并且易于提取和培养，这为研究人员提供了便利。

一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。

脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。

本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。

二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。

2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。

2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。

四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。

（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。

（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。

（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。

3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。

（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。

五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。

2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。

干细胞无血清培养基排名最近总是有实验室老板和学生向我咨询到底该买哪一款无血清培养基，什么牌子的无血清培养基比较好，不知道作何选择。

确实是，目前市面上有多款无血清培养基，琳琅满目，有好也有坏，要想使用一款比较好的无血清培养基，对于刚刚使用无血清培养基的老师和同学而言还是比较不容易甄别的。

本人十几年来天天跟干细胞培养打交道，使用过市面上绝大部分无血清干细胞培养基尤其是脂肪干细胞和间充质干细胞的无血清培养基。

每次最开心的就是每当市面上出现一款新的无血清培养基的时候就买回来赶紧试一试效果，呵呵，这也算是一个小小的爱好。

1. MesenCult TM 间充质干细胞无血清培养基非常好用的一款无血清培养基，著名的Stemcell Technology公司的拳头产品。

我个人还是比较有感觉的一款培养基，以前经常用来饲养人的骨髓间充质干细胞，扩增迅速，形态也非常好，脂肪干细胞也用它培养过，效果也还是可以。

脐带来源的间充质干细胞也饲养过，个人感觉一般，主要是扩增不太好，后来就没有再用了。

顺便说一下，买了他家的产品就送一张精美的干细胞相关的大海报和精美宣传册，确实是一家比较用心的公司。

2. Advcell○R间充质干细胞无血清培养基佰通生物(BioWiseTech) 的子牌子，这个牌子在国内主要是给工业客户提供无血清培养基，在实验室可能不如Stemcell Technology和Gibco牌子响亮和普及，但是却是我非常认可的一个牌子，非常有潜力，培养效果超好（呵呵，别喷我，我不是商家，也不是推手，我不给这些公司打广告，好用就好用，不好用就不好用）。

我最初用这个牌子的无血清培养基是因为我采用人的眼袋组织分离脂肪干细胞的时候，使用了其他无血清培养基都没有分离出来，最后无奈在市面上买了一款他家的针对脂肪干细胞的无血清培养基马上用上，结果有很多细胞贴壁，FACS显示CD29，CD44表达高达98%，CD90和CD105表达也在95%左右。

脂肪msc分离
MSC是脂肪组织中一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪MSC分离的步骤如下：
- 获取成人脂肪组织，通常使用手术吸脂的方式获得目标脂肪组织。

- 将使用吸脂手术取得的脂肪组织通过D-Hank’s把麻醉药和血细胞洗涤干净。

- 洗涤后用0.075%的I型胶原酶37摄氏度消化一小时。

- 将未消化组织使用100目筛网过滤掉。

- 室温、1400转/min、离心十分钟，将上清去除。

- 再次使用D-Hank’s重悬洗涤2次（室温、1200转/min、离心七分钟），将胶原酶去除掉。

- 离心收集细胞。

MSC分离的过程需要严格的无菌环境和专业的设备，如果你需要进行MSC分离，建议寻求专业医疗机构或实验室的帮助。

干细胞移植术中的手术器械与设备使用方法介绍干细胞移植术是一项先进的医疗技术，为临床治疗提供了新的可能。

在干细胞移植术中，手术器械与设备的选择和正确的使用方法至关重要。

本文将介绍干细胞移植术中常用的手术器械和设备，并详细描述它们的使用方法。

1. 细胞提取工具干细胞移植术的第一步是从患者体内提取干细胞。

常用的细胞提取工具包括注射器和针头。

在使用注射器和针头时，需要注意消毒和无菌操作，以避免细菌感染和交叉感染的发生。

提取工具需要插入到骨髓或脂肪组织中，确保准确进入目标位置后，逐渐吸取细胞。

2. 分离干细胞设备分离干细胞是干细胞移植术中的关键步骤。

分离干细胞的设备有多种选择，常用的有离心机、流式细胞仪和磁珠分离器。

离心机通过设定适当的离心速度和时间，分离出不同种类的细胞。

流式细胞仪则利用细胞的荧光标记来分离不同种类的细胞。

磁珠分离器则利用磁珠表面的抗体与细胞结合，再通过磁场与其他细胞分离。

3. 细胞培养器在分离干细胞后，需要对其进行培养，以增加细胞数量。

细胞培养器是这一步骤中必不可少的设备。

细胞培养器的使用方法根据具体的型号而有所不同，但一般需要注意以下几点：将培养基加入培养器、适当控制温度和湿度、提供适当的氧气和养分。

另外，还需定期更换培养基、观察细胞的生长情况，并及时调整培养条件以促进细胞生长。

4. 输注器和针头在细胞培养完成后，需要将培养出的干细胞输注到患者体内。

这一步需要使用输注器和针头。

在使用输注器和针头时，需要保证其无菌，并注意避免气泡的产生。

将干细胞注射到患者体内时，需要掌握正确的注射技巧和角度，确保干细胞能够准确地注入目标区域。

5. 监测设备在干细胞移植术中，监测患者的状况至关重要。

监测设备包括血压计、心电图机、呼吸机等。

这些设备需要正确使用并进行定期校准，以确保监测数据的准确性。

干细胞移植术是一项复杂而高风险的手术过程，手术器械和设备的正确使用十分重要。

在实际操作中，医务人员应严格遵守操作规程和无菌操作要求，确保器械和设备的卫生和安全性。

一、脂肪干细胞‎（ASCs）的提取及鉴‎定1、实验技术及‎原理：运用细胞培‎养技术、流式细胞术‎（体外扩增后‎A C Ss的‎表型会发生‎改变，主要体现在‎细胞表面蛋‎白和细胞因‎子表达的变‎化），差异离心术‎（可将基质血‎管细胞沉淀‎与悬浮的成‎熟脂肪细胞‎分离，沉淀中除A‎S Cs，还包括血细‎胞、成纤维细胞‎和内皮细胞‎，基质血管细‎胞沉淀可以‎接种到孰料‎培养瓶中，基质细胞可‎贴壁，造血和其他‎杂质细胞不‎贴壁，在随后的传‎代过程中被‎出去，最终得到的‎ASCs可‎再很长时间‎内保持摸分‎化状态）。

取C57B‎L／6 WT小鼠2‎只，常规麻醉消‎毒，取腹股沟脂‎肪组织剪碎‎至糊状，PBS液冲‎洗去麻药及‎血液，0.075%II型胶原‎酶消化（37℃，30分钟）以去除外基‎质，生理盐水终‎止胶原酶的‎消化，离心（1200g‎,10分钟），去上清液及‎未消化的脂‎肪，10%FBS的D‎M EM重悬‎细胞沉淀，0.16mol‎/L氯化氨溶‎解剩余红细‎胞，离心洗涤，过200目‎铜网，得到单个核‎细胞。

镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在‎培养瓶中，37℃5%CO2孵箱‎培养，24小时后‎第一次换液‎，以后3天换‎液一次，80%融合后0.25% Tryps‎i n,0.02%EDTA消‎化传代。

细胞镜下作‎形态学观察‎及取第三代‎细胞用流式‎细胞仪作细‎胞周期及细‎胞免疫表型‎（C D29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL‎／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原‎酶消化，10%FBS，低糖DME‎M2.3 仪器设备：超净工作台‎、恒温培养箱‎、普通显微镜‎、倒置显微镜‎、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟‎镊）、小烧杯，200目铜‎网过滤器，低糖DME‎M、血球计数板‎、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的‎方法与步骤‎：3.1无菌操作‎的要领和要‎求。