Preparation of Polyclonal Antibody against Human MxA Protein and Its Specificity to Diversified

实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平【实验材料】⒈实验动物成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

·论著·文章编号:1007-8738(2004)04-0425-04抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备及应用徐　霞,王　慧(广州医学院检验系临床免疫教研室,广东广州510182)收稿日期:2004-01-07;　修回日期:2004-03-18基金项目:广州市教育局重点课题基金资助(N o.01229)作者简介:徐　霞(1962-),女,江苏连云港人,副教授,硕士生导师.T el :(020)81340270;Email :yy 2xuxia @Preparation and application of monclonal antibodies against trypsinogen activation peptideXU Xia ,WANG HuiDepartment of Clinical Immunology ,Faculty of Laboratory Sciences ,G uangzhou Medical C ollege ,G uangzhou 510182,ChinaAbstractAIM :T o prepare monoclonal antibody against trypsinogen activa 2tion peptide (T AP ),and develop an immunoa ssay of T AP for the early diagno sis of acute pancreatitis.METH ODS :Chemically synthe sized T AP wa s conjugated to K LH a s immunogen to im 2munize BA LB/c mice .The spleen cells were fused with Sp2/0cells.Clone s secreting specific monoclonal antibody werescreened by indirect E LISA.A fter cloning ,several hybridoma cell clone s stably producing anti 2T AP monoclonal antibody were obtained.The mAbs were identified and the detection of T AP concentration by competitive E LISA wa s e stablished.RESU LTS :Ten hybridoma cell clone s which could produce monoclonal anti 2bodie s to T AP were obtained.The isotype s of the ten mAbs were all IgM ,except one (Ig G 1).Ascite s titers were between 1∶105to 1∶106.Specificity analysis proved that all the se mAbs react 2ed only with T AP and had no cro ss 2reaction to Bovine serum (BSA ),human albumin ,tryp sina se ,amyla se.Neutralisation te st showed that the se mAbs could be evidently neutralized by T AP.A competitive E LISA for the mea surement of T AP wa s de 2veloped ,with a sensitivity of 0.69μg/L.The average intra 2and inter 2a ssay coefficient of variation (CV )were 9.10%and 10.33%respectively.The median unrinary T AP concentration was 57.35μg/L for acute pancreatitis patients and 9.30μg/L for controls (P <0.01).CONC L USON :The mAbs against T AP were prepared succe ssfully and a competitive E LISA method for detecting T AP concentration wa s e stablished.K eyw ords :acute pancreatitis ;tryp sinogen activation peptide ;mAb ;E LISA摘要目的:制备抗胰蛋白酶原激活肽(T AP )单克隆抗体(T AP mAb ),并建立敏感、特异的T AP 免疫检测方法。

绵羊重组朊蛋白特异性抗体的制备1余琦，周向梅，李丽好，任伟，赵德明中国农业大学动物医学院，国家动物海绵状脑病实验室，北京 (100094)E-mail: zhaodm@摘 要：以复性绵羊重组朊蛋白为抗原，采用三种不同的免疫途径，分别为颈背部多点免疫、先颈背部多点再腹腔免疫、直接腹腔免疫来制备朊蛋白特异性抗体，并建立ELISA和Western Blot方法检测所制备抗体血清的免疫反应性。

ELISA检测免疫后血清抗体效价表明，后两种免疫途径都是很好的选择。

Western blot 结果显示抗血清可与绵羊重组朊蛋白结合，也可与牛和小鼠脑组织内源性PrP反应。

结果表明：利用绵羊重组朊蛋白，采用颈背部多点再腹腔注射，或是直接腹腔注射，可有效地剌激小鼠产生PrP特异性抗体，所制备的抗血清可用于朊病的检测。

关键词：朊蛋白；抗体；ELISA；Western-blot 中图分类号：S852.651. 引言传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy ，TSE ）是一类累及人和动物的中枢神经系统的退行性、致死性疾病[1]，其病因目前认为是神经细胞表面的一种正常朊蛋白PrP C 构象发生改变形成异常朊蛋白PrP Sc 所致。

人类TSE 包括克雅氏病（CJD ）和新型克雅氏病（vCJD ）、Kuru 病等。

动物TSE 主要有牛海绵样脑病（BSE ）、羊瘙痒病等。

目前该病的诊断主要依赖免疫学诊断技术来检测神经组织中的PrP Sc ，如PrP 的免疫组织化学（IHC ）[2]、免疫转印技术（WB ）[3]和酶联免疫吸附测定（ELISA ）[4]，抗PrP 特异性抗体已经成为绝大多数PrP Sc 免疫学检测的重要试剂，也是研究PrP C 生理功能和特点的有力工具。

制备特异性、灵敏度高的PrP 抗体，并在此基础上建立准确、灵敏、简便、快速检测PrP Sc 的方法一直是研究的热点。

畜牧兽医学报 2023,54(6):2436-2447A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.022开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用焦正兴1,潘阳阳1,2,王 萌1,2,王靖雷1,马文斌1,高 翔1,张 晖1,崔 燕1,2,余四九1,2,王立斌1,2*(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070)摘 要:旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B (m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B ,L C 3B )基因,制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础㊂本研究通过基因克隆方法获得牦牛L C 3B 基因序列,利用原核表达㊁亲和层析法纯化牦牛L C 3B 重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,S e p h a r o s e 4B 柱层析法纯化制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(E L I S A )测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(W B )㊁免疫组织化学法(I H C )和免疫荧光技术(I F )检测牦牛生殖器官中L C 3B 蛋白的表达㊂结果显示,本研究成功克隆了牦牛L C 3B 基因(登录号:O P 572227),构建的重组质粒p E T -32a -L C 3B 能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛L C 3B 重组蛋白大小为34k u (含T r x 和H i s 标签),符合预期结果㊂通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛L C 3B 蛋白血清,抗体效价分别为1ʒ640000和1ʒ320000,特异性良好,表明牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备成功㊂纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中L C 3B 的表达检测,L C 3B 在牦牛卵巢㊁输卵管和子宫中表达,并且能识别L C 3B -Ⅰ和发生脂化后的L C 3B -Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周㊂本研究通过成功克隆牦牛L C 3B 基因制备了牦牛L C 3B 多克隆抗体,使用抗体检测发现L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛L C 3B 蛋白的检测和细胞自噬水平的研究㊂关键词:牦牛;L C 3B ;原核表达;多克隆抗体;生殖中图分类号:S 823.85 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2436-12收稿日期:2022-10-26基金项目:国家自然科学基金(32160850);甘肃省自然科学基金(22J R 5R A 864);甘肃省重点人才项目(2022-0623-R C C -0307)作者简介:焦正兴(1998-),男,甘肃永靖人,硕士生,主要从事动物生殖生理学研究,E -m a i l :1264847838@q q .c o m *通信作者:王立斌,主要从事动物生殖生理学和胚胎工程研究,E -m a i l :w a n gl b @g s a u .e d u .c n P r e p a r a t i o n o f P o l y c l o n a l A n t i b o d y a g a i n s t Y a k L C 3B P r o t e i n a n d I t s A p pl i c a t i o n i n D e t e c t i o n o f E x p r e s s i o n i n R e p r o d u c t i v e O r ga n s J I A O Z h e n g x i n g 1,P A N Y a n g y a n g 1,2,WA N G M e n g 1,2,WA N G J i n gl e i 1,MA W e n b i n 1,G A O X i a n g 1,Z H A N G H u i 1,C U I Y a n 1,2,Y U S i ji u 1,2,WA N G L i b i n 1,2*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,G a n s u A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.T e c h n o l o g y a n d R e s e a r c h C e n t e r o f G a n s u P r o v i n c e f o r E m b r y o n i c E n g i n e e r i n g o fB o v i n e a n d S h e e p ,L a n z h o u 730070,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c l o n e t h e m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B (L C 3B )g e n e o f y a k a n d p r e p a r e t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C 3B ,s o a s t o l a y af o u n d a t i o n f o r e x p l o r i ng th e r o l e o f a u t o p h a g yi n t h e r e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g y of y a k .T h e s e q u e n c e o f y a k L C 3Bg e n e w a s o b t a i n e d b y g e n e c l o n i n g .Th e r e c o m bi n a n t p r o t e i n o f ya k L C 3B6期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用w a s p u r i f i e d b y p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y.T h e p u r i f i e d p r o t e i n w a s u s e d a s a n t i g e n t o i mm u n i z e10-m o n t h-o l d J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s.T h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t L C3B w a s p u r i f i e d a n d p r e p a r e d b y S e p h a r o s e4B c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y,a n d t h e a n t i b o d y t i t e r w a s d e t e r m i n e d b y e n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A).W e s t e r n b l o t(W B),i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y(I H C)a n d i mm u n o f l u o r e s c e n c e(I F)w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r g a n s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e y a k L C3B g e n e(a c c e s s i o n n u m b e r:O P572227)w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d.T h e c o n s t r u c t e d r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-32a-L C3B i n d u c e d t h e p r o d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n a n d e x p r e s s e d i n i n c l u s i o n b o d i e s a n d s u p e r n a t a n t.T h e s i z e o f p u r i f i e d y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s34k u(c o n t a i n i n g T r x a n d H i s t a g s).T h e r a b b i t a n t i-y a k L C3B p r o t e i n s e r u m o b t a i n e d b y i mm u n i z i n g J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s h a d a n t i b o d y t i t e r s o f1ʒ640000a n d1ʒ320000,r e s p e c t i v e l y,w i t h g o o d s p e c i f i c i t y,w h i c h s h o w e d t h a t t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C3B p r o t e i n w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d.T h e p u r i f i e d a n t i b o d y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s o f y a k s.I t s h o w e d t h a t L C3B w a s e x p r e s s e d i n t h e o v a r i e s,o v i d u c t s a n d u t e r u s o f t h e y a k,a n d r e c o g n i z e d L C3B-Ⅰa n d L C3B-Ⅱa f t e r l i p i d a t i o n,i t w a s l o c a t e d m a i n l y i n t h e c y t o p l a s m a n d p e r i n u c l e a r.I n c o n c l u s i o n,L C3B p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d s u c c e s s f u l l y b y c l o n i n g L C3B g e n e i n t h i s s t u d y,a n d t h e e x p r e s s i o n o f L C3B p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s.I t i s s t a t e d t h a t t h e a n t i b o d y p r e p a r e d h a s g o o d s p e c i f i c i t y a n d i t c a n b e a p p l i e d t o d e t e c t L C3B p r o t e i n i n y a k s a n d f u r t h e r s t u d y o n t h e l e v e l s o f a u t o p h a g y.K e y w o r d s:y a k;L C3B;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d y;r e p r o d u c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G L i b i n,E-m a i l:w a n g l b@g s a u.e d u.c n自噬(a u t o p h a g y)是一种细胞内成分自我清除和自我更新的过程㊂根据底物识别和作用方式不同分为分子伴侣介导的自噬(c h a p e r o n e-m e d i a t e d a u t o p h a g y,C MA)㊁微自噬(m i c r o a u t o p h a g y)和巨自噬(m a c r o a u t o p h a g y)㊂自噬发生时,细胞内衰老或损伤的成分被具有双层膜结构的自噬体包裹,进而与溶酶体结合并降解,完成细胞内的自我清除和自我更新[1]㊂微管相关蛋白1轻链3(m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n1l i g h t c h a i n3,L C3)蛋白是自噬发生过程中表达的重要蛋白之一,在胞浆内以L C3-Ⅰ的形式存在,自噬发生时L C3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成L C3-Ⅱ并定位于自噬体膜上㊂当自噬体与溶酶体结合时,自噬体内膜上的L C3-Ⅱ蛋白被降解,外膜上的L C3-Ⅱ蛋白被切割修饰后变为L C3-Ⅰ蛋白[2]㊂L C3蛋白分为A㊁B㊁C三种亚型[3],其中L C3B在自噬过程中发挥双重作用,既作为吞噬细胞形成的重要细胞因子,又作为快速m R N A降解的R N A结合蛋白[4]㊂L C3B蛋白作为自噬体膜上的标记蛋白,与自噬体的发育和成熟有关,常用来监测自噬水平[5]㊂在哺乳动物的繁殖过程中自噬参与配子的分化㊁生成及早期胚胎发育[6-9]㊂在雄性动物生殖系统中,支持细胞在生精细胞生成过程中起保护和营养作用[10]㊂据报道,自噬缺陷会影响支持细胞的骨架结构,破坏支持细胞与生精细胞联系,进而抑制精子的生成[11]㊂此外,自噬参与顶体反应,对精卵融合起着重要作用[12]㊂在雌性动物生殖系统中,自噬促进黄体细胞分泌孕酮,维持妊娠[13]㊂在子宫内膜粘连的小鼠中,子宫内膜自噬水平低,并且以子宫内膜纤维化为特征[14]㊂子宫内膜发生自噬,对胚胎植入至关重要,并且在妊娠早期发挥着重要作用[15]㊂有试验证据表明,自噬相关基因A t g16L是小鼠子宫内膜蜕膜化的必需基因[16]㊂研究发现,自噬缺陷型小鼠表现为原发性卵巢功能不全,导致生育力低下[17]㊂通过低氧诱导颗粒细胞发生自噬,可以促进颗粒细胞发生分化和黄体形成[18]㊂颗粒细胞敲除B e c l i n1构建的自噬缺陷型模型中,小鼠分泌孕酮的量显著减少,从而导致流产[13]㊂研究表明,自噬完全缺陷型胚胎停滞在4细胞到8细胞阶段,最终导致胚胎死亡,且自噬缺陷型胚胎蛋白合成率也降低了30%[19]㊂L C3B蛋白作为自噬发生的标识蛋白,在相关研究中被用来检测自噬的发生和评估自7342畜牧兽医学报54卷噬通量㊂牦牛(B o s g r u n n i e n s)是我国青藏高原重要的动物资源,也是牧民经济收入的主要来源之一㊂由于自然条件恶劣,饲养水平低下,牦牛的自然繁殖率较低,如何提高牦牛的繁殖率越来越受到重视㊂目前有关L C3B蛋白在牦牛生殖活动中作用机理的研究较少,且未见商业化的牦牛L C3B蛋白抗体㊂为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中的作用,本研究通过基因克隆㊁原核表达和动物免疫的方法制备牦牛特异性L C3B蛋白多克隆抗体,并应用于牦牛生殖器官中L C3B蛋白表达检测,以期为牦牛体内L C3B蛋白和繁殖过程中自噬的研究提供依据㊂1材料与方法1.1试验动物与样品采集1.1.1试验动物日本大耳白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所,10月龄,室内饲养,饮水充足,健康状况良好㊂1.1.2样品采集本试验中所用牦牛睾丸㊁卵巢㊁子宫㊁输卵管等样品来自于青海省某屠宰场㊂健康成年牦牛经颈动脉放血屠宰后,30m i n内采集组织样,修剪周围结缔组织后用生理盐水冲洗干净,分别储存于液氮和4%多聚甲醛溶液中运回实验室备用㊂牦牛输卵管上皮细胞样品由甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心提供㊂1.2主要仪器与试剂P C R仪购自德国艾本德公司,超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物公司,酶标仪购自美国T h e r m o公司,显微拍照仪购自日本O l y m p u s公司,T a q P C R M a s t e r M i x㊁E v o M-M L V反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司,T r i z o l试剂盒㊁R I P A裂解液㊁通用型D N A纯化回收试剂盒购自北京全式金公司,p M D T M19-T V e c t o r C l o n i n g K i t㊁J M109感受态细胞均购自日本T a K a R a公司, p E T-32a载体质粒购自美国T h e r m o公司,6ˑ蛋白上样缓冲液㊁氨苄青霉素(a m p i c i l l i n,A m p)㊁5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-b r o m o-4-c h l o r o-3-i n-d o l y l-b e t a-D-g a l a c t o p y r a n o s i d e,X-g a l),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷I P T G(i s o p r o p y l-β-D-t h i o g a l-a c t o p y r a n o s i d e,I P T G)均购自北京S o l a r b i o公司, W e s t e r n b l o t所用试剂均购自武汉博士德公司, G o a t A n t i-R a b b i t I g G/H R P a n t i b o d y㊁S P试剂盒及D A B试剂盒购自北京B i o s s公司,P r o t e i n m a r k e r 购自加拿大F e r m e n t a s公司,亲和层析柱料购自美国G E H e a l t h c a r e公司,佐剂购自上海S i g m a A l d r i c h公司,感受态细胞B L21(D E3)㊁P M S F购自北京碧云天公司㊂1.3牦牛L C3B基因克隆1.3.1引物设计参照G e n B a n k公布的牛(B o s t a u r u s)L C3B基因序列(NM_001001169.1),利用P r i m e r5进行引物设计,由上海生工进行引物合成,引物序列为L C3B-F:C A C G A G C C A A C T C G C, L C3B-R:A T C G G T G A T T A G A T G A A C T,产物长度为519b p,退火温度为54ħ,用于克隆牦牛L C3B基因㊂1.3.2总R N A的提取及反转录以体外培养的牦牛输卵管上皮细胞为材料,参照T r i z o l试剂盒说明书提取牦牛输卵管上皮细胞总R N A,并进行反转录合成c D N A,-20ħ保存㊂1.3.3L C3B基因的扩增与克隆以c D N A为模板对L C3B基因进行扩增㊂反应体系为20μL: 2ˑE x p T a q H S P C R M a s t e r M i x10μL,c D N A 2μL,上㊁下游引物各0.5μL,d d H2O7μL;反应条件:95ħ5m i n;95ħ45s,54ħ30s,72ħ2m i n; 4ħ保存㊂反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证㊂将胶回收产物与p M D-19T v e c t o r连接转化入D H5α感受态细胞(E s c h e r i c h i a c o l i)并涂布于L B(L u r i a-B e r t a n i)固体培养基(A m p,X-g a l, I P T G),过夜培养,挑取阳性单克隆菌落接种于L B 液体培养基(A m p)摇菌16h,吸取100μL菌液并送往北京擎科生物科技有限公司测序㊂1.3.4牦牛L C3B基因生物信息学分析用N C B I-B L A S T(h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/ B l a s t.c g i)对牦牛L C3B基因进行同源性比对;利用M E G A7.0绘制进化树;用N C B I在线软件进行开放阅读框分析(h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ o r f f i n d e r);用在线软件预测L C3B蛋白的二级结构(h t t p:b i o i n f.c s.u c l.a c.u k/p s i p r e d)㊁三级结构(h t-t p s:ʊs w i s s m o d e l.E x p a s y.o r g),分析L C3B蛋白的理化性质(h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m),用在线软件分析L C3B蛋白亲疏水性(h t t p s:ʊw e b.e x-p a s y.o r g/p r o t s c a l e),用在线软件T M H MM S e r v e r V2.0预测跨膜结构域(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/ T MHMM-2.0/)和磷酸化位点(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/se r v i c e s/N e t P h o s)㊂83426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用1.4L C3B重组质粒的构建与原核表达测序比对正确的L C3B基因由武汉戴安生物技术有限公司合成,与表达载体p E T-32a(该载体含有T r x和H i s标签蛋白,分子量约为20k u)连接㊂将构建好的阳性质粒转化到B L21(D E3)感受态细胞,接种氨苄抗性L B培养基,过夜;挑选转化平板的4个单克隆,分别接种3m L抗性液体培养基; 37ħ,220r㊃m i n-1培养至O D600n m为0.5~0.6,加入0.5mm o l㊃L-1I P T G20ħ诱导表达3.5h;离心收集菌体,超声破碎,S D S-P A G E检测表达情况㊂1.5L C3B重组蛋白的纯化选择原核表达良好的60μL菌株接种至200m L抗性液体培养基,37ħ,220r㊃m i n-1培养过夜㊂加入新鲜抗性培养基至800m L,培养2h至O D600n m为0.5~0.6㊂加入200μL的1m o l㊃L-1 I P T G37ħ诱导表达3.5h㊂4ħ离心收集菌体(66r㊃s-1,15m i n),弃上清,加入30m L P B S T悬浮菌体,加入终浓度1mm o l㊃L-1P M S F,超声波200W破碎6m i n之后摇床4ħ孵育1h㊂4ħ高速离心(133r㊃s-1,15m i n),取上清,加入400μL于镍柱中,4ħ过夜㊂收集镍柱(33r㊃s-1,5m i n),用20mm o l㊃L-1咪唑洗脱液洗涤磁珠,洗去杂蛋白(1m L,3次)㊂加入300μL300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液与磁珠充分结合1h,离心收集上清㊂再次向磁珠加入300μL的洗脱液,洗脱1h,离心收集上清㊂两次洗脱液合为一管,对P B S缓冲液透析换液㊂进行S D S-P A G E鉴定蛋白质㊂1.6多克隆抗体的制备及效价检测用纯化后的400μg L C3B重组蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1融合乳化,背部多点注射免疫日本大耳白兔,分别在第一次注射后的28㊁42㊁47㊁54d进行4次加强免疫,每次150μg㊂第四次加强免疫10d 后采集兔子血液,置于4ħ冰箱,次日离心收集血清㊂10m L抗血清与S e p h a r o s e4B亲和纯化柱过夜孵育,p H为5.0H C l洗去杂抗体,p H为2.5, 0.15m o l㊃L-1甘氨酸缓冲液洗脱,10ˑP B S缓冲液中和,制备亲和纯化抗体㊂将牦牛重组L C3B蛋白包被液稀释至1μg㊃m L-1作为抗原加至96孔板(100μL㊃孔-1)于4ħ冰箱中过夜,次日弃去孔内液体,洗涤3次,每孔加200μL封闭液,室温静置1h㊂兔抗L C3B蛋白抗体按1ʒ10000稀释后作为一抗,未注射任何免疫原的兔子血清作为阴性对照,H R P 标记的羊抗兔I g G作为二抗,一抗㊁二抗皆于37ħ孵育1h,孵育抗体前后P B S T洗涤5次㊂每孔加50μL显色液,室温显色20m i n后用50μL终止液终止显色㊂以O D450n m阳性血清/O D450n m阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价㊂1.7W e s t e r n b l o t鉴定牦牛L C3B多克隆抗体1.7.1蛋白变性经液氮快速冷冻后的组织样品充分研磨,每100m g组织样加入1m L高效R I P A裂解液和10μL P S M F,冰浴反应3h,4ħ, 1500r㊃m i n-1离心15m i n,取上清液,与6ˑ蛋白上样缓冲液3ʒ1混合,100ħ变性10m i n后冷却至室温,-20ħ保存㊂1.7.2W e s t e r n b l o t检测牦牛L C3B蛋白抗体特异性制备12%的分离胶与5%的浓缩胶,进行S D S-P A G E,电泳后转膜至P V D F上,用5%脱脂奶粉封闭3h㊂弃去封闭液,分别以所得的兔血清和牦牛L C3B抗体为一抗(1ʒ1000),4ħ孵育12h, P B S T清洗5次,10m i n㊃次-1,H R P标记的羊抗兔抗体为二抗(1ʒ7000),室温摇床孵育1h,P B S T清洗4次,10m i n㊃次-1㊂之后在P V D F膜上滴加电化学发光液,使用化学发光仪进行检测㊂1.8L C3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达定位经4%多聚甲醛固定的睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫样品进行脱水后,制作石蜡切片,用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,滴加3%H2O2溶液37ħ作用10m i n,P B S洗涤3次,3m i n㊃次-1,后滴加封闭液,室温封闭15m i n,滴加牦牛L C3B抗体(1ʒ500),阴性对照滴加P B S,4ħ孵育12h㊂P B S洗涤3次(3m i n㊃次-1),滴加二抗,37ħ作用15m i n后P B S 洗涤3次,3m i n㊃次-1,滴加三抗,37ħ作用15m i n,P B S洗涤3次㊂滴加D A B工作液显色,蒸馏水终止,苏木精复染,脱水,透明,树脂封片,观察拍照㊂1.9免疫荧光鉴定0.25%胰酶消化原代输卵管上皮细胞,用P B S 清洗输卵管上皮细胞3次,制成细胞悬液,将4ˑ105个㊃m L-1接种至有盖玻片的六孔板中,温箱培养24h,进行细胞贴壁,取出爬片,用P B S洗涤3次, 3m i n㊃次-1㊂2%多聚甲醛进行固定,洗涤后加入含有0.1%T r i t i o n-X100室温透化20m i n后,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,用牛血清白蛋白(B S A)室温封闭2h,弃去封闭液,加入牦牛L C3B抗体(1ʒ500), 4ħ过夜孵育,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,加入F I T C标记的二抗(1ʒ1000)室温孵育1h,P B S洗涤9342畜牧兽医学报54卷后,用D A P I染色液染核4m i n,用抗荧光淬灭剂封片后,在荧光显微镜下观察并拍照㊂2结果2.1牦牛L C3B基因克隆P C R扩增结果显示,目的条带单一且特异性良好,大小为519b p,与预期产物大小一致(图1A)㊂将纯化后的牦牛L C3B片段连接至P M D-19T载体后挑取单克隆进行菌液P C R验证(图1B),目的条带大小与普通P C R结果一致㊂后使用菌液进行测序,结果进一步提示所得序列为牦牛L C3B序列㊂测序结果已提交至G e n B a n k,登录号为:O P572227㊂A.L C3B基因P C R扩增电泳:M.D N A相对分子质量标准,1~4.牦牛L C3B基因扩增产物㊂B.单克隆菌液P C R扩增电泳:1~6.菌液P C R扩增产物A.L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:M.D N A m a r k e r;1-4.Y a k L C3B g e n e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s.B.S i n g l e c o l o n y P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:1-6.B a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s图1牦牛L C3B基因P C R扩增电泳与菌液P C R扩增电泳F i g.1Y a k L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s a n d b a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s2.2牦牛L C3B基因生物学信息分析2.2.1牦牛L C3B基因开放阅读框分析和进化树构建结果表明牦牛L C3B的开放阅读框全长378b p,总共编码125个氨基酸㊂系统进化树结果显示(图2),牦牛L C3B基因与普通牛(B o s t a u-r u s)㊁野牦牛(B o s m u t u s)㊁印度牛(B o s i n d i c u s)亲缘性最高㊂图2牦牛L C3B基因的系统进化树F i g.2P h y l o g e n e t i c t r e e o f y a k L C3B g e n e2.2.2牦牛L C3B蛋白理化性质分析和高级结构预测牦牛L C3B蛋白分子式为C659H1057N179O189S6,原子总数为2090,理论等电点(P I)为8.71,不稳定指数60.93,是一种不稳定蛋白㊂L C3B蛋白预测分子量大小为14.7k u,共编码19种氨基酸㊂牦牛L C3B基因编码的氨基酸中带正电的氨基酸总数为(A r g+L y s)19个,带负电的氨基酸总数为(A s p+G l u)17个,该蛋白带正电㊂牦牛L C3B基因编码的蛋白中α-螺旋共有37个氨基酸,占总数的29.6%,延伸链结构有22个氨基酸,占17.6%;无规则卷曲结构有66个氨基酸,占52.8%㊂牦牛L C3B蛋白的二级及三级结构结果如图3A㊁3B所示㊂2.2.3牦牛L C3B基因编码蛋白亲疏水性㊁跨膜结04426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用构域和磷酸化位点分析牦牛L C3B蛋白为亲水性蛋白(图3C)㊂疏水性最强的为第79位的苯丙氨酸(P h e),其分值为1.556,亲水性最强的为第12位的苏氨酸(T h r),其分值为-2.867;L C3B蛋白不含跨膜区域,是非跨膜蛋白(图3D)㊂有4个丝氨酸(S e r)㊁3个苏氨酸(T h r)和1个酪氨酸(T y r)的磷酸化位点大于阈值,有成为蛋白质激酶磷酸化位点的可能(图3E)㊂A.牦牛L C3B蛋白二级结构预测;B.牦牛L C3B蛋白的三级结构;C.牦牛L C3B蛋白亲疏水性分析;D.牦牛L C3B蛋白跨膜结构域分析;E.牦牛L C3B蛋白磷酸化位点分析A.S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n o f y a k L C3B p r o t e i n;B.T h e t e r t i a r y s t r u c t u r e p r o t e i n o f y a k L C3B p r o t e i n;C.H y d r o p h o-b i c i t y a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n;D.A n a l y s i s o f t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s o f y a k L C3B p r o t e i n;E.P h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n a l y s i s o f L C3B p r o t e i n i n y a k图3牦牛L C3B蛋白生物学信息分析F i g.3B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n1442畜牧兽医学报54卷2.3重组质粒的构建及重组蛋白表达对重组质粒用B a m HⅠ和P s tⅠ进行双酶切验证,结果显示成功构建了p E T32a-L C3B重组质粒(图4A)㊂诱导蛋白表达结果如图4B所示,上清液和包涵体中都有牦牛L C3B重组蛋白的表达,大小为34k u,其中T r x标签蛋白大小约为20k u ㊂A.重组质粒双酶切验证:M.D N A相对分子质量标准;1.双酶切产物;2.p E T32a-L C3B重组质粒㊂B.重组质粒诱导表达: M.蛋白质量分子标准;1~4.全菌液诱导表达A.D o u b l e e n z y m e d i g e s t i o n v e r i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d:M.5000D N A M a r k e r;1.D o u b l e d i g e s t i o n p r o d u c t;2. p E T32a-L C3B r e c o m b i n a n t p l a s m i d.B.R e c o m b i n a n t p l a s m i d i n d u c e d e x p r e s s i o n:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1-4.W h o l e c e l l i n d u c e d e x p r e s s i o n图4重组质粒双酶切验证与诱导表达F i g.4V e r i f i c a t i o n a n d i n d u c e d e x p r e s s i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d b y d o u b l e d i g e s t i o n2.4牦牛L C3B蛋白的纯化使用亲和层析法纯化牦牛L C3B重组蛋白,咪唑洗脱液洗脱镍柱中的蛋白,S D S-P A G E检测结果显示(图5A),大约在34k u处出现较为单一的条带,表明纯化后的蛋白为牦牛L C3B重组蛋白,与预期结果一致㊂透析牦牛L C3B重组蛋白后经S D S-P A G E分析,获得3m g纯化蛋白(图5B)㊂A.上清诱导纯化蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液一;2.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液二;3.B e a d s样㊂B.透析后蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.B S A上样;2.透析后蛋白A.T h e s u p e r n a t a n t i n d u c e d p u r i f i e d p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t o n e;2.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t t w o;3.B e a d s.B.P o s t-d i a l y s i s p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o-l e c u l a r s t a n d a r d;1.B S A l o a d i n g;2.P r o t e i n a f t e r d i a l y s i s图5牦牛L C3B重组蛋白纯化F i g.5P u r i f i c a t i o n o f y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n24426期焦正兴等:牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用2.5 多克隆抗体的制备及鉴定根据O D 450n m 阳性血清/O D 450n m 阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价,本试验制备的抗体效价为1ʒ640000㊁1ʒ320000(表1,图6A )㊂制备的血清(含T r x 和H i s 标签)能与牦牛L C 3B 蛋白发生特异性反应(图6B ),并且能识别L C 3B -Ⅰ(36k u )和脂化的后的L C 3B -Ⅱ(34k u )蛋白,表明该蛋白多克隆抗体特异性良好,可用于后续试验㊂表1 不同稀释度O D 450n m 值T a b l e 1 O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s 吸光值A b s o r b a n c e10K 20K 40K 80K 160K 320K 640K 1280K 2560K 5120K 10240K 阴性N e g a t i v e 1#兔多抗1#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0450.9860.8600.6720.4980.3610.2230.1450.1030.0700.0690.0582#兔多抗2#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0180.8970.7140.5150.3360.2200.1390.1000.0830.0710.0650.053A.不同稀释度的O D 450n m 值;B .免疫后血清特异性验证:1.卵巢;2.输卵管;3.子宫A.O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s ;B .V e r i f i c a t i o n o f s e r u m s p e c i f i c i t y a f t e r i mm u n i z a t i o n :1.O v a r y ;2.O v i d u c t ;3.U t e r u s图6 多克隆抗体效价及特异性检测F i g .6 P o l y c l o n a l a n t i b o d y t i t e r a n d s p e c i f i c i t y de t e c t i o n 2.6 兔抗牦牛L C 3B 多克隆抗体应用2.6.1 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B 在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中的表达 牦牛L C 3B 纯化抗体能与牦牛蛋白发生特异性反应,并且能够识别L C 3B 蛋白,包括L C 3B -I (16k u )和脂化后的L C 3B -I I (14k u ),与预测的牦牛L C 3B 蛋白大小一致(图7)㊂1.睾丸;2.卵巢;3.输卵管;4.子宫1.T e s t i s ;2.O v a r y;3.O v i d u c t ;4.U t e r u s 图7 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达F i g .7 E x p r e s s i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga n s d e t e c t e db y We s t e r n b l o t 2.6.2 免疫组织化学和免疫荧光染色检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 L C 3B 蛋白在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫均有阳性表达㊂在睾丸中,主要表达于精子细胞(S P )㊁间质细胞(I C )㊁支持细胞(S C );在卵巢中,主要表达于黄体细胞(C L )㊁颗粒层(S G )和卵泡膜(T F );在输卵管中,主要表达于黏膜上皮(E M );在子宫中,主要表达于子宫腺(U G )和子宫内膜(E N )(图8)㊂免疫荧光显示,L C 3B 蛋白主要表达于牦牛输卵管上皮细胞的细胞核周和细胞质中(图9)㊂3 讨 论本试验通过基因克隆,获得了大小为519b p 的牦牛L C 3B 基因,该序列已提交至G e n B a n k ,登录号为:O P 572227㊂对牦牛L C 3B 基因序列在线比对3442畜 牧 兽 医 学 报54卷a ㊁b ㊁c .睾丸;d ㊁e ㊁f .卵巢;g ㊁h ㊁i .输卵管;j ㊁k ㊁l .子宫㊂a ㊁b ㊁d ㊁e ㊁g ㊁h ㊁j ㊁k 为阳性表达;c ㊁i ㊁l 为阴性对照㊂S P .精子细胞;S C .支持细胞;I C .间质细胞;S T.生精小管;S G.颗粒层;T F .卵泡膜;C L .黄体细胞;E M.黏膜上皮;U G.子宫腺;E N.子宫内膜a ,b ,c .T e s t i s ;d ,e ,f .O v a r y ;j ,h ,i .F a l l o p i a n t u b e ;j ,k ,l .U t e r u s .a ,b ,d ,e ,g ,h ,j ,k a r e p o s i t i v e e x p r e s s i o n ;c ,i ,l a r e n e g a t i v e c o n t r o l .S P .S pe r m c e l l s ;S C .S e r t o l i c e l l s ;I C .I n t e r s t i t i a l c e l l s ;S T.S e m i n if e r o u s t u b u l e s ;S G.G r a n u l a r l a y e r ;T F .T h e c a f o l l i c l e ;C L .L u t e a l c e l l ;E M.E p i t h e l i u m m u c o s a e ;U G.U t e r i n eg l a n d s ;E N.E n d o m e t r i u m 图8 L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中的分布F i g .8 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga ns 图9 L C 3B 蛋白在牦牛输卵管上皮细胞中的分布F i g .9 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n o v i d u c t e pi t h e l i a l c e l l s o f y a k 44426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用后发现,与普通牛㊁印度牛㊁野牦牛的L C3B基因序列高度一致,体现了L C3B基因的高度保守性,这与B a e k e n等[20]的研究结果一致㊂在前人的研究中提出,L C3B蛋白可发生脂化,表现为L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ两种形式[21]㊂本研究通过理化性质分析后发现,牦牛L C3B共编码125个氨基酸,牦牛L C3B蛋白是非跨膜性的不稳定蛋白,提示牦牛L C3B蛋白也可发生脂化㊂该蛋白有4个丝氨酸㊁3个苏氨酸和1个酪氨酸成为磷酸化位点的可能㊂N i e t o-T o r r e s等[22]认为,L C3B蛋白发生磷酸化对自噬体与细胞核周围的溶酶体结合有重要意义㊂本试验成功构建了p E T-32a-L C3B重组质粒,经原核诱导表达后进行动物免疫,获得了免疫原性良好的抗牦牛L C3B血清,经纯化后制得了牦牛L C3B多克隆抗体㊂P E T-32a载体广泛应用于自噬相关蛋白表达,是较为稳定的原核表达载体[23-24]㊂但因p E T-32a标签蛋白分子量小,不利于小分子蛋白的诱导表达,因此,添加了T r x和H i s标签,以优化诱导表达条件㊂硫氧还蛋白(T r x)增强蛋白的可溶性表达,减少蛋白的浪费㊂牦牛L C3B重组蛋白的成功制备和高水平的表达是成功制备牦牛L C3B 多克隆抗体的关键㊂对该蛋白进行纯化后,制得牦牛L C3B多克隆抗体效价达到1ʒ320000和1ʒ640000,而余振兴等[25]制备的紫贻贝L C3B抗体效价仅为1ʒ25600,表明本研究所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体具有较高的灵敏性㊂通过W e s t e r n b l o t检测,本试验制备的牦牛L C3B多克隆抗体能正常识别L C3B蛋白,并且能够识别L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ,证明本试验成功制备了特异性较好的牦牛L C3B蛋白抗体㊂将本试验制备的纯化抗体应用于L C3B蛋白的表达定位检测㊂W e s t e r n b l o t结果显示,L C3B在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,并且能够检测到L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ蛋白㊂目前, L C3B-Ⅱ/L C3B-Ⅰ的比值常用来评估自噬[26]㊂因此,本研究结果提示所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体可用于牦牛自噬流的评估㊂免疫组织化学结果显示,L C3B蛋白在牦牛睾丸的精子细胞和支持细胞中表达㊂睾丸支持细胞在生殖细胞的存活和精子的生成中起着重要作用,与性腺的发育也有着紧密的联系[27]㊂Y i n等[28]已证实,自噬可抑制精母细胞凋亡,进而促进精子生成,说明牦牛L C3B蛋白也可能参与精子的生成过程㊂L C3B蛋白在山羊卵巢黄体类固醇生成细胞中表达[29],U l l a h等[30]检测L C3B蛋白表达,发现增强自噬可改变黄体类固醇细胞的亚细胞结构,有助于黄体功能的维持㊂本研究发现,L C3B蛋白在牦牛黄体细胞中表达,提示该蛋白可能参与牦牛孕酮的产生,与牦牛维持妊娠和调节发情和排卵有关㊂研究发现,促卵泡素(F S H)在促进卵泡发育的同时,伴有自噬的发生,在有腔卵泡中检测到L C3蛋白[31]㊂牦牛L C3B蛋白在颗粒细胞和卵泡膜中表达,说明L C3B蛋白参与牦牛卵泡的生长和发育㊂这与Z h e n g等[32]的报道一致㊂输卵管和子宫作为受精㊁早期胚胎的发育和妊娠的场所,在动物繁殖过程中起着重要作用㊂S u等[15]通过检测子宫内膜上L C3蛋白的表达,发现子宫内膜发生的自噬影响胚胎的着床㊂本研究发现,在牦牛输卵管上皮黏膜和子宫内膜中检测到了L C3B蛋白的表达,表明L C3B蛋白在卵子的输送过程㊁胚胎着床和妊娠中发挥着作用㊂总之,本研究所制备的牦牛L C3B多克隆抗体能识别牦牛L C3B蛋白,抗体特异性良好,可用于以牦牛为模型的分子试验;免疫组化和免疫荧光结果显示,L C3B在牦牛生殖器官中的表达部位与其他动物一致,提示L C3B蛋白在牦牛繁殖活动中发挥着重要作用,同时也进一步加深了对自噬在牦牛生殖生理中作用的理解㊂4结论本研究成功克隆了牦牛L C3B基因(G e n B a n k 登录号:O P572227),构建了重组质粒p E T-32a-L C3B,成功制备了特异性良好的牦牛L C3B多克隆抗体,该抗体可特异性识别牦牛L C3B蛋白㊂牦牛L C3B蛋白在睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,且主要表达于细胞核周和细胞质中㊂研究结果提示,所制备的牦牛L C3B抗体可用于以牦牛为模型的分子试验,且发现L C3B蛋白参与牦牛生殖生理过程,为进一步研究牦牛L C3B蛋白和细胞自噬提供了基础资料㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E R E T I C V.A u t o p h a g y i n i n f l a mm a t i o n,i n f e c t i o n,a n d i mm u n o m e t ab o l i s m[J].I m m u n i t y,2021,54(3):437-453.[2] K UMA A,K OMA T S U M,M I Z U S H I MA N.A u t o p h a g y-m o n i t o r i n g a n d a u t o p h a g y-d e f i c i e n t m i c e[J].A u t o p h a g y,2017,13(10):1619-1628.5442畜牧兽医学报54卷[3] MA R U Y AMA T,N O D A N N.A u t o p h a g y-r e g u l a t i n gp r o t e a s e A t g4:s t r u c t u r e,f u n c t i o n,r e g u l a t i o n a n di n h i b i t i o n[J].J A n t i b i o t,2018,71(1):72-78.[4] HWA N G H J,HA H,L E E B S,e t a l.L C3B i s a nR N A-b i n d i n g p r o t e i n t o t r i g g e r r a p i d m R N Ad e g r a d a t i o n d u r i n g a u t o p h a g y[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):1436.[5] Y O S H I I S R,M I Z U S H I MA N.M o n i t o r i n g a n dm e a s u r i n g a u t 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单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物.即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成.因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗.由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体.通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产monoclonal antibody）,简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖.二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

河北医科大学硕士学位论文抗人白细胞介素15单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用姓名：***申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：***2003.3.1抗人白细胞介素１５单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用摘要目的：白细胞介素１５（ＩＬ．１５）是与白细胞介素２（ＩＬ．２）有相似生物学活性，但无序列同源性的新细胞因子，其体内分布远较ＩＬ．２广泛，在免疫调节和免疫应答尤其是在抗肿瘤免疫应答中有重要作用。

对ＩＬ—１５的鉴定和研究均需有抗ＩＬ．１５的抗体。

本研究的目的是用细胞工程的方法制备鼠抗人ＩＬ．１５单克隆抗体（简称单抗），鉴定其生物学和免疫学特性及理化特性，并初步探讨其应用。

方法：自ｒｈＩＬ．１５基因工程菌提取融合蛋白ＧＳＴ－ＩＬ．１５，１２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳鉴定，依据牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的浓度目测选择蛋白量为５０ｕｇ的凝胶条带切下制备免疫原，免疫ＢＡＬＢ／ｅ小鼠５次，第一次与第二次免疫间隔４周，其后每次免疫间隔２周，融合前三天以ｒｈＩＬ．１５包涵体蛋白（ｒｈｌＬ．１５ＩＢＰ）攻击。

取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞株Ｓｐ２／０，用５０％聚乙二醇（ＰＥＧ）融合，ＨＡＴ培养基选择培养出融合细胞。

用ｒｈｌＬ。

１５ＩＢＰ为抗原，间接ＥＬＩＳＡ法，初筛分泌抗ｒｈＩＬ．１５ＩＢＰ抗体的融合细胞，有限稀释法克隆化培养获得稳定分泌抗ｒｈｌＬ．１５ＩＢＰ单抗的阳性杂交瘤细胞株，最后以国际市售有生物学活性的ｒｈｌＬ．１５蛋白为抗原，间接ＥＬＩＳＡ法，鉴定阳性细胞株分泌的单抗对功能性ｒｈＩＬ．１５蛋白的有效性。

以体外连续传３０代、反复冻存复苏５次、液氮中冻存３个月后复苏，测定细胞株分泌单抗的稳定性。

做杂交瘤细胞的染色体计数并与骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０和小鼠骨髓细胞的染色体计数进行比较。

制备腹水型、上清型和无血清型单抗。

用无血清型单抗作间接ＥＬＩＳＡ测定单抗的Ｉｇ类别。

用腹水型单抗做耐热性、耐冻融性实验及ｐＨ值对单抗稳定性影响实验。

耐热性实验分为５６℃３０分钟，３７℃保存１．７天和４。

文章编号:1007-8738(2002)03-238-03抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用张　敏,翁　屹3,杨晓峰,董艳秋,刘　兢(中国科学技术大学生命科学院细胞与分子免疫学实验室,安徽合肥230027)收稿日期:2001-12-03;　修回日期:2002-03-01基金项目:中国科学技术大学生物技术公司提供资助作者简介:张　敏(1967-),女,安徽淮南市人,硕士生.合肥市金寨路96号,Tel.(0551)36062943通迅作者.Email :wengyi @关键词:杂交瘤;单克隆抗体;组织型纤溶酶原激活物(tPA );特性鉴定中图分类号:R730.51 文献标识码:A摘　要:目的　研制抗组织型纤溶酶原激活物(t PA )单克隆抗体(mAb ),鉴定其各种生物学特性。

方法　采用传统的细胞融合、有限稀释法,制备稳定分泌mAb 的细胞株。

采用辛酸、硫酸铵沉淀法,纯化腹水中的mAb ,以SDS -PA GE 鉴定其纯度。

运用EL ISA 和细胞免疫组化染色,鉴定mAb 的各项特性.结果　获得了两株能稳定分泌抗t PAmAb 的细胞株。

用该两株细胞分泌的mAb 能检测出0.4μg/L 重组的t PA 和血清中的t PA 。

结论　成功地研制了两株抗t PA 的mAb ,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。

P rep aration ,ch aractorization and preliminary ap 2plication of monoclonal antibody against tissu e plasminogen activatorZHA N G M i n ,W EN G Yi 3,YA N G Xiao -f eng ,DON G Y an -qi u ,L IU Ji ngLaboratory of Cell and Molecular Immunology ,School of Life Science ,University of Science and Technology of China ,Hefei 230027,Anhui Province ,ChinaK eyw ord :hybridoma ;monoclonal antibody ;tissue plasminogenactivator ;identification Abstract :Aim To establish cell of biological activities strains secreting anti -tissue plasminogen activator ,and identify its re 2lated characteristics ,which we used for preparing ascites.We purified antibody from ascites ,and detected various features of purified antibodies ,so that we could use them for science re 2search and clinical diagnosis.Methods Traditional cell fusion and limited dilution methods were used to prepare hybridoma cell strain stably secreting anti -tissue plasminogen activator mAbs.The mAbs in ascites were purified by caprylic acid -am 2monium sulfate salting out and the purity of the mAbs was iden 2tified by SDS -PA GE.Relative characteristics of the mAbs were analyzed by EL ISA and immunohistochemical staining.R esults Two strains of hybridoma cells secreting anti -tissue plasmino 2gen activator mAbs were obtained.Sensitivity of detecting re 2combinant and serum t PA reached to 0.4μg/L.Conclusion The two strains of hybridoma cells stably secreting anti -t PA mAbs are developed successfully.The results obtained provide a useful reagent for clinical diagnosis and further research. 组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen acti 2vator ,t PA )是胰蛋白酶家族中的一种丝氨酸蛋白酶[1,2]。

14-3-3蛋白zeta亚型多克隆抗体的制备谭振 安徽大学生命科学学院 2002级生物科学指导老师黄蓓教授安徽 合肥 230039【摘要】目的 制备并纯化重组14-3-3蛋白zeta亚型多克隆抗体，对其进行鉴定并检测其效价。

方法以诱导大肠杆菌产生的His-14-3-3zeta亚型蛋白为抗原，免疫家兔。

用Western Blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。

结果 SDS-PAGE检测显示所诱导产生的蛋白为His-14-3-3，用Western Blot 检测显示纯化后的14-3-3zeta亚型蛋白抗体与纯化的His-14-3-3蛋白反应效价为1:50。

结论 已成功地制备出了14-3-3zeta亚型蛋白抗体，为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制奠定了基础。

【关键词】 14-3-3蛋白；zeta亚型；融合蛋白；多克隆抗体；纯化Preparation of Polyclonal AntibodyAgainst Recombinant 14-3-3 Zeta IsoformTan Zhen Grade 02, Bioscience，School of Lifescience of Anhui UniversityTutor: Huang Bei ProfessorAnhui, Hefei, PRC 230039【Abstract】Objective To prepare, purify and identify the polyclonal antibody against recombinant 14-3-3 zeta isoform.and determine its titer and concentration. Methods The rabbits were immunized with prokaryotic expressed His-14-3-3 fusion protein and the collected antiserum was evaluated by Western blot. Results SDS-PAGE revealed that the protein induced was His-14-3-3. Western blot revealed that the reactive titer of the prepared antibody against purified 14-3-3 protein was up to1:50. Conclusions The polyclonal antibody against recombinant 14-3-3 zeta isoform was successfully prepared and it laid a foundation of study on the action mechanism of 14-3-3 protein physiological and pathological states.【Keywords】 14-3-3 protein; zeta isoform; fusion protein; polyclonal; purification14-3-3蛋白是一组高度保守、几乎在所有真核生物细胞都表达的蛋白质家族[1]，根据它在DEAE-纤维素层析中的组分分布数量和在淀粉—凝胶电泳中的迁移位置而命名。

植物病理学词汇1)abacterial 无菌的英[ˌeibækˌtiəriəl] 美[ˌebækˌtɪriəl]2)abiotic 无生命的，非生物的英[ˌeibaiˌɔtik] 美[ˌebaɪˌɑtɪk]3)acidic 酸性的[əˌsɪdɪk]4)acquired resistance 获得抗病性[əˌkwaɪəd] [riˈzistəns]5)acquired susceptibility 获得感病性[səˌseptəˌbɪlɪti:]6)actinomyces 放线菌英[ˌækt i nəuˌmaisi:z] 美[ˌæktənoˌmaɪˌsiz]7)active ingredient 有效成分[inˌɡri:djənt]8)agroecosystem 农业生态系统[,æɡrəu,i:kəu'sistəm]9)agronomic 农艺学的, 农事的[,æɡrəu'nɔmik]10)amino acid 氨基酸英[əˌmi:nəʊ] 美[əˌmino]11)analysis of covariance 协方差分析[ə'næləsis] [kəu'vɛəriəns]12)analysis of variance 方差分析英[ˈveəri:əns] 美[ˈvɛriəns]13)anatomy 剖析, 解剖学[əˌnætəmi:]14)anoxic 厌氧的[æ'nɔksik]15)anthesis 开花期，开花[æn'θi:sis]16)antibiotics 抗生素, 英[ˌæntɪbaɪˌɔtɪks] 美[ˌæntɪbaɪˌɑtɪks]17)antibody 抗体英[ˌæntɪˌbɔdi:, ˌæntaɪ-] 美[ˌæntɪˌbɑdi, ˌæntaɪ-]18)antigen 抗原英[ˌæntɪdʒən] 美[ˌæntɪdʒən]19)antitumor 抗癌的英[ˌæntiˌtjumə] 美[ˌæntɪˌtumɚ, -ˌtju-]20)apoplastic 非原质体的21)ascomycetes 子囊菌[,æskəumai'si:ti:z]22)asexual 无性的[ei'seksjuəl]23)avirulence 无毒性[æ'virjulənt]24)baccine 疫苗25)bacteria 细菌[bæk'tiəriə]26)bactericides 杀细菌剂27)basidiomycetes 担子菌[bə,sidiəumai'si:t]28)biomass 生物数量英[ˌbaiəumæs] 美[ˌbaɪoˌmæs]29)biosynthesis 生物合成[,baiəu:'sinθisis]30)biotroph 活体营养['baiəutrɔf]31)biotype 生物型['baiətaip]32)blast 枯萎病['baiəu,blæst]33)blight 枯萎病，疫病[blait]34)botanical 植物学的[bə'tænikəl]35)causal agents 病原体['kɔ:zəl] ['eidʒənt]36)causal organism 病原生物['ɔ:ɡənizəm]37)chlamydospore 厚垣孢子['klæmidəspɔ:]38)chlorophyll 叶绿素['klɔrəfil]39)chlorothalonil (daconil) 百菌清[,kləurə'θælənil]40)chromosome 染色体['krəuməsəum]41)coevolution 协同进化[,kəui:və'lju:ʃən]42)colonization 移植[,kɔlənai'zeiʃən]43)cultilar 栽培品种44)cytogenetics 细胞遗传学[,saitəudʒi'netiks]45)cytokinetic 细胞动力学的46)cytoplasm 细胞质['saitəuplæzəm]47)deactivation 灭活作用[di:,ækti'veiʃən]48)degradation 退化[,deɡrə'deiʃən]49)derosal 多菌灵50)detection 检定[di'tekʃən]51)detoxification 脱毒[di:,tɔksifi'keiʃən]52)dextrose 葡萄糖['dekstrəus]53)diagnostic 诊断的[,daiəɡ'nɔstik]54)diagnostics 诊断学55)diapause 滞育(昆虫生长的停滞期),间歇期['daiəpɔ:z]56)dicots 双子叶的['daikɔt]57)dicotyledon 双子叶植物[,daikɔti'li:dən]58)disease-resistant cultivar 抗病品种['kʌltivɑ:]59)dormancy 冬眠['dɔ:mənsi]60)dose 剂量61)downy mildews 霜霉['dauni] ['mildju:, -du:]62)economic thresholds 经济阈值['θreʃhəuld]63)ectoparasite 皮外寄生物, 外寄生虫[,ektəu'pærəsait]64)electrophoresis 电泳[,ilektrəfə'ri:sis]65)endoparasitic 内部寄生的['endəu,pærə'sitik]66)enzyme 酶['enzaim]67)epidemiology 流行病学['epi,di:mi'ɔlədʒi]68)epiphytotics 植物流行病的，植物流行病[,epifai'tɔtik]69)evolutionary 进化[,i:və'lu:ʃənəri]70)fatal temperature 致死温度71)fauna 动物群, 动物区系, 动物志['fɔ:nə]72)fermentation 发酵[,fə:men'teiʃən]73)flagellum 鞭毛[flə'dʒeləm]74)fungi 真菌['fʌŋɡai]75)fungicides 杀真菌剂['fʌndʒisaid]76)genera 属['dʒenərə]77)genome 基因组,染色体组['dʒi:nəum]78)genome 基因组79)genomic library 基因组库80)genotype 基因型['dʒi:nəutaip]81)habitat 生境['hæbitæt]82)herbicide 除草剂['hə:bisaid]83)hereditary 遗传的[hi'reditəri]84)heterozygous 杂合的[,hetərəu'zaiɡəs]85)hormone 荷尔蒙,激素['hɔ:məun]86)hybrid 杂交，杂种的['haibrid]87)hydrophilic 亲水的[,haidrəu'filik]88)hydrophobic 疏水的[,haidrəu'fəubik]89)hypersensitive 过敏的[,haipə'sensətiv]90)hypha 菌丝['haifə]91)immunology 免疫学[,imju'nɔlədʒi]92)in vitro 体外['vi:trəu]93)in vivo 体内['vi:vəu]94)inbreeding 近亲交配['in,bri:diŋ]95)induced mutation 诱导突变[mju:'teiʃən]96)inducible 可诱导的，可导致的[in'dju:səbl]97)infection cycle 侵染循环98)infection processs 侵染过程99)infective 可侵染的，有传染性的100)inhibition zone 抑菌圈[,inhi'biʃən]101)inoculate 接种，嫁接[i'nɔkjuleit]102)inoculum 接种体[i'nɔkjuləm]103)inorganic 无机的[inɔ:'ɡænik]104)interferon 干扰素[,intə'fiərɔn]105)invasion 入侵[in'veiʒən]106)invertebrate 无脊椎动物[in'və:tibrət, -breit]107)isotope 同位素['aisəutəup]108)larva 幼虫['lɑ:və]109)lethal dose 致死中量['li:θəl]110)mammalian 哺乳动物[mæ'meiliən]111)matrix 矩阵['meitriks]112)metabolic 代谢作用的, 新陈代谢的113)metabolite 代谢物[,metə'bɔlik,-kəl]114)microbial 微生物的，由细菌引起的[mai'krəubiəl]115)micronutrient 微量营养素[,maikrəu'nju:triənt]116)microscopic 用显微镜可见的[,maikrə'skɔpik]117)mildethane 托布津118)mildew 霉病['mildju:, -du:]119)mitochondria 线粒体[,maitəu'kɔndriə]120)mold 霉，霉菌[məuld]121)molecular 分子的，由分子组成的[məu'lekjulə]122)monoclonal antibody 单克隆抗体[,mɔnə'kləunəl] ['ænti,bɔdi] 123)monocotyledonous 单子叶植物的[,mɔnəu,kɔti'li:dənəs] 124)morphology 形态学[mɔ:'fɔlədʒi]125)morphology 形态学126)mortality 死亡率[mɔ:'tæləti]127)mosaic 花叶[məu'zeiik]128)multinucleate (细胞等)多核的[,mʌlti'nju:kliit]129)mutant 突变异种['mju:tənt]130)mutation 突变[mju:'teiʃən]131)mutualism 互惠共生['mju:tʃuəlizəm, -tju-]132)mycelium 菌丝体(复数mycelia) [mai'si:liəm]133)mycotoxin 真菌毒素[,maikəu'tɔksin]134)necrotic 坏死的[ne'krɔtik]135)nematicide 杀线虫剂['nemətisaid, ni'mætisaid]136)nematode 线虫['nemətəud]137)normal saline 生理盐水['seilain, -li:n]138)oomycetes 卵菌[,əuə'maisi:t]139)oviposition 产卵[,əuvipɔ'ziʃən]140)parasite 寄生虫，食客['pærəsait]141)parasitism 寄生['pærəsaitizəm]142)parthenogenesis 单性生殖, 孤雌生殖['pɑ:θinəu'dʒenisis] 143)passive resistance 被动抗性144)Pasteurization 巴氏灭菌法[,pæstərai'zeiʃən]145)pathogenicity 病原性,致病性[,pæθədʒi'nisiti]146)pathogens 病原体(物) ['pæθədʒəns]147)pathology 病理学[pə'θɔlədʒi]148)penetrate 渗透['penitreit]149)pesticide 杀虫剂['pestisaid]150)pesticide residue 农药残留['rezidju:,-du:]151)phenology 物候学[,fi'nɔlədʒi]152)phenotype 显型['fi:nə,taip]153)photosynthesis 光合作用[,fəutə'sinθəsis]154)phylogeny 系统学，系统发育[fai'lɔdʒəni]155)phytocentric 植物群落156)phytocide 植物杀菌素['faitəsaid]157)phytohormone 植物生长素[,faitə'hɔ:məun]158)phytopathology 植物病理学[,faitəupə'θɔlədʒi]159)phytotoxic 植物性毒素的[,faitə'tɔksik]160)pollination 传粉, 授粉(作用) [pɔli'neiʃn]161)polyclonal antibody 双克隆抗体[,pɔli'kləunəl] ['ænti,bɔdi] 162)polygenic 多基因的[,pɔli'dʒenik]163)polymorphism 多型现象[,pɔli'mɔ:fizm]164)postharvest 收割期后的['pəust'ha:vist]165)potential host 潜伏寄主166)probe 探针[prəub]167)proliferation 增殖[prəu-,lifə'reiʃən]168)propagule 繁殖体['prɔpəɡju:l]169)protist 原生生物['prəutist]170)protoplast 原生质体['prəutəuplæst]171)quarantine 检疫['kwɔrənti:n]172)reciprocal 互惠的[ri'siprəkəl]173)resistance 抗药性[ri'zistəns]174)rodenticide 灭鼠剂[rəu'dentisaid]175)root-knot nematode 根结线虫[nɔt]176)protozoan 原生动物[,prəutəu'zəuən, -ən] 177)secretion 分泌，分泌物(液) [si'kri:ʃən]178)segregate 隔离['seɡriɡit, -ɡeit]179)sensitivity [,sensi'tiviti] 敏感性180)serology 血清学[si'rɔlədʒi, sə-]181)silborne 土传的182)smut 黑粉病[smʌt]183)soilborne 土壤带有的,土壤传播的184)sporangium 孢子囊[spəu'rændʒiəm, spɔ:-] 185)sporosorus 休眠孢子堆186)stochastic 随机的[stɔ'kæstik, stəu-]187)strains 菌株[strein]188)stripe 斑纹，条纹[straip]189)sublethal dose 亚致死中量[,sʌb'li:θəl, 'sʌbli:θəl] 190)sustainable agriculture 可持续农业191)symbiosis 共生关系[,simbi'əusis, -bai-]192)symposia 座谈会, 评论集[sim'pəuziə]193)symptomology 症状学[,simptə'mɔlədʒi] 194)target 靶子，标的195)taxonomy 分类学（法）['tæk'sɔnəmi]196)template 模板['templit]197)therapeutics 治疗学、疗法[,θerə'pju:tiks] 198)threshold 临界值['θreʃhəuld]199)toxicity 毒性的[tɔk'sisəti]200)toxigenic 产毒的[,tɔksi'dʒenik]201)transgenic 转基因的[trænz'dʒenik]202)tumor 瘤['tju:mə]203)ultrastructural 超微的[,ʌltrə'strʌktʃə]204)vaccine 疫苗['væksi:n]205)vector 介体['vektə]206)virion 病毒粒子['vaiəriɔn]207)virological 病毒学的virological208)virulence 毒力，毒性['virjuləns]209)virus 病毒['vaiərəs]210)vivo 活泼的['vi:vəu]211)wilt 萎蔫病212)winter spore 越冬孢子[spɔ:]213)zoospore 游动孢子['zəuəspɔ:]。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２１ꎬ３７(２):４１２￣４１７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ吕㊀炫ꎬ张㊀淼ꎬ胡增金ꎬ等.鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(２):４１２￣４１７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２１.０２.０１８鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定吕㊀炫１ꎬ２ꎬ㊀张㊀淼１ꎬ㊀胡增金１ꎬ㊀李佳明１ꎬ㊀张㊀冲１ꎬ㊀朱英奇１ꎬ㊀魏娟文１ꎬ㊀吴㊀琼１ꎬ㊀张瑞辰１ꎬ㊀夏伦志３ꎬ㊀王桂军１ꎬ２(１.安徽农业大学动物科技学院ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ２.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ３.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所ꎬ安徽合肥２３００３６)收稿日期:２０２０￣０９￣１２基金项目:科技部国家重点研发计划项目(２０１８ＹＦＤ０５００１００㊁２０１６ＹＦＤ０５００８０５)ꎻ安徽省家禽产业技术体系项目(２０１９－２０２０)作者简介:吕㊀炫(１９９６－)ꎬ男ꎬ安徽安庆人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为畜禽传染病防治ꎮ(Ｔｅｌ)１８７８８８４２８２０ꎻ(Ｅ￣ｍａｉｌ)９６１５７９８７９＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:王桂军ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｇｊ＠ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀采用ＲＴ￣ＰＣＲ扩增获得鹅星状病毒(Ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ)的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ꎬ并将其克隆至ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ原核表达载体ꎮ重组表达载体ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７经过测序和双酶切验证正确后ꎬ转化到感受态细胞Ｒｏｓｅｔｔａꎮ挑取阳性克隆子ꎬ利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白ꎬ使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ将定量的重组蛋白免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠ꎮ利用ＥＬＩＳＡ㊁Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＩＦＡ鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体ꎮ结果显示ꎬ鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价大于１ʒ６４０００ꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的特异性ꎬＩＦＡ试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ关键词:㊀鹅星状病毒ꎻ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎻ多克隆抗体中图分类号:㊀Ｓ８５８.３３２.６５＋９.６㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２１)０２￣０４１２￣０６ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｔｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓＬＹＵＸｕａｎ１ꎬ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＭｉａｏ１ꎬ㊀ＨＵＺｅｎｇ￣ｊｉｎ１ꎬ㊀ＬＩＪｉａ￣ｍｉｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＣｈｏｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＵＹｉｎｇ￣ｑｉ１ꎬ㊀ＷＥＩＪｕａｎ￣ｗｅｎ１ꎬ㊀ＷＵＱｉｏｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＲｕｉ￣ｃｈｅｎ１ꎬ㊀ＸＩＡＬｕｎ￣ｚｈｉ３ꎬ㊀ＷＡＮＧＧｕｉ￣ｊｕｎ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｔｈｏ￣ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＡｎｈｕｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｖｐ２７ｇｅｎｅｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐｒｏ￣ｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌＲｏｓｅｔｔａａｆｔｅｒｖｅｒｉｆｉｅｄｔｏｂｅｃｏｒｒｅｃｔｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄꎬａｎｄｔｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｂｙｉｓｏｐｒｏｐｙｌ￣β￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ(ＩＰＴＧ).ＴｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｎｉｃｋｅｌｃｏｌｕｍｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｍｍｕｎｅＢＡＬＢ/ｃｍｉｃｅ.ＴｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＥＬＩＳＡꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄＩＦＡ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｉｔｅｒｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ１ʒ６４０００.Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｐｏｌｙ￣ｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｐｒｏｖｅｄｂｙｔｈｅｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＩＦＡｔｅｓｔｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐ￣２１４ｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｃｏｕｌｄｒｅｃｏｇｎｉｚｅｎａｔｕｒａｌｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓꎻｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ꎻｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ㊀㊀星状病毒(Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ)是一种单股正链无囊膜的ＲＮＡ病毒ꎬ可以感染哺乳动物和禽类ꎮ在哺乳动物中ꎬ星状病毒通常感染人㊁猪[１]㊁狗[２]和牛[３]等ꎬ主要引起胃肠炎和腹泻ꎬ在极个别条件下会引起脑炎[４]ꎮ在禽类动物中ꎬ星状病毒感染主要发生在鸡㊁鸭㊁鹅和火鸡中ꎬ引起鸡肾炎[５]㊁鸭致死性肝炎[６]㊁火鸡肠炎[７]等临床常见疾病ꎮ近年来ꎬ在安徽㊁江苏㊁福建等省份流行一种由鹅星状病毒(Ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｓ)感染引起雏鹅痛风为主要特征的疾病[８]ꎮ鹅星状病毒主要感染２１日龄左右的雏鹅ꎬ死亡率可达３０％ꎬ给养鹅产业带来极大的经济损失ꎮ目前鹅星状病毒的检测主要依赖于ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎬ没有商品化的试剂盒[９]ꎮ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７作为存在于鹅星状病毒表面的衣壳纤突蛋白ꎬ含有中和抗原表位ꎬ介导鹅星状病毒粒子与细胞表面受体结合[１０]ꎮ相关研究结果表明ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７是鹅星状病毒主要的抗原决定蛋白[１１]ꎮ本研究以本实验室分离的鹅星状病毒ＤＹ￣１９株为基础ꎬ构建鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７原核表达载体ꎬ利用ＩＰＴＧ诱导表达和亲和层析柱纯化方法获得衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ免疫小鼠获得多抗血清ꎬ利用制备的多克隆抗体对感染新型鹅星状病毒的鸡肝癌细胞(ＣｈｉｃｋｅｎｌｉｖｅｒｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅꎬＬＭＨ)进行间接免疫荧光(Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙꎬＩＦＡ)检测ꎬ为鹅星状病毒早期检测方法的建立和应用以及后续研究奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料ＤＨ５α和Ｒｏｓｅｔｔａ大肠杆菌感受态细胞采购于通用公司ꎬＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ㊁限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ采购于宝日医生物技术(北京)有限公司ꎬ２ˑｔａｐＰＣＲＭｉｘ㊁质粒小提试剂盒㊁胶回收试剂盒购自天根公司ꎬ胎牛血清(ＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍꎬＦＢＳ)购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎬＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ和４ᶄꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚(４ᶄꎬ６￣ｄｉａｍｉｄｉｎｏ￣２￣ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅꎬＤＡ￣ＰＩ)㊁异硫氰酸荧光素(ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅꎬＦＩＴＣ)标记的羊抗小鼠ＩｇＧ购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司ꎬ异丙基硫代半乳糖苷(Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅꎬＩＰＴＧ)购自ｂｉｏｓｈａｒｐ公司ꎬＤＭＥＭ￣Ｆ１２培养基购自ＨｙＣｌｏｎｅ公司ꎮＬＭＨ细胞系㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体㊁鹅星状病毒ＤＹ￣１９株(ＧｅｎＢａｎｋ:ＭＴ７０８９０２)由本实验室分离和保存ꎮＢＡＬＢ/ｃ小鼠购自安徽医科大学实验动物中心ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７的ＲＴ￣ＰＣＲ扩增㊀根据鹅星状病毒ＤＹ￣１９株全基因序列(ＧｅｎＢａｎｋ:ＭＴ７０８９０２)ꎬ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物ꎬ扩增鹅星状病毒衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ꎬ扩增的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段大小为７２３ｂｐꎮ同时在上㊁下游引物５ᶄ端分别添加ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点ꎮｖｐ２７基因的引物序列如表１所示ꎮ表１㊀ｖｐ２７基因的引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｏｆｖｐ２７ｇｅｎｅ引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀ｖｐ２７￣ＦＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＧｖｐ２７￣ＲＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡ单下划线部分为ＢａｍＨⅠ酶切位点ꎬ双下划线部分为ＨｉｎｄⅢ酶切位点ꎮ１.２.２㊀重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７的构建㊀将胶回收的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７目的片段和ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒利用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶分别进行双酶切ꎮ反应总体系５０μｌꎬ其中１０ˑＫｂｕｆｆｅｒ５μｌꎬＢａｍＨⅠ２μｌꎬＨｉｎｄⅢ２μｌꎬ利用无菌去离子水补足ꎮ于３７ħ水浴锅酶切３ｈꎬ衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒的酶切产物电泳后利用胶回收试剂盒分别进行回收ꎮ将衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒的胶回收产物进行连接ꎬ反应总体系１０μｌ:衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段４μｌꎬｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒胶回收产物１μｌꎬＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ５μｌꎮ于１６ħ条件下连接４ｈꎮ吸取连接产物１０μｌ转化到感受态细胞Ｒｏｓｅｔｔａꎮ利用ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体的氨苄抗性进行筛选ꎮ在氨苄琼脂平板上挑取单个菌落进行ＰＣＲ鉴定ꎮ对于ＰＣＲ鉴定阳性的单个菌落摇菌提取质粒ꎬ利用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶进行双酶切鉴定ꎬ同时将质粒进行测序ꎮ鉴定正确后将重组质粒３１４吕㊀炫等:鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定命名为ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎮ１.２.３㊀重组衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的诱导表达和纯化㊀将鉴定正确的重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７转化到大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａꎬ挑取阳性菌落ꎬ进行ＩＰＴＧ浓度优化(终浓度０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ０ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁２ ０ｍｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１６ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ诱导２４ｈꎮ收集菌体后ꎬ利用超声波细胞粉碎机破碎细菌ꎬ细菌破碎后８０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ分别保存重组星状病毒衣壳纤突蛋白上清液和沉淀ꎮ取星状病毒重组衣壳纤突蛋白质上清液和沉淀分别加入蛋白质上样缓冲液进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎮ１.２.４㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７免疫及多克隆抗体制备㊀按照上述方法大量制备衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ以纯化定量后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为抗原免疫６周龄ＢＡＬＢ/ｃ雌性小鼠ꎮ免疫程序如下:第１次免疫ꎬ１００μｌ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１００μｇ)和１００μｌ的等体积弗氏完全佐剂完全混合后ꎬ皮下注射ꎻ１４ｄ后进行第２次免疫ꎬ１００μｌ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１００μｇ)和１００μｌ的等体积弗氏不完全佐剂完全混合ꎬ皮下注射ꎻ第１次免疫后２８ｄ进行第３次免疫ꎬ免疫方法与第２次免疫相同ꎮ第３次免疫后７ｄꎬ腹腔注射衣壳纤突蛋白ＶＰ２７加强免疫ꎬ１只１００μｇꎮ应用ＥＬＩＳＡ方法测定其效价ꎮ１.２.５㊀ＥＬＩＳＡ检测多克隆抗体的效价㊀用碳酸盐缓冲液包被纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１０μｇ/ｍｌ)ꎬ将包被好的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７加入９６孔板ꎬ１孔１００μｌꎬ４ħ包被过夜ꎮ第２ｄ早晨ꎬ弃掉９６孔板中的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７包被液ꎬ用配制好的ＰＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ在室温条件下ꎬ用５％的脱脂奶粉溶液(５０ｇ/ＬꎬＰＢＳＴ配制)封闭１ｈꎬ甩掉５％脱脂奶粉溶液ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ然后用５％脱脂奶粉溶液稀释免疫小鼠的血清样品(１ʒ５００㊁１ʒ１０００㊁１ʒ２０００㊁１ʒ４０００㊁１ʒ８０００㊁１ʒ１６０００㊁１ʒ３２０００㊁１ʒ６４０００)ꎬ８个稀释度ꎬ每孔１００μｌ稀释好的样品ꎬ对照组为未经免疫的小鼠血清ꎬ于３７ħ培养箱孵育２ｈꎬ甩掉稀释的血清样品ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ然后将羊抗小鼠ＩｇＧ￣ＨＲＰ按照１ʒ２０００进行稀释(稀释液为５％脱脂奶粉溶液)ꎬ每孔加入１００μｌꎬ于３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ甩掉孔内液体ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ在室温条件下每孔加入１００μｌＴＭＢ显色液ꎬ避光反应１５ｍｉｎꎬ最后每孔加入１００μｌ硫酸溶液(２ｍｏｌ/Ｌ)终止反应ꎮ使用酶标仪检测各孔样品吸光值Ａ４５０ꎮ１.２.６㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体㊀将利用ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体和纯化浓缩后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７经ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分离后转到ＰＶＤＦ膜上ꎬ５０ｇ/Ｌ脱脂奶粉溶液(ＰＢＳ配制)３７ħ培养箱封闭１ｈꎬ用配制的ＴＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎬ一抗为１ʒ２００稀释的鼠血清(ＰＢＳ稀释)ꎬ于３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后用配制的ＴＢＳＴ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎻ二抗为１ʒ２０００稀释的带ＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ(ＰＢＳ稀释)ꎬ然后用配制的ＴＢＳＴ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎬ最后用ＤＡＢ试剂盒显色观察ꎮ１.２.７㊀ＩＦＡ鉴定衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体㊀将处理好的ＬＭＨ细胞均匀铺到６孔板ꎬ待其密度达到８０％以上ꎬ３孔接种鹅星状病毒ＤＹ￣１９ꎬ剩余３孔为对照组ꎬ使用ＤＭＥＭ￣Ｆ１２培养基代替鹅星状病毒ꎮ鹅星状病毒感染ＬＭＨ细胞７２ｈ后ꎬ用移液枪弃掉维持液ꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ每孔加入２ｍｌ５％脱脂奶粉溶液(ＰＢＳ配制)封闭液ꎬ３７ħ培养箱封闭１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ一抗为１ʒ２００稀释的制备的抗鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体(ＰＢＳ配制)ꎬ３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎻ二抗为１ʒ１０００稀释的带ＦＩＴＣ标记的羊抗小鼠ＩｇＧꎬ３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ加入１ｍｌ１ʒ１０００稀释的ＤＡＰＩ(ＰＢＳ配制)溶液ꎬ３７ħ培养箱孵育１０ｍｉｎꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ最后加入６００μｌＰＢＳꎬ置于荧光倒置显微镜下进行观察ꎮ２㊀结果２.１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７的ＲＴ￣ＰＣＲ扩增以制备的鹅星状病毒ＤＹ￣１９的ｃＤＮＡ为模板ꎬ进行衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７扩增ꎮ衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７扩增目的条带大小在７２３ｂｐ左右ꎬ与预期结果相符(图１)ꎮ２.２㊀重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７鉴定构建的重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７经ＢａｍＨⅠ和４１４江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第２期Ｍ:ＤＬ２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｐ２７基因ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ＰＣＲ扩增产物电泳图Ｆｉｇ.１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｉａｇｒａｍｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｖｐ２７ｇｅｎｅｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｓｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＨｉｎｄⅢ限制性内切酶双酶切ꎬ得到了７２３ｂｐ的目的基因片段和４.７ｋｂ的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体片段ꎬ与预期大小相符(图２)ꎮＭ:ＤＬ５０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１:ｐＣｏｌｄ￣ＶＰ２７经ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切产物ꎮ图２㊀ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７载体的双酶切鉴定Ｆｉｇ.２㊀ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ｖｅｃｔｏｒ２.３㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的表达㊁鉴定和纯化将转入重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７的表达菌Ｒｏｓｅｔｔａ培养至Ａ６００＝０.６~０ ８ꎬ用４个不同浓度(０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ０ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁２ ０ｍｍｏｌ/Ｌ)的ＩＰＴＧ诱导ꎬ１６ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ诱导表达２４ｈꎮＳＤＳ￣ＰＡＧＥ结果显示ꎬ在相对分子质量约为４３０００处出现特异性条带(图３)ꎬ选择终浓度１ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ进行蛋白质表达ꎮ未经诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７无目的条带ꎮ可溶性分析结果表明衣壳纤突蛋白ＶＰ２７在沉淀和上清液中均可表达ꎮ收集破碎离心后上清液利用亲和层析法纯化衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮＭ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１:０ ５ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ２:１ ０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ３:１ ５ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ４:２ ０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ５:未诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ６:１ ０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄꎻ７:未诱导的ｐＣｏｌｄꎮ图３㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７原核表达Ｆｉｇ.３㊀ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７２.４㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价第４次加强免疫后７ｄꎬ采集并分离小鼠血清ꎬ用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价ꎮ结果表明制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７血清效价大于１ʒ６４０００(图４)ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７经４次免疫小鼠后诱导机体产生了抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７特异性多克隆抗体ꎮａ:１ʒ５００ꎻｂ:１ʒ１０００ꎻｃ:１ʒ２０００ꎻｄ:１ʒ４０００ꎻｅ:１ʒ８０００ꎻｆ:１ʒ１６０００ꎻｇ:１ʒ３２０００ꎻｈ:１ʒ６４０００ꎮ图４㊀ＥＬＩＳＡ方法测定的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体效价Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)２.５㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法鉴定㊀㊀以经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体和纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为抗原ꎬ免疫小鼠后获得的血清为一抗ꎬ二抗为带ＨＲＰ标记的羊抗小鼠５１４吕㊀炫等:鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定ＩｇＧꎮ结果显示ꎬ经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体组无明显条带ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７在相对分子质量４３０００处有一条明显的条带(图５)ꎮ证明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体特异性良好ꎮＭ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１:经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体ꎻ２:纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ图５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体Ｆｉｇ.５㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉ￣ｂｏｄｙｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ２.６㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的ＩＦＡ鉴定将衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体应用于病毒的ＩＦＡ检测ꎬ结果表明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体可以识别天然的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞质中检测到明显的荧光信号ꎬ未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞中未检测到荧光信号(图６)ꎮ表明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体可以应用于病毒的ＩＦＡ检测ꎮ３㊀讨论１９７５年ꎬ星状病毒首次在婴儿粪便中被发现ꎬ因其在透射电子显微镜下具有特征性的五角星结构ꎬ故将其命名为星状病毒[１２]ꎮ随着现代分子生物学和病原检测技术的发展ꎬ越来越多的星状病毒在哺乳动物和鸟类动物中被发现[１３￣１５]ꎮ导致动物腹泻的主要病原体之一就是星状病毒ꎬ同时星状病毒还会感染机体的其他组织脏器ꎬ导致雏鸭致死性肝炎㊁鸡肾炎和哺乳动物脑炎等[１６]ꎮ鹅星状病毒感染雏鹅ꎬ主要引起雏鹅的内脏器官㊁腿部关节乃至腿部肌肉出现尿酸盐沉积ꎬ给养鹅产业造成巨大的经济损失[１７￣１８]ꎮ目前ꎬ鹅星状病毒的检测方法主要是ＲＴ￣ＰＣＲ方法[１９]ꎬ包括鹅星状病毒ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量检测[２０]和鹅星状病毒ＴａｑＭａｎ荧光定量检测[２１]ꎮＲＴ￣Ａ:感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞ꎻＢ:未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞ꎮＦＩＴＣ:异硫氰酸荧光素ꎻＤＡＰＩ:４ᶄꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚ꎻＭｅｒｇｅ:融合ꎮ图６㊀间接免疫荧光细胞化学染色法检测ＬＭＨ细胞ＶＰ２７蛋白表达Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶＰ２７ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬＭＨｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇＰＣＲ方法主要采集发病或者病死雏鹅的部分组织器官ꎬ提取核酸进行检测ꎬ不适合在临床上进行大规模检测ꎮ建立一种基于衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的ＥＬＩＳＡ检测方法ꎬ应用于临床上大规模检测尤为迫切ꎮ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为存在于鹅星状病毒粒子表面的蛋白质ꎮ相关研究结果表明ꎬ鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７是鹅星状病毒的主要抗原决定蛋白ꎬ参加鹅星状病毒粒子与细胞内外受体的结合ꎮ因此ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７可以作为疾病检测和疫苗研制的靶点[２２]ꎮ本研究通过构建ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７原核质粒ꎬ利用大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ表达系统ꎬ优化蛋白质表达条件(ＩＰＴＧ浓度)ꎬ获得高效表达的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ将衣壳纤突蛋白ＶＰ２７纯化定量后与弗氏佐剂混合ꎬ免疫小鼠ꎬ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测证明抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体血清的特异性良好ꎬ与对照组无特异性反应ꎮ同时应用间接ＥＬＩＳＡ方法检测制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体效价大于１ʒ６４０００ꎮ使用感染鹅星状病毒ＤＹ￣１９的ＬＭＨ细胞对多克隆抗体使用ＩＦＡ法进行鉴定ꎬ感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞中有明显的绿色荧光ꎬ而未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞无荧光ꎬ证明制备的抗体特异性非常好ꎬ可以特异性识别天然的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ综上所述ꎬ制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７可以用于临床鹅星状病毒的检测和实验室中鹅星状病毒特性研究以及致病机制研６１４江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第２期究ꎮ参考文献:[１]㊀ＦＡＮＧＱꎬＷＡＮＧＣꎬＬＩＵＨꎬｅｔａｌ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｐｏｒｃｉｎｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｖｉｒｕｓｅｓꎬ２０１９ꎬ１１(１２):１１５６.[２]㊀ＴＡＫＡＮＯＴꎬＴＡＫＡＳＨＩＮＡＭꎬＤＯＫＩＴꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｎｉｎｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎｄｏｇｓｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａｉｎＪａｐａｎ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１５ꎬ１６０(６):１５４９￣１５５３.[３]㊀ＢＯＵＪＯＮＣＬꎬＫＯＣＨＭＣꎬＫＡＵＥＲＲＶꎬｅｔａｌ.Ｎｏｖｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏ￣ｍｙｅｌｉｔｉｓ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎａｍｕｓｋｏｘ(Ｏｖｉｂｏｓｍｏｓｃｈａｔｕｓ):ａｓｕｒｐｒｉｓｅｆｒｏｍｔｈｅａｒｃｈｉｖｅｓ[Ｊ].ＡｃｔａＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａＳｃａｎｄｉｎａｖｉｃａꎬ２０１９ꎬ６１(１):３１.[４]㊀ＫＯＵＫＯＵＧꎬＮＩＥＮＤＯＲＦＳꎬＨＯＲＮＥＩＢꎬｅｔａｌ.Ｈｕｍａｎａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｉｎａｎｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｈｉｌｄ:ａｃａｓｅｒｅｐｏｒｔ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＣａｓｅＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１９ꎬ１３(１):９６０￣９６４.[５]㊀ＩＭＡＤＡＴꎬＹＡＭＡＧＵＣＨＩＳꎬＭＡＳＥＭꎬｅｔａｌ.Ａｖｉａｎｎｅｐｈｒｉｔｉｓｖｉ￣ｒｕｓ(ＡＮＶ)ａｓａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙＡｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡＮＶｃＤＮＡ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ７４(１８):８４８７￣８４９３.[６]㊀ＬＩＵＮꎬＷＡＮＧＦꎬＳＨＩＪꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ３￣ｌｉｋｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１４ꎬ１７０(１/２):３９￣４７.[７]㊀ＪＩＮＤＡＬＮꎬＰＡＴＮＡＹＡＫＤＰꎬＣＨＡＮＤＥＲＹꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃａｐｓｉｄｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｕｒｋｅｙａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ￣２ｆｒｏｍｐｏｕｌｔ￣ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ￣ｓｙｎｄｒｏｍｅ￣ａｆｆｅｃｔｅｄａｎｄａｐｐａｒｅｎｔｌｙｈｅａｌｔｈｙｔｕｒｋｅｙｓ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１５６(６):９６９￣９７７.[８]㊀ＣＨＥＮＱꎬＸＵＸꎬＹＵＺꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌ￣ｙｓｉｓｏｆｅｍｅｒｇｉｎｇａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｉｎｇｆａｔａｌｇｏｕｔｉｎｇｏｓｌｉｎｇｓ[Ｊ].ＴｒａｎｓｂｏｕｎｄａｒｙａｎｄＥｍｅｒｇｉｎｇＤｉｓｅａｓｅｓꎬ２０２０ꎬ６７(２):８６５￣８７６. [９]㊀ＷＡＮＣꎬＣＨＥＮＣꎬＣＨＥＮＧＬꎬｅｔａｌ.Ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｏ￣ｖｅｌｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇａＴａｑＭａｎｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ２０１９ꎬ１３７:１０３７６６.[１０]ＡＧＵＩＬＡＲ￣ＨＥＲＮＡＮＤＥＺＮꎬＬＯＰＥＺＳꎬＡＲＩＡＳＣＦ.Ｍｉｎｉｍａｌｃａｐｓｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｕｍａｎａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ５２１:５８￣６１.[１１]张清水.新发肾致病型鹅星状病毒的分离鉴定及弱毒株选育[Ｄ].北京:中国农业大学ꎬ２０１９.[１２]ＬＯＭＢＡＲＤＩＧＨꎬＲＯＳＥＴＯＡＭꎬＳＴＡＭＢＯＵＬＩＡＮＤꎬｅｔａｌ.Ｌｅｔ￣ｔｅｒ:Ｖｉｒｕｓｏｆｉｎｆａｎｔｉｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎａｒｇｅｎｔｉｎａ[Ｊ].ＴｈｅＬａｎｃｅｔꎬ１９７５ꎬ２(７９４８):１３１１.[１３]ＰＡＮＫＯＶＩＣＳＰꎬＢＯＲＯＳＡꎬＫＩＳＳＴꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｍａｍ￣ｍａｌｉａｎ￣ｌｉｋｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎｂｉｒｄꎬＥｕｒｏｐｅａｎｒｏｌｌｅｒ(Ｃｏｒａｃｉａｓｇａｒｒｕｌｕｓ) [Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎꎬＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０１５ꎬ３４:１１４￣１２１. [１４]ＺＨＡＮＧＨＨꎬＱＩＵＱＧꎬＬＩＵＳＪꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＡｍｕｒｔｉｇｅｒｓｆｒｏｍａｚｏｏｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１６４(１２):３１５１￣３１５５. [１５]章丽娇ꎬ黄欣梅ꎬ刘飞ꎬ等.新型鹅星状病毒ＡＨＱＪ１８株的分离鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１９ꎬ３５(５):１２６２￣１２６４.[１６]ＯＬＯＲＴＥＧＵＩＭＰꎬＲＯＵＨＡＮＩＳꎬＹＯＲＩＰＰꎬｅｔａｌ.Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎ￣ｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉａｒｒｈｅａｉｎ８ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ[Ｊ].Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１４１(１):ｅ２０１７１３２６.[１７]ＷＡＮＧＹꎬＢＡＩＣꎬＺＨＡＮＧＤꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｍｉｃａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｎｏｖｅｌｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｉｎＡｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｅｎ￣ｔｒａｌ￣ＥａｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０２０ꎬ７５６:１４４８９８.[１８]ＺＨＡＮＧＸꎬＲＥＮＤꎬＬＩＴꎬｅｔａｌ.Ａｎｅｍｅｒｇｉｎｇｎｏｖｅｌｇｏｏｓｅａｓｔｒｏ￣ｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｇｏｓｌｉｎｇｇｏｕｔｄｉｓｅａｓｅꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｔꎬ２０１８ꎬ７(１):１￣８.[１９]司振书ꎬ殷国政ꎬ路建彪ꎬ等.Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ双重ＲＴ￣ＰｃＲ检测方法的建立[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(７):３５￣３７. 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多克隆抗体(polyclonal antibody)制备1. 免疫动物：两只新西兰兔2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。

每次免疫100-200μg免疫原。

4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。

抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。

每个区域大约用1/4的免疫原。

这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

6. 第0星期采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清）完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。

第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。

第4星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。

第5星期取检测血清20-30ml取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。

第6星期如果检测阳性第一次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。

第7星期第二次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。

第8星期第三次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。

第9星期末次放血20-30ml,纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。

7. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。

检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止【注意事项】大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。

2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。

文章编号：１００４－２４９０（２０２１）０１－０１０４－０８亚甲基蓝多克隆抗体的制备与鉴定 收稿日期：２０２０－０７－２２基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国水产科学研究院东海水产研究所）项目（２０１５Ｍ０５）；国家农产品质量安全风险评估重大专项（ＧＪＦＰ２０１６００９０１）作者简介：黄宣运（１９８４—），男，助理研究员，研究方向：水产品质量安全与风险评估。

Ｅ ｍａｉｌ：ｈｘｙｓｅｖｅｎ＠１６３．ｃｏｍ通信作者：蔡友琼，研究员。

Ｅ ｍａｉｌ：ｃａｉｙｏｕｑｉｏｎｇ＠１６３．ｃｏｍ黄宣运１，２，３，４，杨光昕１，２，史永富１，２，黄冬梅１，２，叶洪丽１，２，蔡友琼１，２（１．中国水产科学研究院东海水产研究所，上海　２０００９０；２．农业农村部水产品质量安全风险评估实验室（上海），上海　２０００９０；３．上海海洋大学，农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，上海　２０１３０６；４．上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海　２０１３０６）摘　要：为建立检测水产品中亚甲基蓝及其代谢物残留的酶联免疫吸附检测方法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ），以亚甲基蓝代谢物天青Ｃ（ａｚｕｒｅＣ）为亚甲基蓝的半抗原，采用戊二醛法，将ａｚｕｒｅＣ上的氨基与蛋白上的羧基进行偶联，制备免疫原ａｚｕｒｅＣ ＢＳＡ和包被原ａｚｕｒｅＣ ＯＶＡ。

利用紫外扫描（ＵＶ）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ）对免疫原和包被原进行鉴定。

以ａｚｕｒｅＣ ＢＳＡ为免疫原，按０．２ｍｇ·只－１的剂量免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，对获得的多克隆抗体的效价、灵敏度和特异性进行测定。

实验结果表明：制备的人工抗原ａｚｕｒｅＣ ＢＳＡ和ａｚｕｒｅＣ ＯＶＡ偶联成功，偶联比约为３１∶１和５２∶１。

经过ＥＬＩＳＡ测定，多克隆抗体效价均在１６０００以上，其中２号小鼠抗体效价最高，半数抑制浓度（ＩＣ５０）为４３．９ｎｇ·ｍＬ－１，该抗体与亚甲基蓝代谢物天青Ａ、天青Ｂ和天青Ｃ存在交叉反应，交叉反应率分别为１２７．６％、８４．７％和１３８．１％，与其他常见染料不存在交叉反应，说明该抗体特异性良好。