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脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。
2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。
3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。
4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。
5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。
6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。
7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。
8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。
9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。
10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。
人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【摘要】目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性.初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制.方法:剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15％Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养.行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能.通过RT-PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2 (peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和骨桥蛋白mRNA表达情况.结果:通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞.MTT法显示细胞增殖能力强.流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR 低表达.细胞免疫荧光结果与之相符.hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能.在成骨分化过程中同时伴有成脂发生.RT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ-2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ-2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法.获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征.hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用.%Objective:To establish the isolation and culture method of human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADSCs) derived from human adipose in vitro,so as to explore their morphology,identify cell surface markers,observe biological properties,and discuss the possible causes and mechanism ofthe phenomenon of hADSCs' osteogenic differentiation accompanying with synthesis of triglycerides.Methods:Human adipose tissue were obtained from abdominal operation.The hADSCs were isolated from human adipose tissue by 0.15％ collagenase digesting.The cells were applied to do the experiments:MTT method,flowcytometry,immunofluorescence.Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation.The osteogenic and adipogenic related genes:PPARγ-2,osteopontin expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR technique.Results:After isolation and culture,we obtained a large amount of hADSCs,which grew like swirls.MTT revealed high capability for and proliferation.The flow cytometry showed CD29 +,CD31-,CD34-,CD45-,CD73 +,CD105 +,CD166 +,HLA-DR-,which fit the results of immuno fluorescence.Moreover,these cells could be functionally induced into adipocytes and osteoblasts in the presence of appropriate conditioned media.During osteogenic differentiation,we found it accompanying with the synthesis of triglycerides.RT-PCR results proved that during the differention process,osteogenic and adipogenic related genes began to be expressed gradually,which had statistically significant(P ＜0.01).Conclusion:Highly efficient isolation and cultivation methods for hADSCs have been developed.They are a kind of mesenchymal cells with great application prospect,which characterized with adherent growth,high proliferation,stem cell phenotype and multipotent differentiation.During vitro osteogenic differentiation,the triglyceride formation has a certain role in promoting osteogenesis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】6页(P185-190)【关键词】人脂肪间充质干细胞;鉴定;成骨分化;成脂分化【作者】闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【作者单位】江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;镇江市第二人民医院皮肤科,江苏镇江212002;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R329.2对于间充质干细胞的研究，最初的对象是骨髓间充质干细胞，并且已经形成了成熟的分离培养方法［1］。
13BIOTECHWORLD 生物技术世界1 前言间充质干细胞是由一组不同分化潜能的细胞组成的。
MSC存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、皮肤结缔组织、胚胎组织、脐带、脐血及外周血等。
由于MSC具有多向分化潜能,在一定实验条件诱导下可向不同胚层的细胞分化[1]。
2001年,Zuk [2]等从抽脂术废弃的脂肪组织中,分离出脂肪干细胞,并证明这种丰富且能再生的组织可作为未来组织工程的细胞来源。
体外实验显示在特定培养条件下,MSC可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等。
本文通过体外培养的方法从脂肪组织中筛选出ADSCs [3],进一步研究脂肪干细胞体外分离培养的方法,并进行染色和表面抗原鉴定,为ADSCs 相关研究提供参考。
2 材料与方法:2.1 样品来源:人腹部抽脂50ml 2.2 试剂PBS(磷酸盐缓冲液),Hyclone;DMEM/F-12 1:1,Hyclone;0.1% I型胶原酶;Ul troser-G,PALL;L-Glu ,GIBCO;0.25%胰酶,Life;地塞米松, SIGMA;IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤);油红O;异丙醇;75%酒精。
2.3 ADSCs 分离和培养收集脂肪组织后,加入等体积的PBS,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复离心2遍,保留上层脂肪层和下层沉淀细胞。
向含有脂肪层的离心管中加入等体积的0.1%I型胶原酶,37℃,水浴8min,加入等体积PBS 终止消化,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复消化离心3遍,最后弃去上层脂肪层。
将两次收集到的沉淀合并,用PBS洗一次,离心弃上清。
用注射用水裂解红细胞,离心收集沉淀。
取3×106个细胞接种到T175 cm 2 细胞培养瓶中,用含有2% Ul troser-G和1% L-Glu的DMEN/F-12培养,24h,次日收集细胞液,下层贴壁细胞为成纤维细胞,将细胞液重新接种到新的T175 cm 2 细胞培养瓶中,隔三天换液一次,培养期间根据细胞生长情况传代,培养到第14天时收获细胞[4]。
脂肪干细胞原代培养流程
1.将收集到的脂肪组织移入50ml离心管，加入2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗：
清洗完成的指标？
2.1000转/分离心5分钟，是否需要低温？
3.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织，如何操作，为何不吸取
上层黄色组织？
4.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
5.1000转/分离心5分钟
6.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织
7.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
8.……反复重复以上操作3-4次，直至下层液体呈不浑浊，底部无血污（还是弃掉？），
保留上层组织
9.将组织用移液管移入无菌培养皿中，用剪刀将大块组织剪碎，将组织用吸管移入50ml
离心，加入与组织等体积的胶原酶（625U/ml）混匀后放入37℃孵箱，消化2h。
10.消化完将最上层颜色较深的油脂弃掉，注意保留组织，取与消化液等量终止液
（DMEM+10%NBS）终止消化，用弯头吸管吹打混匀数次，过100目筛网，收集滤液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟。
11.弃上清，用培养液（α-MEM+10%NBS）重悬，根据沉淀多少接入培养瓶中（个人估计约
3E6/瓶），每瓶总液量8ml。
12.放入孵箱，24h天镜检，72或96h换液，之后隔天换液，培养12-14d传代。
一、背景知识
临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的重大难题之一。
脂肪组织瓣、胶原注射剂、真皮移植、人工合成材料以及游离脂肪组织移植虽已被广泛应用于临床工作中，但人工合成材料易产生异物排斥反应，而自体组织移植又带来供区的继发畸形，临床最常采用的游离脂肪组织移植也面临着移植物再吸收，纤维组织替代和油脂囊肿形成等问题。
通常移植物体积减少40一60%的现象，究其原因，游离移植后数以万计或十万计脂肪细胞团块无法从受区获得足够的营养供应，导致移植后的脂肪细胞大量坏死。
即使幸运得以存活的脂肪细胞也丧失继续增殖的能力，极易褪化，移植后数月逐渐丧失脂肪细胞特性，逐渐被成纤维细胞所替代。
因此，如何有效保证游离移植物的血液供应，以保持其旺盛增殖状态，维持其脂肪细胞特性，是脂肪组织移植成功的关键。
组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题提供了一条革命性的途径。
它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合，修复较大的组织或器官缺损，重建缺损部位的生理功能。
为最终实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新途径。
继骨髓基质细胞之后，抽脂来源的人脂肪组织干细胞成为当今干细胞研究领域的又一热点。
脂肪组织作为干细胞来源的原因之一是由于从脂肪组织提取干细胞取材容易、量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰老等优点，且可以把抽脂术中过去弃之的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来源，可作为多种组织工程的种子细胞，具有非常重要的科学研究和应用价值。
据报道全球每年约完成一百万个吸脂手术，吸脂术能产生大量的脂肪抽吸物，脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增，对供区的损伤也小，可以反复进行。
抽吸物中包含脂质和液体两部分，脂质的部分包括抽吸的脂肪组织碎片，这些碎片是由于吸脂管的相互运动和真空压力作用使脂肪组织变成了碎片。
液体部分其基本组成包括：(l)麻醉药肿胀液中的生理盐水；(2)外周血液；(3)来源于脂肪组织的细胞和组织碎片。
目前有关脂肪抽吸物的脂质部分已经被证实可以分离出具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化能力的干细胞，而液态部分中有报道也包含类似的干细胞。
我们可以同时富集脂质部分和液体部分来源的干细胞，以增加干细胞的数量，从而提高移植脂肪组织的成活率。
二、脂肪干细胞分离培养
2.1 接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
2.2 分装脂肪组织，将脂肪组织分装到T175 培养瓶中：移液管，去吸头，于脂
肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
2.3 洗涤脂肪组织：向T175培养瓶中加入适量氯化钠注射液，充分洗涤脂肪组
织；
2.4 胶原酶I 消化：加入胶原酶I溶液，封口膜封口，37℃消化，直到看起来较
为平滑。
2.5 分离基质血管组分（SVF）：将消化后的组织分装到50ml的离心管中，室温
离心，得到的沉淀即为SVF。
2.6 净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，除去上层油脂和下层的胶原酶
溶液。
适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温离心。
2.7 红细胞裂解：加入适量红细胞裂解液，裂解沉淀中的红细胞。
再次离心。
2.8 细胞种瓶进行后续培养或者直接输注给病人应用于临床。
每ml抽脂得到的脂肪组织可以分离得到3×105个脂肪干细胞。
培养中细胞
成脂诱导分化所需仪器如下：。
